专利名称：一种水稻稻粒黑粉病菌检测方法
技术领域：
本发明属于生物识别和自动检测技术领域，具体涉及一种应用电子鼻技术快速检测水稻、大米、稻壳中水稻稻粒黑粉病菌的方法。
背景技术：
水稻是我国主要粮食作物之一，种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量约占全国粮食总产的1/2。水稻病害的危害一直严重地影响着水稻生产。在现行防治条件下，全国平均每年因各种稻病造成稻谷减产达200万吨，如果不进行防治，减产可达300万吨。 水稻病害种类很多，全世界有近百种，我国有正式记载的达70余种，其中具有经济重要性的有20余种。稻痕病(Rice blast)、水稻纹枯病(Rice sheath blight)、水稻白口十枯病(Rice bacterial leaf blight)、稻细菌性条斑病(Rice bacterial leaf streak)、水稻粒黑粉病(Rice kernel smut)发生面积大,流行性强,危害严重。其中，由水稻稻粒黑粉病菌(Tilletia barclayana)引起的稻粒黑粉病又称墨黑穗病，俗称黑粒谷、乌米谷等，是一种真菌病害。自20世纪70年代中期推广杂交水稻以来，随着杂交水稻制种产量的提高，此病发生更为广泛，其危害程度也越来越大，正逐步上升为水稻上的重要病害之一。无论是在制种还是在水稻生产的大田中，该病都有发生。一般病粒率10% 20%，病重田高达50%以上，严重影响制种的产量和种子品质。水稻稻粒黑粉病菌主要是通过种子上带有的冬孢子进行传播，带病种子是第二年发病的重要侵染源，加强对水稻种子的检验，防止带病稻种调入无病区是预防此病害传播的根本措施。对种子中此病害的检验主要是通过抽样在室内进行显微镜观察，但该方法操作繁琐、在样品较多时需要的检测时间长，精确度不高，而且损害样品。如国家标准GB/T28079-2011《水稻稻粒黑粉病菌检疫鉴定方法》，规定了水稻稻粒黑粉病菌形态学鉴定的方法。但是，对于生产实际来说，急需操作简单、检测时间短、精确度高、不损害样品的检验手段和技术。电子鼻(Electronic nose)是一种能识别简单或复杂气味的电子仪器，由气味取样操作器、气体传感器阵列和信号处理系统三种功能器件组成，可以连续地、实时地监测特定位置的气味状况。阵列中的每个传感器对被测气体都有不同的灵敏度，例如，一号气体可在某个传感器上产生高响应，而对其他传感器则是低响应，同样，二号气体产生高响应的传感器对一号气体则不敏感，即整个传感器阵列对不同气体的响应数据是不同的，正是这种区别，才使系统能根据传感器的响应数据来识别气味。电子鼻的核心器件是气体传感器，气体传感器根据原理的不同，可以分为金属氧化物型、电化学型、导电聚合物型、质量型、光离子化型等很多类型，应用最广泛的是金属氧化物型。电子鼻的应用场合包括环境监测、产品检测、医学诊断、爆炸物检测等。当水稻稻粒受稻粒黑粉病危害后，病稻粒全部或部分被破坏，变成青黑色粉末状物即病原菌的冬孢子。和正常稻粒相比，产生了其它物质，带有特殊气味，这就为利用电子鼻技术来检测水稻中的稻粒黑粉病菌提供了可能。目前，尚未见应用电子鼻技术快速检测水稻稻粒黑粉病菌方法的研究报道。聚类分析(Cluster analysis)是对样品进行分类的一种多元统计分析方法。根据“物以类聚，人以群分”的原则，在没有任何模式可供参考即没有先验知识的情况下，将数据分类到不同的类(或簇)，同一个簇中的对象有很大的相似性，而不同簇间的对象有很大的相异性。聚类分析方法己被成功地应用于生物科学的多个领域，如对动植物分类、基因序列分类、蛋白质性质分类等，出现了大量可用的聚类分析软件，更加方便了其推广和应用。目前，尚未见应用聚类分析方法快速分析水稻稻粒黑粉病菌方法的研究报道。
发明内容
I.发明目的。为了简化对水稻稻粒黑粉病菌检测所需操作，减少检测所需时间，提高检测稻粒黑粉病菌冬孢子数的精确度，并实现对检测水稻稻粒样品无损，本发明提供了一种应用电子鼻技术快速检测水稻、大米、稻壳中水稻稻粒黑粉病菌的方法。2.技术方案。一种水稻稻粒黑粉病菌检测方法，如图I所示，包括如下步骤
步骤I :样品制备，包括标准品和待测品的制备，标准品为不含有稻粒黑粉病菌的水稻稻粒和梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，待测品为待检测是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，称取定量水稻稻粒，加入到容器中，并封口 ；步骤2 :测定方式，应用电子鼻对标准品和待测品进行测定，采用直接顶空吸气法，SP直接将电子鼻的进样针头穿过容器封口，进入到容器中，进样针头位于水稻稻粒上方；
步骤3 :特征提取，提取电子鼻的传感器特征值，获得标准样本和待测样本，标准样本为应用电子鼻对标准品进行测定，所提取电子鼻的传感器特征值，待测样本为应用电子鼻对待测品进行测定，所提取电子鼻的传感器特征值；
步骤4 :分析判断，应用聚类分析方法分析标准样本和待测样本，判断待测样本归属于标准样本中的哪一个，即待测品与标准品中的哪一个相同或最相近似，从而判断待测品是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数。进一步，上述步骤I所述的梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒是指每50克稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为105、104、103、IO2UO1UOci个的水稻稻粒。进一步，上述步骤4所述的应用聚类分析方法，在计算相似性时，采用的指标是欧氏距离(Euclid distance)、马氏距离(Mahalanobis distance)、相关系数(Correlationcoefficient)中的一个或多个,优选方案是三个相结合。3.有益效果。本发明应用电子鼻技术快速检测水稻、大米、稻壳中水稻稻粒黑粉病菌，与现有检测方法相比，本发明具有以下技术优势
(I)操作简单。只需将电子鼻的进样针头穿过容器封口，进入到装有稻粒的容器中，不需要其它复杂操作，如病原菌分离或病原菌DNA提取等。(2)检测时间短。省去了病原菌分离或DNA提取等步骤，单个样本检测所需时间仅为2分钟左右。
(3)成本低。检测过程中不需要其它试剂，不会对待测品产生任何损害，大大节约了检测成本。(4)精确度高。可以检测出每50克水稻稻粒黑粉病菌冬孢子数为10个左右的样
品O可见，本方法实用性强，可满足水稻种子检验的需要，适合在水稻种子检验中大规模推广应用。
图I为方法的步骤流程图。图2为主成分分析法(PCA)分析标准样本结果图，其中，CK代表50克水稻稻粒中 不含稻粒黑粉病菌，1、2、3、4、5、6代表50克水稻稻粒中的稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为Io5UO4UO3UO2UO1UO0 个。图3为线性判别法(LDA)分析标准样本结果图，其中，CK代表50克水稻稻粒中不含稻粒黑粉病菌，1、2、3、4、5、6代表50克水稻稻粒中的稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为105、IO4UO3UO2UOiUO0 个。
具体实施例方式实施例I :
容器使用玻璃三角瓶，封口采用双层保鲜膜封口。(I)样品制备。称取50克水稻稻粒，放入到100毫升的玻璃三角瓶中，利用血球计数板，在显微镜下将水稻稻粒的黑粉病菌冬孢子浓度配成IO8个/毫升。梯度稀释，加入装有水稻稻粒的三角瓶中，使每50克水稻稻粒中的黑粉病菌冬孢子数分别105、104、103、102、101、10°个和清水对照，组成7个标准品，其中I个为不含有稻粒黑粉病菌的水稻稻粒，另6个为梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，分别用双层保鲜膜封口。另外，将待检测是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒加入到100毫升的三角瓶中，组成I个待测品，用双层保鲜膜封口。(2)测定方式。电子鼻测定采用直接顶空吸气法，即直接将电子鼻的进样针头穿过双层保鲜膜，进入到玻璃三角瓶中，进样针头位于水稻稻粒上方；采样时间为I秒/组，传感器自清洗时间为100秒，传感器归零时间为10秒，样品准备时间为3秒，进样流量为300毫升/分，分析米样时间为40秒。(3)特征提取。对7个标准品分别提取10个传感器数值，作为标准样本；对I个待测品提取10个传感器数值，作为待测样本。采用德国AIRSENSE公司生产的PEN3型电子鼻，含有10个不同的金属氧化物传感器。(4)分析判断。应用聚类分析方法分析标准样本和待测样本，在计算相似性时，采用的指标是欧氏距离、马氏距离和相关系数三个相结合，根据欧氏距离和马氏距离较小，相关系数较大且接近于或等于1，判断待测样本归属于标准样本中的哪一个，即待测品与标准品中的哪一个相同或最相近似，从而判断待测样品是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数。应用主成分分析法(PCA)分析标准样本，结果如图2所示，其中，CK代表50克水稻稻粒中不含稻粒黑粉病菌，1、2、3、4、5、6代表50克水稻稻粒中的稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为Io5UO4UO3UO2UO1UOci个。图中CK与1、2、3、4、5、6各自独立、没有重叠，表明不含稻粒黑粉病菌的水稻稻粒(CK)与含稻粒黑粉病菌冬孢子的水稻稻粒(1、2、3、4、5、6)很容易区分开来，同时，稻粒黑粉病菌冬孢子数也有一定的区分能力。应用线性判别法(LDA)分析标准样本，结果如图3所示，其中，CK代表50克水稻稻粒中不含稻粒黑粉病菌，1、2、3、4、5、6代表50克水稻稻粒中的稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为Io5UO4UO3UO2UO1UOci个。图中CK与1、2、3、4、5、6没有重叠，表明不含稻粒黑粉病菌的水稻稻粒(CK)与含稻粒黑粉病菌冬孢子的水稻稻粒很容易区分开来，但2、3、4、5、6之间有部分重叠，表明对稻粒黑粉病菌冬孢 子数区分能力不及主成分分析法。综合图2和图3的结果，表明所选择的标准品是合理的，应用电子鼻对标准品进行测定，获得标准样本，用于区分标准品中是否含有稻粒黑粉病菌是有效的。上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种水稻稻粒黑粉病菌检测方法，其特征在于包括如下步骤步骤I :样品制备，包括标准品和待测品的制备，标准品为不含有稻粒黑粉病菌的水稻稻粒和梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，待测品为待检测是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，称取定量水稻稻粒，加入到容器中，并封口 ；步骤2 :测定方式，应用电子鼻对标准品和待测品进行测定，采用直接顶空吸气法，SP直接将电子鼻的进样针头穿过容器封口，进入到容器中，进样针头位于水稻稻粒上方； 步骤3 :特征提取，提取电子鼻的传感器特征值，获得标准样本和待测样本，标准样本为应用电子鼻对标准品进行测定，所提取电子鼻的传感器特征值，待测样本为应用电子鼻对待测品进行测定，所提取电子鼻的传感器特征值； 步骤4 :分析判断，应用聚类分析方法分析标准样本和待测样本，判断待测样本归属于标准样本中的哪一类，即待测品与标准品中的哪一个相同或最相近似，从而判断待测品是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤I所述的梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒是指稻粒黑粉病菌冬孢子数分别为个的水稻稻粒。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤I所述的容器为玻璃三角瓶。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤I所述的封口采用双层保鲜膜封口。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤2所述的应用电子鼻对标准品和待测品进行测定，具体条件为采样时间为I秒/组，传感器自清洗时间为100秒，传感器归零时间为10秒，样品准备时间为3秒，进样流量为300毫升/分，分析采样时间为40秒
6.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤3所述的电子鼻采用德国A IRSENSE公司生产的PEN3型电子鼻，含有10个不同的金属氧化物传感器，得到10个传感器特征值。
7.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于上述步骤4所述的应用聚类分析方法，在计算相似性时，采用的指标是欧氏距离、马氏距离、相关系数中的一个或多个，优选方案是三个相结合。
全文摘要
本发明属于生物识别和自动检测技术领域，公开了一种水稻稻粒黑粉病菌检测方法。包括步骤标准品和待测品的制备，标准品为不含有稻粒黑粉病菌的水稻稻粒和梯度稀释的稻粒黑粉病菌冬孢子数的水稻稻粒，待测品为待检测的水稻稻粒；应用电子鼻对标准品和待测品进行测定，采用直接顶空吸气法；提取电子鼻的传感器特征值，获得标准样本和待测样本；应用聚类分析方法分析标准样本和待测样本，判断待测样本归属于标准样本中的哪一类，从而判断待测品是否含有稻粒黑粉病菌以及稻粒黑粉病菌冬孢子数。该方法只需要应用电子鼻进行检测，应用聚类分析方法进行判断，缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了精确度。
文档编号G01N27/00GK102914564SQ20121030705
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者葛龙, 滕诣迪 申请人:南京理工大学常熟研究院有限公司