专利名称：一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种目标蛋白质的检测方法，属于细胞生物学领域。
背景技术：
外周血细胞中包含淋巴细胞、粒细胞等有核细胞和大量 的红细胞。细胞免疫荧光标记结合荧光显微镜、流式细胞仪等设备的方法是对外周血有核细胞胞内蛋白质含量分析的方法之一。这种方法在抗体标记过程中，抗体识别容易受到外周血中残留红细胞的影响。通常情况下，对外周血有核细胞胞内蛋白质进行免疫荧光标记时会采用下面几种方法1、采用特异性抗体分离出需要的有核细胞，再进行固定、标记。这种方法成本高，实验时间长。
2、采用红细胞裂解液，去除红细胞，而后对有核细胞进行固定、标记。这种方法在裂解红细胞的同时可能会对有核细胞产生破坏，影响后续实验。由此可见如何有效去除红细胞是这种实验的关键问题之一。
发明内容
针对现有技术不足，本发明要解决的技术问题是在外周血有核细胞固定之后，抗体标记之前能有效的去除外周血中的大量红细胞,实现快速、简单的对外周血有核细胞内蛋白质进行免疫荧光标记。该方法能够广泛的应用于医学诊断、蛋白质检测、分子生物学研究领域。尤其是本发明涉及一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法，包括如下步骤I)在外周血样品中加入5倍体积固定液，室温作用30分钟；2)室温离心(500g) 5分钟，去上清；3)加入洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g) 5分钟，去除上清，保留沉淀；4)加入5倍外周血样品体积的破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min ；5)室温离心(500g)5分钟，去上清；6)加入洗液洗涤细胞，室温离心(500g) 5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；7)重复步骤6);8)在细胞沉淀中加入目标蛋白质特异性抗体100μ 1，混匀后37°C条件下作用30min ；9)加入洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的特异性抗体；10)重复步骤9);11)加入100 μ I荧光标记第二抗体，混匀后37°C避光作用30分钟；12)加入洗液洗涤细胞，去除上清；13)重复步骤 12);14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4°C保存直至利用流式细胞仪或其他方法检测分析；
15)对于检测的样品，均需设定未加入目标蛋白质特异性抗体的对照样品；16)数据分析，与对照样品相比，荧光细胞数目和/或荧光强度增加为阳性结果，荧光细胞数目和/或荧光强度没有改变为阴性结果。其中，步骤8)-11)可替换为在细胞沉淀中加入荧光标记的目标蛋白质特异性抗体，混匀后37°C条件下作用30min。其中，步骤I)中外周血样品为哺乳动物外周血。其中，步骤I)中固定液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的2% (w/v)多聚甲醛溶液，加入固定液体积为起始外周血样品体积的5倍。其中，步骤4)中破膜剂为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的O. 04% (v/v) Triton-100溶液，加入破膜剂的体积为起始外周血样品体积的5倍。其中，步骤3)、6)、7)、9)、10)、12)、13)中洗液为磷酸盐缓冲液(PH= 7. 2)、NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液，加入洗液体积为起始外周血样品体积3-5倍，优选为3、4、5倍，更优选为5倍。其中，步骤8)中目标蛋白质为外周血有核细胞胞内(包括细胞浆和细胞核)表达的蛋白质，特异性抗体为能用于细胞免疫荧光标记的抗体。其中，步骤11)中第二抗体为可识别步骤8)中的特异性抗体的抗体。其中，步骤14)中检测缓冲液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的1% (w/v)多聚甲醛溶液。利用本发明所述的一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法较现有技术具有明显的优越性I)方法简单，在对有核细胞破膜同时，去除外周血中的红细胞，无需其他红细胞裂解步骤，方法快速、节省时间。2)在有核细胞固定后裂解红细胞，不会对有核细胞内产生影响，保证结果的真实性。3)该方法可结合于流式细胞仪、荧光显微镜等仪器分析，具有较好的推广性。
图I :阴性对照样品流式细胞仪检测散点图。图2 :阴性对照样品流式细胞仪检测荧光强度图。图3 :检测样品流式细胞仪检测散点图。图4 :检测样品流式细胞仪检测荧光强度图。图5 :荧光显微镜检测细胞内荧光照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例I :流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中Y -H2AX蛋白质含量。I)取300 μ I经2Gy Y射线照射后I小时的人外周血(肝素纳抗凝)，加入I. 5ml固定液，室温作用30分钟；2)室温离心(500g)5分钟，去上清；
3)利用I. 5ml洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g) 5分钟，去除上
清，保留沉淀；4)加入I. 5ml破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min ；5)室温条件下离心(500g) 5分钟，去上清；6)加入I. 5ml洗液洗涤细胞，室温离心(500g) 5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；7)重复步骤6)；8)在细胞沉淀中加入小鼠抗人Y -H2AX抗体100 μ I (I : 200倍稀释)，混匀后37°C条件下作用30min ；9) I. 5ml洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的抗体；
10)重复步骤9)；11)加入100 μ I FITC标记的兔抗小鼠IgG(第二抗体，I 200倍稀释)，混匀后37 °C避光作用30分钟；12) I. 5ml洗液洗涤细胞，弃上清；13)重复步骤 12)；14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4°C保存直至利用流式细胞仪分析；15)对于检测的样品，设定未加入小鼠抗人Y-H2AX抗体的阴性对照样品；16)数据分析，如图I和3表示阴性对照样品和检测样品的散点图，Rl代表淋巴细胞。图2和图4分别代表阴性对照样品和检测样品中淋巴细胞的荧光强度图。与阴性对照样品(图2)相比，检测样品(图4)荧光强度增加，表明通过该方法有效的检测出细胞内的Y-H2AX蛋白质。实施例2 :荧光显微镜检测外周血淋巴细胞中Y -H2AX蛋白质。I)取300 μ I经2Gy Y射线照射后I小时的人外周血(肝素纳抗凝)，加入I. 5ml固定液，室温作用30分钟；2)室温离心(500g) 5分钟，去上清；3)利用I. 5ml洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g) 5分钟，去除上
清，保留沉淀；4)加入I. 5ml破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min ；5)室温条件下离心(500g) 5分钟，去上清；6)加入I. 5ml洗液洗涤细胞，室温离心(500g) 5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；7)重复步骤6)；8)在细胞沉淀中加入FITC标记的小鼠抗人Y -H2AX抗体100 μ I (I : 200倍稀释)，混匀后37°C条件下作用30min ；9) I. 5ml洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的抗体；10)将细胞沉淀重悬于100 μ I检测缓冲液中，将细胞重悬，取20 μ I细胞悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，突光显微镜下观察。11)数据分析，显微镜下分析，镜下见绿色荧光表明该方法有效检测到细胞内的Υ-Η2ΑΧ蛋白质，见图5。
权利要求
1.一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤 1)在外周血样品中加入5倍体积固定液，室温作用30分钟； 2)室温离心(500g)5分钟，去上清； 3)加入洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g)5分钟，去除上清，保留沉淀； 4)加入5倍外周血样品体积的破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min； 5)室温离心(500g)5分钟，去上清； 6)加入洗液洗涤细胞，室温离心(500g)5分钟，去除上清，保留细胞沉淀； 7)重复步骤6)； 8)在细胞沉淀中加入目标蛋白质特异性抗体，混匀后37°C条件下作用30min； 9)加入洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的特异性抗体； 10)重复步骤9)； 11)加入荧光标记第二抗体，混匀后37°C避光作用30分钟； 12)加入洗液洗涤细胞，去除上清； 13)重复步骤12)； 14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4°C保存直至利用流式细胞仪或其他方法检测分析； 15)对于检测的样品，均需设定未加入目标蛋白质特异性抗体的对照样品； 16)数据分析，与对照样品相比，荧光细胞数目和/或荧光强度增加为阳性结果，荧光细胞数目和/或荧光强度没有改变为阴性结果。
2.如权利要求I所述的方法，其特征是所述步骤8)-11)替换为在细胞沉淀中加入荧光标记的目标蛋白质特异性抗体，混匀后37°C条件下作用30min，不需要设置对照样品。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤I)中外周血样品为哺乳动物外周血。
4.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤I)中固定液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的2% (w/v)多聚甲醛溶液，加入固定液体积为起始外周血样品体积的5倍。
5.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤4)中破膜剂为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的O. 04% (v/v) Triton-100溶液，加入破膜剂的体积为起始外周血样品体积的5倍。
6.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤3)、6)、7)、9)、10)、12)、13)中洗液为磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)的缓冲液，加入洗液体积为起始外周血样品体积3-5倍。
7.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤8)中目标蛋白质为外周血有核细胞胞内(包括细胞浆和细胞核)表达的蛋白质，特异性抗体为能用于细胞免疫荧光标记的抗体。
8.如权利要求I或2所述的方法，其特征是步骤11)中第二抗体为可识别步骤8)中的特异性抗体的抗体。
9.如权利要求I或2所述的方法其特征是步骤14)中检测缓冲液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH = 7. 2)中的1% (w/v)多聚甲醛溶液。
全文摘要
本发明涉及外周血有核细胞胞内蛋白质的检测方法，该方法先利用固定液将有核细胞固定，再利用破膜剂对有核细胞破膜的同时裂解红细胞，简化实验步骤，提高红细胞裂解效果。
文档编号G01N33/68GK102914657SQ20121037998
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者王治东, 陈英, 张学清 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所