专利名称：一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法
技术领域：
本发明属于植物形态学领域，更具体地说，本发明涉及一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法。
背景技术：
在植物有性生殖过程中，花粉粘附在柱头的表面是一个关键的步骤。长期以来，对授粉后花粉与柱头之间的粘附力的研究是一个空白。现在还没有一种成熟的测定授粉后花粉与柱头之间的结合力的方法。但是，在实际的繁种过程中常常遇到 阴雨天，这种天气常常被认为不适宜进行授粉操作。人们常常担心雨水会将刚授粉的柱头表面的花粉冲涮下来，造成授粉失败。建立测定植物花粉与柱头之间的粘附力的方法就是为了给在实际的繁种过程中提供一个可靠、准确的方法，为实际的授粉操作提供一个科学的依据。从而打消某些不利的授粉的天气的疑惑。不仅如此，在实际的杂交授粉过程中，常常会用到某些介质花粉，而建立这种测定方法也可以更好的检验其对花粉与柱头之间的粘附力是否有益？为今后开发更多更好的适用于不良天气下的介质花粉的开发提供一个可靠、科学的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测量结果准确、重复性好、简便易行的离心法测定花粉与柱头粘附力的方法。本发明的目的是这样实现的(除非另有说明外，本发明所采用的百分数均为质量百分数)
一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤
A、花粉密度测定用密度梯度离心法测定花粉密度；
B、离心液配制将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用；
C、授粉柱头固定将待测柱头切下l(Tl5mm长一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3 5min ；
D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察在Γ30 下，将经质量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度gass，离心处理5 20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度
g加速度；
D、粘附力计算花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算
f. \ r J 1 g .Y:.隻:f -!*、-Ji- ' J -im Λ g %.眷舞(< d mm J 1 -a-1, n
其中
-测定温度下鹿糖溶液的密度g/ml ；—花粉的密度g/ml ；
Via—花粉的体积ml ；
g加速度——花粉被离心洗脱时的重力加速度m/s2。本发明所述的离心法用于测定花粉与柱头间的粘附力，具有以下优点
1、测量精度高；
2、重复性好；
3、简便易行；
4、检测快速。
图I为本发明测定方法的流程框 图2为质量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线；
图3为质量百分比60%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线；
图4为质量百分比50%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度标准曲线；
图5为质量百分比55%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度标准曲线；
图6为质量百分比60%的蔗糖溶液中N. repanda花粉的吸光度标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图与实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤
A、花粉密度测定用密度梯度离心法测定花粉密度；
B、离心液配制将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用；
C、授粉柱头固定将待测柱头切下l(Tl5mm长一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3 5min ；
D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察在Γ30 下，将经质量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度gass，离心处理5 20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度
g加速度；
E、粘附力计算花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算
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其中
-测定温度下鹿糖溶液的密度g/ml ；
—花粉的密度g/ml ；
Via—花粉的体积ml ；
g加速度——花粉被离心洗脱时的重力加速度m/s2。
步骤A所述密度梯度离心法测定花粉密度，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括
a、蔗糖浓度梯度溶液配制将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比分别为2(Γ70%的溶
液；
b、花粉样品处理将蔗糖溶于水中，配置成质量百分比为10%的溶液，称取O. 001 O. Olg待测花粉混合在100 1000 μ I 10%蔗糖溶液中；
C、花粉样品铺放将含有花粉样品的10%蔗糖溶液注入离心管底部；
d、密度梯度离心液配制采用层铺法将质量百分比2(Γ70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，配置成密度梯度离心液；
e、离心沉降在离心机中，20°C下，以400(Tl0000rpm速度，对含待测花粉样品的密度梯度离心液离心5 15min，待花粉达到沉降平衡后静置；
f、绘制吸光度标准曲线选取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度的蔗糖溶液中的吸光度标准曲线；
g、测定吸光度值取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值；
h :花粉密度计算花粉的密度按照下列公式计算
权利要求
1.一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤 A、花粉密度测定用密度梯度离心法测定花粉密度； B、离心液配制将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用； C、授粉柱头固定将待测柱头切下1(Γ15_长的一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3 5min ； D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察在Γ30 下，将经质量百分比O.0Γ1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度gass，离心处理5 20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度； D、粘附力计算花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算
2.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤A所述密度梯度离心法测定花粉密度，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括 a、蔗糖浓度梯度溶液配制将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比分别为2(Γ70%的溶液； b、花粉样品处理将蔗糖溶于水中，配置成质量百分比为10%的溶液，称取O.001 O. Olg待测花粉混合在100 1000 μ I 10%蔗糖溶液中； C、花粉样品铺放将含有花粉样品的10%蔗糖溶液注入离心管底部； d、密度梯度离心液配制采用层铺法将质量百分比2(Γ70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，配置成密度梯度离心液； e、离心沉降在离心机中20°C下以400(Tl0000rpm速度，对含待测花粉样品的密度梯度离心液离心5 15min，待花粉达到沉降平衡后静置； f、绘制吸光度标准曲线选取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度的蔗糖溶液中的吸光度标准曲线； g、测定吸光度值取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值； h :花粉密度计算花粉的密度按照下列公式计算ρ=Σ ITODrrODXPa)其中 P——花粉的密度； ODn——第η层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值； OD—所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和； P η—第η梯度蔗糖溶液密度。
3.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤C所述固定方法为利用重金属丝缠绕在包裹有薄膜的授粉柱头上，使之能够沉入到盛有高密度蔗糖溶液的离心管的底部。
4.如权利要求3所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于所述重金属丝的密度大于离心液的密度，直径5(Γ200 μ m,缠绕长度l(T50cm。
5.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤B、C所述离心管可根据离心机转子要求选用1.5mf50ml的离心管。
6.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤D所述的水溶性苯丙胺蓝的质量百分比O. O P/Γο. 1%。
7.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤D所述的离心温度为4°C 30°C。
8.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤D所述的离心时间为5mirT20min。
9.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤D所述的离心机为Microfuge 22R台式微量冷冻离心机。
10.如权利要求I所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于步骤D所述的显微镜为Carl Zeiss Axioimager Al紫外突光显微镜。
全文摘要
本发明公开了一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱、荧光显微镜观察、粘附力计算等步骤。首先用密度梯度离心法测定花粉密度，其次配置质量百分比为70%的蔗糖溶液作为离心液，然后将待测的授粉柱头固定在离心管底部，在4~30℃下，将经质量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中洗脱5~20min，显微镜下观察待测授粉柱头上花粉被洗脱时的离心加速度，根据下列公式计算花粉与柱头间的粘附力本发明可用于各种花粉与柱头粘附力的测量，测量精度高，重复性好，简便易行。
文档编号G01N19/04GK102879328SQ201210398538
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者姚恒, 马文广, 郑昀晔, 牛永志, 索文龙, 宋碧清, 李元君 申请人:云南省烟草农业科学研究院, 玉溪中烟种子有限责任公司