专利名称：一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，特别指一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法。
背景技术：
亚麻(linum usitatissimun L.)亦称胡麻,是世界十大油料作物之一。亚麻种子-亚麻籽中含有α-亚麻酸和木脂素等多种对健康有益的成分。亚麻籽木脂素-裂环异落叶松脂素双糖苷(secoisolariciresinol diglucoside, SDG)经体内代谢活性化后具有改善妇女更年期症状、防治乳腺癌等功效[张才煜，张本刚，杨秀伟.亚麻子化学成分及其药理作用研究进展.中国新药杂志，2005，14 (5) :525-530]。另一方面，亚麻籽中也含有生氰糖苷类化合物-亚麻氰苷和新亚麻氰苷。生氰糖苷在酶或消化道酸和微生物的作用下会分解释放出毒性很强的氢氰酸，因此大量食用含有生氰糖苷的亚麻籽产品会引起食物中 毒[周小洁，车向荣，于霏.亚麻籽及其饼柏的营养学和毒理学研究进展.饲料工业，2005，26(19) :46-50]。准确快速的生氰糖苷和木脂素检测方法对确保亚麻籽产品的食用安全以及指导高质量亚麻籽产品的生产非常重要。迄今为止，亚麻籽及其产品中生氰糖苷的检测方法主要有硝酸银滴定法、氰离子选择电极法、比色法和高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)等，其中高效液相色谱法有重复性好、回收率高的优点[周小洁，车向荣，于霏.亚麻籽及其饼柏的营养学和毒理学研究进展.饲料工业，2005，26 (19) :46-50]。然而，由于亚麻籽中的生氰糖苷缺乏共轭双键，紫外吸收不强，影响了紫外检测定量的灵敏度。近年发展起来的质谱检测可以很好得弥补紫外检测的不足，特别是质谱(MS)的多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式，在定量化合物时不仅考虑了保留时间，还考虑了化合物的母离子及子离子，大大提高了定量分析的分辨率和准确度。近年虽有个别高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测亚麻籽生氰糖苷的报道[Park, Eun-Ryong ；Hong, Jin-Hwan ；Lee, Dong-Ha ；Han, Sang-Bae ；Lee, Kang-Bong ；Park, Jae-Seok ；Chung, Hyung-ffook ;Hong, Kyung-Hyun ；Kim, Myung-Chul.Analysis and decrease of cyanogenic glucosides in flaxseed. Korea Food and DrugAdministration. (2005)，34 (6)，875-879]，但还没有使用定量方面更有优势的MRM模式检测法的报道。另外，对亚麻籽木脂素SDG及亚麻氰苷和新亚麻氰苷的同时定量方法还没见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法。本检测方法采用含内标化合物的甲醇溶液对亚麻子产品进行提取和前处理，之后通过U/HPLC-MS的MRM模式对亚麻氰苷、新亚麻氰苷及亚麻籽木脂素SDG这三种成分进行定性定量分析。本发明要解决的技术问题由如下方案实现一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法，步骤特征是(I)内标溶液配制配制含内标化合物浓度固定在O. 1-500 μ g/mL的甲醇溶液；(2)配制标准曲线用溶液用步骤(I)所述内标溶液溶解亚麻籽纯成分得到浓度为O. 5-500 μ g/mL的标准品储存液，用步骤(I)所述内标溶液稀释所述标准品储存液得到系列浓度的标准溶液；(3)亚麻籽油样品处理取50-5000 μ L亚麻籽油加O. I-IOmL的步骤(I)所述内
标溶液进行萃取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；(4)亚麻籽固体样品处理取15-1500mg亚麻籽固体样品加O. I-IOmL的步骤(I)所述内标溶液进行提取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；(5)液-质联用分析高效液相色谱-质谱联用定量分析色谱柱填料为反相硅胶0DS，流动相为AB两相梯度洗脱，其中A为含酸的水溶液；B为乙腈或甲醇，采用负离子模式·多反应监测质谱定量；(6)待测物浓度计算步骤(2)的标准溶液用步骤(5)的方法来分析，求出Y轴为响应因子，X轴为成分浓度的标准曲线，其中响应因子为成分峰面积与内标峰面积之比，上述步骤(3)和步骤(4)的样品经步骤(5)的方法分析可得出亚麻籽样品中成分的响应因子，再用标准曲线计算出待测物浓度。整个计算过程可用相应计算机软件或(超)高效液相色谱-质谱联用仪所带软件完成。首先选定结构性质与待测成分相近的化合物为内标物。然后固定内标化合物的浓度，配置一系列浓度的亚麻氰苷、新亚麻氰苷及SDG的标准溶液，用LC-MS的MRM模式测定。根据标准品的浓度和化合物与内标物面积之比绘制标准曲线，求出横轴为化合物浓度，纵轴为化合物与内标物面积之比的线性回归方程。用含同样浓度内标的甲醇溶液提取样品，LC-MS的MRM模式测定面积，将化合物与内标物面积之比代入回归方程计算化合物的浓度。计算过程可用各种定量软件完成。测得加标回收率为85. 3 112. 3%，说明该方法准确度符合实验要求，结果可靠。本发明的优点是选用了性质与化合物相近的内标化合物，并在提取样品时既加入内标化合物，在整个样品前处理与分析过程中内标化合物与待测化合物共存，从而尽可能地抵消了提取率不全及分析过程中的误差。本检测方法具有快速、准确、重现性好，能同时测定亚麻籽有益成分和有害成分等优点。
图I为亚麻氰苷、新亚麻氰苷及SDG的化学结构式。图2为亚麻木脂素(SDG)的标准曲线。图3为本检测方法的流程图。
具体实施例方式如图3所示的实施例和步骤仅为一例，但内标化合物不限于例中所用化合物，也可选其它和待测物结构相近的化合物作为内标，如芦丁等其它酚类成分、海藻糖等其它碳水化合物。可使用一种内标，也可分别针对于SDG和生氰糖苷使用两种内标化合物。在原理相同的情况下具体步骤和样品提取的料液比例可适当调整。
①配制内标溶液配制内标物(相思子素-2 " -O-芹菜糖甙，Abrusin2 " -O- β -apioside)浓度为 10 μ g/mL 的甲醇溶液。②配制标准曲线用溶液配制含50μ g/mL的亚麻氰苷、新亚麻氰苷及SDG和10 μ g/mL内标化合物的甲醇溶液，用上述内标溶液按照I :3:3:3:3:3:3:3:3比例稀释得系列浓度的标准溶液。③亚麻籽油样品处理取500 μ L亚麻子油加ImL上述含内标溶液超声提取IOmin后再震摇lmin，如此反复3次，静置分层，取上清液过O. 22微米滤膜后，得样品溶液做液-质联用分析。④亚麻籽固体样品处理取150mg固体样品加ImL上述内标溶液超声提取IOmin后震摇lmin，如此反复3次，然后IOOOOrmp离心2. 5min，取上清液过O. 22微米滤膜后，得样品溶液做液-质联用分析。
⑤液-质联用分析超高效液相色谱-质谱联用定量分析用色谱柱为AgilentZORBAX Eclipse Plus C18(2. ImmX 50mm ;粒径 I. 8 μ m)，柱温保持在 30°C。流动相为 AB 两相梯度洗脱，其中A为含O. I % (v/v)甲酸的水溶液，B为乙腈。洗脱程序为0min，2%B;3min, 20 % B ；3. 5min, 40 % B ；5min, 50 % B ；5. 5min, 100 % B ；7min, 100% B0 流速 0. 4mL/min ;样品注射量为2 μ L。质谱毛细管电压4kV，离子源温度350°C，采用负离子模式多反应监测(MRM)定量，参数设置如表I所示。表I亚麻籽成分及内标物的MRM测定条件
化合物母离子子离子驻留时裂解电碰撞能加速器能极性
___间压量量
亚麻氰408323,80 160 77负
苷(I)[M-H]'179
新亚麻422323,80 170 5I负
氰苷 C2)[M-H]-179___
SDG (3)720.8684.8，80 155 20，7负
__[M+C1]·522.825
内标607354，80 200 35，7负 __[M-H]·32545其中亚麻氰苷的裂解电压可以为5-500，优选140-180 ;新亚麻氰苷的裂解电压可以为5-500，优选150-190 ；SDG的裂解电压可以为5-500，优选120-180。所有化合物的碰撞能量可以为5-200,优选表中所不数值±10。表2例举了目标及内标化合物的名称、保留时间和最低定量限等参数。最低定量限定义为信噪比为10时的浓度。标准曲线方程中的X为被测物浓度，Y为响应因子(被测物与内标峰的峰面积之比)。
⑥待测物浓度计算通过将样品溶液中目标物的响应因子代入标准曲线方程求出其浓度，进而引入提取溶剂的用量及稀释倍数计算出各目标化合物在样品中的含量。表2亚麻籽成分定量的有关参数
权利要求
1.一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法，步骤特征是 (1)内标溶液配制配制含内标化合物浓度固定在O.1-500 μ g/mL的甲醇溶液； (2)配制标准曲线用溶液用步骤(I)所述内标溶液溶解亚麻纯成分得到浓度为O.5-500 μ g/mL的标准品储存液，用步骤(I)所述内标溶液稀释所述标准品储存液得到系列浓度的标准溶液； (3)亚麻籽油样品处理取50-5000μ L亚麻籽油加O. I-IOmL的步骤⑴所述内标溶液进行萃取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析； (4)亚麻籽固体样品处理取15-1500mg亚麻籽固体样品加O.I-IOmL的步骤(I)所述内标溶液进行提取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析； (5)液-质联用分析高效液相色谱-质谱联用定量分析色谱柱填料为反相硅胶ODS，流动相为AB两相梯度洗脱，其中A为含酸的水溶液；B为乙腈或甲醇，采用负离子模式多反应监测质谱定量； (6)待测物浓度计算步骤(2)的标准溶液用步骤(5)的方法来分析，求出Y轴为响应因子，X轴为成分浓度的标准曲线，其中响应因子为成分峰面积与内标峰面积之比，上述步骤(3)和步骤(4)的样品经步骤(5)的方法分析可得出亚麻籽样品中成分的响应因子，再用标准曲线计算出待测物浓度。
全文摘要
本发明公开了一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法。主要步骤是配制含固定浓度内标化合物的内标溶液，用内标溶液配制系列浓度的待测成分的标准溶液，用液-质联用MRM模式分析，绘制X轴为浓度；Y轴为成分峰面积与内标峰面积之比的标准曲线，用内标溶液提取亚麻籽样品并对该提取液进行液-质联用MRM模式分析，从标准曲线或其回归方程中求出亚麻籽产品中的有益成分(亚麻木脂素，SDG)及有害成分(亚麻氰苷和新亚麻氰苷)的含量。本检测方法有快速、准确、重现性好，所用时间短等优点，是亚麻籽产品质量控制和生产条件的重要监测手段。
文档编号G01N30/06GK102914601SQ201210341719
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者马超美, 王雅丽, 麻剑南, 刘治君, 刘强 申请人:内蒙古大学