专利名称：除草剂2,4-d-杀虫剂chi二联检测卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及环境激素检测技术领域，特别是涉及一种除草剂2，4-D-杀虫剂CHI 二联检测卡及其制备方法。
背景技术：
近些年来，科学家们接连发现一些存在于生物机体之外，具有与人和生物内分泌激素作用类似的物质，这些物质能够模拟内分泌激素功能从而引起生物体内分泌系统紊舌L就将之称为环境激素或环境荷尔蒙。环境激素已成为继臭氧层、地球气候变暖之后全球的第三大环境问题，成为环境科学研究领域中的热门课题。环境激素是指外因性干扰生物体内分泌的化学物质。由于人类活动而释放到环境中的化学物质，在动物和人体内发挥类似雌激素的作用。它能通过与激素受体结合，干扰生物体正常的生理代谢、内分泌和生殖机能，引起种种负面的生物学效应。环境激素通过环境介质和食物链进入人或动物体内，干扰其内分泌系统和生殖功能系统，甚至有引发恶性肿瘤与生物绝种的危害。现代工农业生产在不断满足人类的生活需要的同时也给环境带来了沉重的负担，并且已经威胁到人类的生殖健康，甚至物种的繁衍。我国是世界上的农药生产与使用大国，资料显示2011年我国农药原药产量为264. 87万吨，其中杀虫剂原药产量为70. 9万吨，占总产量的44. 35% ;除草剂产量为117. 5万吨，占总产量的26. 77% ;杀菌剂原药产量为15万吨，占总产量的5.67%。此类农药除部分出口外，大部分在国内销售和使用。据相关数据估算我国每年约有5(Γ60万吨有机氯农药直接排放至环境中，如除草剂2，4-滴(2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid, 2, 4-D)、杀虫剂毒死蝶(Chlorpyrifos, CHI)及真菌剂五氯苯酹(Pentachlorophenol,PCP)。而多数有机氯农药具有较强的内分泌干扰作用。此类农药一旦进入环境就会通 过多种暴露途径进入生物体内，富集于生物体的脂肪组织内进而危害人和动物的生殖健康。目前，环境激素污染物的分析方法主要分为以GC-MS、HPLC与LC-MS技术为代表的仪器分析方法以及基于抗原抗体反应的免疫分析方法，这些常规的残留分析方法通常操作程序复杂，效率较低，分析成本较高，不利于推广使用，难以适应大量样本和现场检测的要求。基于环境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究热点，本发明涉及一种除草剂2，4-D和杀虫剂CHI 二联检测卡及其制备方法。本发明的检测卡具有简便快捷、易于操作、成本低廉等优点，并且能同时检测水样中这两种环境激素污染物质，产生了良好的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时检测水样中除草剂2，4-D和杀虫剂CHI的检测卡，适合进行现场检测且选择性好、稳定性强、简单方便、成本低廉的优点。本发明的除草剂2，4-D和杀虫剂CHI 二联胶体金检测卡，由包被了 2，4_D单克隆抗体、CHI单克隆抗体的胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了 2，4-D蛋白质偶联物、CHI蛋白质偶联物和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC背衬及塑料模具等组成，在PVC背衬的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。本发明的除草剂2，4-D和杀虫剂CHI 二联胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现
(1)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
(2)抗体的预处理将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体在1000r/min, 4°C条件下，离心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI单克隆抗体的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min ；金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成2，4-D单克隆抗体或CHI单克隆抗体的胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备将步骤(3)2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金标记物依次用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金膜；
(5)包被膜制备将兔抗鼠Ig G抗体稀释成Img/mL、2, 4-D抗原稀释成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀释成O. 5 mg/mL，用划膜仪依次以I PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37 °C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
(6)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装PVC背衬自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述步骤(3)中的金标抗体稀释液由5 g小牛血清蛋白(BSA) ,10 g鹿糖,加100mL 0.01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，过O. 22 滤膜，现配现用；金标抗体洗涤缓冲液是由 10 g 小牛血清蛋白(BSA)和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL所得；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0. 8 g氯化钠(NaCl),用含有 0. 5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本发明可有效用于同时测定水样中除草剂2，4-D和杀虫剂CHI 二种环境激素污染物质，方法简单，方便、快捷，结果准确。
图1为本发明除草剂2，4-D-杀虫剂CHI 二联检测卡的结构图图中1.加样孔2.2，4-D检测线3. CHI检测线4.质控线5.检测孔6.试纸条；
图2为本发明除草剂2，4-D-杀虫剂CHI 二联检测卡的试纸条的剖视结构图，图中7.检测卡外壳8.样品垫9.胶体金结合垫10. PVC背衬11.硝酸纤维素膜。
具体实施例方式实施例1
图1为本发明除草剂2，4-D-杀虫剂CHI 二联检测卡的结构图、图2为本发明除草剂2，4-D-杀虫剂CHI 二联检测卡的试纸条的剖视结构图，图中10为PVC背衬；8为样品垫；9为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了 2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体胶体金标记物；11为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了 2，4-D蛋白质偶联物、CHI蛋白质偶联物和兔抗鼠IgG。在PVC背衬10的一端上(样品加样端)粘附样品垫8、胶体金结合垫9，样品垫8搭接在胶体金结合垫9上。在PVC背衬10的中间粘附硝酸纤维素膜11。在硝酸纤维素膜11上设置有2，4_D蛋白质偶联物检测线2、CHI蛋白质偶联物检测线3和兔抗鼠IgG质控线4。在PVC背衬10的另一端粘附吸水垫12。硝酸纤维素膜11的一端与胶体金结合垫9略交叉，另一端与吸水垫12略交叉。该试纸条6可装入有塑料模具制成的检测卡外壳7中，在检测卡外壳7的上盖上设有加样孔I和检测孔5，样品垫8正对加样孔I，硝酸纤维素膜11正对检测孔5。实施例2
除草剂2，4-D和杀虫剂CHI 二联胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现
(1)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
(2)抗体的预处理将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体在1000r/min, 4°C条件下，离心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体稀释成I mg/mL,过O. 22 Mm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI单克隆抗体的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min ；金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成2，4-D单克隆抗体或CHI单克隆抗体的胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备将步骤(3)2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金标记物依次用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金膜；
(5)包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体稀释成Img/mL、2, 4-D抗原稀释成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀释成O. 5 mg/mL，用划膜仪依次以I PL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37 °C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
(6)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装PVC背衬自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。实施例3 最低检出限量试验。分别配制标准的除草剂2，4-D和杀虫剂CHI标准品溶液浓度是0、5 ng/mLUOng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL ;滴加2滴样品到检测卡加样孔上,5 min后观察检测线T和质控线C的显色结果。经多次检验，2，4-D和CHI的检出率达99%以上，最低检出限量少于15ng/mLο
权利要求
1.除草剂2，4-D和杀虫剂CHIニ联胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到 胶体金溶液制备取I L三角烧瓶I个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 3H20 5 mL，配制成500 mL 0. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7 2H20溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，維持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用； 抗体的预处理将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体在1000 r/min, 4°C条件下,离心20 min，取上清，用0. 01 mo I/L PBS稀释成I mg/mL ;或者用0. 01 mo I/L PBS将要标记的2，4-D或CHI单克隆抗体稀释成I mg/mL，过0. 22 Mm滤膜； 胶体金标记物的制备取步骤(I)中的胶体金溶液40 mL，用0. 25 mo I/L K2CO3调节胶体金溶液PH至8. 5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL含0. 3 mg 2，4-D或CHI单克隆抗体的蛋白溶液，反应10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温1500 r/min离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成2，4-D单克隆抗体或CHI单克隆抗体的胶体金标记物； 胶体金膜的制备将步骤(3) 2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金标记物依次用划膜仪以5 ML/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3h，制成含2，4-D单克隆抗体和CHI单克隆抗体的胶体金膜； 包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体稀释成I mg/mL、2，4-D抗原稀释成0. 3 mg/mL和CHI抗原稀释成0.5 mg/mL，用划膜仪依次以I ML/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干； 样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干； 检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
2.根据权利要求1所述的除草剂2，4-D和杀虫剂CHIニ联胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(3)中的金标抗体稀释液由5 g小牛血清蛋白，10 g鹿糖,加100 mL 0. 01 mol/LPBS溶液溶解配制而成，过0.22 Mffl滤膜，现配现用；金标抗体洗涤缓冲液是由10 g小牛血清蛋白和 I g PEG-20000,M 0. 01 mol/L PBS pH7. 4 定容至 100 mL 所得； 所述步骤(6)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白和0.8 g氯化钠，用含有·0.5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本发明除草剂2,4-D-杀虫剂CHI二联检测卡及其制备方法，涉及环境激素检测技术领域。本发明的检测卡外壳中有试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含2,4-D单克隆抗体、CHI单克隆抗体胶体金标记物的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有二条检测线T线和一条质控线C线，检测线T线依次包被有2,4-D蛋白质偶联物、CHI蛋白质偶联物，质控线C线包被有兔抗鼠IgG抗体。本发明可同时检测出水样中除草剂2,4-D和杀虫剂CHI，方法简单、方便、快捷，结果准确。
文档编号G01N33/577GK103048455SQ20121036676
公开日2013年4月17日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者杜道林, 洪霞, 张祯, 薛永来 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司