专利名称：一种检测褐色橘蚜体内ctv实时荧光定量rt-pcr的引物及其方法
技术领域：
本发明属于柑橘衰退病毒(CTV)检测领域。具体涉及用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其方法。
背景技术：
柑橘衰退病毒(Citrustristeza virus,CTV)是长线形病毒属(Closterovirus)的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒[I]。褐色橘蚜被普遍认为是其最主要的传播介体。由CTV引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对柑橘产业造成了重大经济损失。监控CTV在田间的流行是控制柑橘衰退病扩大危害的重要策略之一，因此急需建立一种快速、灵敏且可靠的检测橘蚜体内CTV含量的方法，对更好的防治橘蚜传播CTV及深入研究蚜传机制有重大意义。在ELISA技术出现之前，明确蚜虫是否带毒一般通过传毒实验进行评价。血清学ELISA技术的建立推动了植物病毒的诊断，但由于非增殖型传播的病毒在昆虫体内浓度很低及血清学方法检测灵敏度较低，所以检测昆虫体内病毒比较困难。目前，PCR技术已广泛用来检测蚜虫体内带毒情况。对蚜虫体内的CTV成功检出的方法已有报道，主要有常规反转录多聚酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription-nested-polymerase chain reaction, RT-nested-PCR),这只是定性检测。虽然 Maria 等及 Edson Bertolini 等分别用 Real-time RT-PCR(TaqMail蚜虫内CTV进行了定量检测，但TaqMan探针法成本较高，而应用SYBR Green I染料法检测橘蚜体内CTV尚无好的体系。
发明内容
为解决以上技术问题，为解 决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种柑橘衰退病毒特异性引物，用于荧光定量RT-PCR检测方法。本发明目的之二在于提供一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法。本发明目的是这样实现的:一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物，其关键在于:其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和2所示。上述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和4所示。一种用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的方法，其特征在于包括如下步骤:(I)引物的制备:根据Genbank中CTV Ρ25基因保守序列，利用Beacon Designer7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证弓I物的特异性。在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得LD-T7-F，弓丨物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA ；(2)褐色橘蚜总RNA的提取；(3)目的基因的扩增与鉴定；(4)标准品cRNA的制备；(5)建立荧光定量RT-PCR体系；(6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测:当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。上述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60°C ;引物浓度为600nm ；5 μ I 反转录体系为:2XTS ReAction Mix 2.5 μ I ；TrAnsScriptTM/RI EnzymeMix0.25 μ I ；gDNA Remover 0.25 μ I ;HD_R 0.25 μ I ；ddH20 0.25 μ I ;蚜虫 RNA 模板或标准品1.5 μ I ;程序为:42°C反转录30min ;85°C变性5min.
20 μ I 实时定量 PCR 反应体系:2XSYBR Green Supermix) 10 μ I ;HD_F/R 各1.2 μ I ；ddH20 5.6 μ I ;反转录产物cDNA模板2 μ I ;扩增程序为:95°C预变性30s，95。。变性10s，60°C退火15s，72°C延伸20s,40个循环;扩增后采集融解曲线程序:95°C变性15s后，从65°C开始，每升高 0.5°C停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95°C融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照；采用上述建立的体系对在毒源上取食24h的单头蚜虫中CTV进行定量检测，得到单头橘蚜体内CTV含量。上述荧光定量RT-PCR条件的优化及体系的确定退火温度的优化 以9.0 X IO5拷贝/ μ I的cRNA反转录的cDNA作为模板，选取53°C到63°C的10个不同退火温度进行荧光定量RT-PCR，观察温度对荧光信号的影响及是否出现非特异，选取Ct值最小且扩增曲线最好的温度。从附图
3、4可以看出退火温度为60°C时，荧光值最高，Ct值比其他组小，说明其扩增效率及检测灵敏度较其他组高，从融解曲线仅有单一峰可以看出无非特异，因此确定该体系退火温度为60°C。引物浓度的优化以9.0 X IO1拷贝/ μ I到9.0 X IO8拷贝/ μ I的cRNA反转录的cDNA作为模板，选取800nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm 6个不同浓度的引物在相同条件下进行定量RT-PCR，观察不同引物浓度下标准曲线的扩增效率。选择最适的退火温度及引物浓度确定最终检测体系。经比较后结果为600nm时扩增效率最高且无非特异扩增，因此600nm为该体系最终引物浓度。扩增曲线及标准曲线如图5、6，可以看出扩增效率达104.7，相关性为0.998，表明该体系可以准确的对橘蚜体内CTV含量进行定量检测。经退火温度和引物浓度的优化，最终确定该体系为:5 μ I 反转录体系为:2XTS ReAction Mix 2.5 μ I ；TrAnsScriptTM/RI EnzymeMix0.25 μ I ；gDNA Remover 0.25 μ I ;HD_R 0.25 μ I ；ddH20 0.25 μ I ;病毒模板 1.5 μ I。程序为:42°C反转录30min ;85°C变性5min.
20 μ I 实时定量 PCR 反应体系:2XSYBR Green Supermix) 10 μ I ;HD_F/R 各
1.2μ I ；ddH20 5.6 μ I ;cDNA 模板 2μ I ;扩增程序为:95°C预变性 30s，95。。变性 10s,60°C退火15s，72°C延伸20s，40个循环。扩增后采集融解曲线程序:95°C变性15s后，从65°C开始，每升高0.5°C停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95°C融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照。标准曲线的建立将计算好拷贝数的cRNA用TAKARA的EASY Dilution (D9160A)以10倍梯度稀释稀释的9.0X IO1拷贝/ μ I到9.0X IO8拷贝/ μ I为模板进行反转录后，在最优的反应条件下进行定量RT-PCR，每一浓度设定3个重复，同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照，仪器自动生成标准曲线。反应体系的方法学测试荧光定量RT-PCR的灵敏性试验 以同一批梯度稀释的9.0 X IO1拷贝/ μ I到9.0 X IO8拷贝/ μ I的cRNA进行反转录后的cDNA为模板分别进行实时定量PCR和常规PCR，比较这两种方法的灵敏度。结果表明，荧光定量RT-PCR能够检测到9.0 X 10°拷贝/ μ I个cRNA，而常规RT-PCR只能检测到9.0X IO2拷贝/ μ I个cRNA，表明荧光定量RT-PCR检测灵敏度比常规RT-PCR检测提高了100倍，见附图7，8
荧光定量RT-PCR的重复性试验用9.0X IO3拷贝/ μ I到9.0X IO7拷贝/ μ I的cRNA样品为模板，每个稀释度做3管重复，按照优化的体系进行荧光定量PCR。为考察不同实验组间差异性，将以上不同浓度模板连续3天进行3次试验，根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准差(SD)和变异系数(CV)。根据扩增曲线及统计学分析结果(表I)表明，各梯度的变异系数最大为0.67%，表明该方法具有较好组内重复性。而进行的组间重复性试验结果显示，各梯度的变异系数最大为3.24% (表I)，表明该方法具有较好组间重复性，可同时或分批对样品进行稳定准确的定量检测。表I重复性试验结果Tab.1 The result of reproducibility
权利要求
1.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于:其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和2所示。
2.根据权利要求1所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于，所述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和4所示。
3.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)引物的设计:根据Genbank中CTVP25基因保守序列，利用BeaconDesigner 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性，在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得引物LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA ； (2)褐色橘蚜总RNA的提取； (3)目的基因的扩增与鉴定； (4)标准品cRNA的制备； (5)建立荧光定量RT-PCR体系，所述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60°C;引物浓度为600nm,体系如下: 5μ I 反转录体系为:2XTS ReAction Mix 2.5 μ I ； TrAnsScr iptTM/RI EnzymeMix0.25 μ I ；gDNA Remover 0.25 μ I ;HD_R 0.25 μ I ；ddH20 0.25 μ I ;蚜虫 RNA 模板或标准品1.5 μ I ;程序为:42°C反转录30min ;85°C变性5min ；20 μ I 实时定量 PCR 反应体系:2 X SYBR Green Supermix) 10 μ I ;HD_F/R 各 1.2 μ I ;ddH20 5.6 μ I ;反转录产物cDNA模板2μ I ;扩增程序为:95°C预变性30s，95°C变性IOs,60°C退火15s，72°C延伸20s，40个循环；扩增后采集融解曲线程序:95°C变性15s后，从65°C开始，每升高0.5°C停留30s采集荧光信号，直到温度升高到95°C融解曲线采集完成，每个样品3个技术重复，同时设负对照和空白对照； (6)单头褐色橘蚜体内CTV含量检测。
4.根据权利要求3所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于:采用上述建立的体系对在毒源植物上获毒的单头蚜虫中CTV进行定量检测，得到单头橘蚜体内CTV含量，具体检测为:当毒源植物开始抽梢时，用毛笔将无毒褐色橘蚜的无翅成蚜同时放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50头，健康植株上放置10头，当蚜虫在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛笔分别将褐色橘蚜轻轻挑到以干净的培养皿中，再随机取20头获毒蚜虫，单头分装于经DEPC水处理的EP管中进行抽提检测，同时取3头在健康植株上取食同样时间的蚜虫放于EP管中作为负对照与获毒蚜虫同时检测得到结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法，利用实时定量引物专用设计软件Beacon Designer设计CTV特异性引物，摸索和优化实时荧光定量RT-PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，并对单头橘蚜体内CTV含量进行准确的定量检测。通过融解曲线、标准曲线的扩增效率及相关系数及方法学验证结果表明该体系灵敏、快速、有效，即使橘蚜体内CTV含量低也可准确定量检测。
文档编号G01N21/64GK103088152SQ20121037019
公开日2013年5月8日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者刘金香, 李玲娣, 周常勇, 李中安, 田晓 申请人:中国农业科学院柑桔研究所