专利名称：柯萨奇病毒a6型rt-lamp核酸检测引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术应用领域，具体地说涉及柯萨奇病毒A6(Coxsackievirus A6,简称CA6)各种标本(粪便、肛拭,咽拭、疱疫液、脑脊液)核酸检测用引物及试剂盒。
背景技术：
柯萨奇病毒A6为单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科(Picoranviridae) <ΧΑ6可引起手足口病和疱疹性咽峡炎等疾病。虽然通常不认为CA6是手足口病的主要病原，但近年在新加坡、芬兰、台湾和日本等国家和地区都有CA6导致手足口病暴发的报道，而且CA6引起的手足口病与其它型别肠道病毒所引起的更可能引起博氏线(Beau’ s lines)和甲脱 落等症状，其机制尚不清楚，但可能表示CA6较其它型别肠道病毒有更广的细胞感染谱，因此，CA6感染应受到重视。手足口病于2008年5月2日已被纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，经典的检测肠道病毒的方法多为采用细胞分离培养、特异性抗体检测，该方法步骤繁琐，检测周期长，而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖，容易出现漏检；基于CA6核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescentRT-PCR)等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用，但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于现场样品的检测，不利于在基层推广，无法满足简单、快速、准确诊断的要求；而疫情的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此，建立一种快速、准确的新型诊断技术对于疫病的诊断就显得尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等于2000年报道的一种新型核酸扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等温(60 65°C )的条件下高效、特异、快速的扩增目的基因。目前,LAMP技术已经被广泛应用病原微生物的诊断中，包括人类致病细菌和病毒，动植物病毒和寄生虫的检测。
发明内容
本发明目的在于提供用于柯萨奇病毒A6型逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测的引物及试剂盒，以能够简单、快速、准确地检测样品中是否含柯萨奇病毒A6型，满足现场快速检测的需要。本发明提供的用于检测柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP引物组，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、以及两条环引物LF和LB，其碱基序列分别如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4、及 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 所示。本发明提供的柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，包括上述的RT-LAMP引物组。
本发明提供的一种柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，包括含有上述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23 μ I所述RT-LAMP反应液的配置为10 X buffer2. 5 μ l,25mM MgCl2 5 μ I, IOmM each dNTPs 3· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1μ1，40μΜ 所述ΒΙΡΙμ 1，10μΜ 所述 F3 O. 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 O. 5 μ 1，40 μ M 所述 LF 0·5μ1，40μΜ 所述 LB O. 5 μ I，5U/ μ I AMV 逆转录酶 O. 5 μ I，8U/ μ I Bst DNA polymerase I μ I, DEPC H2O6· 5 μ I ο优选地，所述柯萨奇病毒Α6型的RT-LAMP检测试剂盒还包括SYBR Green I荧光染料。上述柯萨奇病毒Α6型的RT-LAMP检测试剂盒的最佳检测反应条件是63°C恒温反应40min，80°C反应5min。具体地，操作时只需将RT-LAMP反应液和待检RNA混匀，63°C反应40min即可完成逆转录和等温扩增过程，80°C反应5min使酶灭活，反应结束后结果判断可取扩增产物电泳检测，或者在扩增产物管内加入SYBR Green I荧 光染料，根据反应液颜色的变化来判定结果。与现有的CA6RT-PCR、Real-time RT-PCR 相比，本发明建立了 CA6RT-LAMP 检测技术，它以样品(粪便、肛拭，咽拭、疱疹液、脑脊液)RNA为模板，省略了单独的逆转录步骤和模板的变性、退火和延伸反应过程中温度变化的耗时，只需一步就可以完成在等温环境中的循环置换扩增反应，不需要复杂的仪器，最后用电泳或加荧光染料后肉眼、紫外光下就可以观察结果，具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点。同时，本发明CA6RT-LAMP特异性强，灵敏度高。因此，本发明试剂盒及CA6RT-LAMP检测技术能够快速、简单、准确地判断样品是否有CA6感染，能够较好满足现场快速检测的要求，易于在基层单位推广应用，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构在手足口病等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I是CA6RT-LAMP、RT-PCR灵敏度实验的结果图；其中，图I-A和图I-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1-8 :分别为标准品RNA的10-1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，10_8梯度稀释的RT-LAMP产物，9 :阴性对照；图I-C是CA6RT-LAMP产物电泳条带，图1-D是CA6RT-PCR产物电泳条带，LaneM IOObp DNA Ladder Marker(100, 200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1500bp)；Lane 1-8 :分别为标准品 RNA 的 ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，10' 1(Γ8 梯度稀释的 RT-LAMP产物；Lane 9 :阴性对照；图2是CA6RT-LAMP引物特异性实验的结果图；其中，图2-A和图2-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1-12 CA6病毒，13 - 24 :分别为CA2，CA4, CA5, CA8, CA10, CA12,CA16, CBl, CB3, Echo9, Echol4 及 EV71 病毒，25 :阴性对照；图 2-C 是 CA6RT-LAMP 产物电泳条带，Lane M :IOObp DNA Ladder Marker ；Lanesl - 12 CA6 病毒；Lanes 13 - 24 :分别为 CA2, CA4, CA5, CA8, CA10, CA12, CA16, CBl, CB3，Echo9, Echol4 及 EV71 病毒；Lane 25 :阴性对照；
图3是CA6RT-LAMP方法的可重复性检测实验的结果图；其中，图3-A和图3-B分别是CA6RT-LAMP产物加荧光染料后在可见光下观察的结果和紫外光下观察的结果，图中，1、3、5、7 :分别为CA6阳性标准品4次重复；2、4、6、8 :分别为4次重复实验的阴性对照；图 3-C是CA6RT-LAMP产物电泳条带，Lane M IOObp DNA Ladder Marker ;Lane I、3、5、7 :分别为CA6阳性标准品4次重复；Lane2、4、6、8 :分别为4次重复实验的阴性对照。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例I : LAMP引物的设计和合成根据GenBank公布的CA6VP1基因序列，利用生物软件CLAST分析其相对保守区， 利用 LAMP 在线设计软件 PrimerExplorer V4 (http: //primerexplorer. ip/e/)针对相对保守序列区设计了 6条引物，包括两条内引物FIP (F2+F1C)和BIP(B2+B1C)、两条外引物F3和B3、以及两条环引物LF和LB，分别与靶序列中8个结合区匹配，在利用Oligo 6软件和BLAST对引物进行评价。引物序列为F3 (正向外引):5，-ACTCGCTGTGTGATGAATCG-3’ ；即 SEQ ID NO: IB3 (反向外引)5，-GCGTTGTGCTATCATTGAGG-3’ ;即 SEQ ID NO:2FIP(F1C+F2，正向内引):5，-CCTTCACCTCCACAACTCCTACTGAGGCGAGTGTGGAACA-3，；即 SEQ ID NO:3BIP(B1C+B2，反向内引)5，-TTGGCCCATAGATGTGATGGGCGGCATCAAAGCGCATGT-3，；即 SEQ ID NO:4LF :5，-GCCCTGCACGAGAGTAAAAG-3，；即 SEQ ID NO:5LB :5，-GCGGCGTAAACTGGAGCTGT-3，；即 SEQ ID NO:6其中，F2:5’ -TGAGGCGAGTGTGGAACA-3，；即 SEQ ID NO:7FlC :5，-CCTTCACCTCCACAACTCCTAC-3，；即 SEQ ID NO:8B2 :5， -CGGCATCAAAGCGCATGT-3，；即 SEQ ID NO:9BlC :5，-TTGGCCCATAGATGTGATGGG-3，；即 SEQ ID NO:10实施例2 =RNA的提取病毒样品RNA的抽提使用Roche High Pure Viral RNA KU，步骤按照其操作说明书进行，具体步骤1.在200 μ I样品处理液中加入400 μ I Binding Buffer，混匀后转移到滤柱上，8000g/min离心15s ;2.弃滤液，更换收集管，加入500 μ I Inhibitor RemovalBuffer, 8000g/min 离心 Imin ;3·弃滤液，更换收集管，加入 450 μ I Wash Buffer, 8000g/min离心Imin ；4.重复步骤3 —次；5.弃滤液,更换收集管，以离心机最大转速离心IOs ；6.将滤柱转移至1.5ml EP管，加入50μ1 Elution Buffer,8000g/min离心lmin,洗脱液即为提纯核酸。病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取；粪便样品、肛拭子和咽喉拭子需经过预处理，在抽提前需加Hank’Balanced Salt Solution,其中,O. Ig粪便样品(100 μ I液态)加Iml Hank’s液,充分振荡后将悬液8000rpm离心5min,取200 μ I上清液进行RNA抽提，用 50 μ I Elution Buffer 洗脱，于 _80°C保存。
实施例3 CA6RT-LAMP扩增方法的建立I、CA6RT-LAMP 反应体系 以待检样品RNA为模板，进行RT-LAMP反应。表1CA6RT-LAMP 反应体系
权利要求
1.一种用于检测柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP引物组，其特征在于包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、以及两条环引物LF和LB，其碱基序列分别如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4、及 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 所示。
2.—种柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求I所述的RT-LAMP引物组。
3.一种柯萨奇病毒A6型的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求I所述RT-LAMP引物组的RT-LAMP反应液，23^1所述RT-LAMP反应液的配置为10Xbuffer2.5 u l,25mM MgCl2 5u I, IOmM each dNTPs 3. 5 u l，40yM 所述 FIP I u l，40yM 所述 BIPIii 1，IOii M 所述 F3 0. l，10iiM 所述 B3 0. 5 y 1，40 y M 所述 LF 0. 5 y 1，40 y M 所述 LB0.5u l,5U/u I AMV逆转录酶0. l,8U/u I Bst DNApolymerase I u I,DEPC H2O 6. I。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括SYBRGreen I荧光染料。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的检测反应条件是63°C恒温反应40min,80°C反应5min。
全文摘要
本发明涉及生物检测技术应用领域，特别是柯萨奇病毒A6型RT-LAMP核酸检测用引物组及试剂盒，所述引物组包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、以及两条环引物LF和LB，所述试剂盒包括该引物组。本发明CA6RT-LAMP特异性强，灵敏度高，而且具有操作方法简单、检测快速、结果易于判断、成本低等特点，能够较好满足现场快速检测的要求，易于在基层单位推广应用，可用于疾病预防控制机构、医院、托幼机构在手足口病等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
文档编号G01N21/64GK102816870SQ201210319290
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者何雅青, 陈惠玲, 舒柏华 申请人:何雅青, 陈惠玲, 舒柏华