专利名称：一种生物标记物-蚯蚓体内cyp3a4活性的测定方法
技术领域：
本发明涉及生物标记物的检测，具体地说是一种生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法。
背景技术：
CYP3A4是细胞色素P450 (CYP)酶系的一类同工酶，即亚酶，属于CYP酶系中含量最为丰富的酶之一，在人类肝脏和肠道的CYP系统中占据主要的地位，对许多外源物质的代谢解毒发挥着至关重要的作用，可参与大约38个类别共150多种药物的代谢，约占全部药物的50%，在临床医学、医药学等领域广泛应用(文献I.冷欣夫，邱星辉.细胞色素P450酶系的结构、功能与应用前景·科学出版社.2001:P2 ;文献2.Belle，DJ，et al. (2002). Theeffects of an oral contraceptive containing ethinyloestradioI and norgestrelon CYP3A activity. British Journal of Clinical and Pharmacology. 53:p. 67-74.)。从环境科学的角度来看，CYP酶系是很多污染物的特异性诱导剂或抑制剂。利用生物代谢过程中CYP酶活性与污染物毒性之间显著的响应关系，可将CYP酶系作为生物标记物，进行环境污染的早期诊断(文献3. Andersson, T. and L. Forlin, RE⑶LATION OF THECYT0CHR0ME-P450ENZYME-SYSTEM IN FISH. Aquatic Toxicology,1992. 24(1-2):p. 1-19.文献 4. Bucheli, T. D. and K. Fent, INDUCTION OF CYT0CHR0ME-P450AS A BIOMARKERFOR ENVIRONMENTAL ⑶ΝΤΑΜΙΝΑΤΙ0Ν IN AQUATIC E⑶SYSTEMS. Critical Reviews inEnvironmental Science and Technology, 1995. 25 (3) :p. 201-268. ) 在众多的 CYP 亚酶中，环境科学家对CYPlAl的研究最为青睐，近年来进行了大量的研究，涉及的污染物包括多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)、二噁英类(IODD)及重金属等(文献5. Ueng，Y.F. , et al. , Effects of cadmium and environmental pollution on metallothioneinand cytochrome P450in Tilapia. Bulletin of Environmental Contamination andToxicology, 1996. 57(1) :p. 125-131)，主要采用EROD活性的方法对环境污染物诱导下鱼类肝脏中CYPlAl活性的变化进行研究，以此作为生物标记物监测水生环境的污染状况。如王咏等测定了 PAHs诱导下鲤鱼肝微粒体EROD的活性变化，以此进行水体污染早期诊断的研究(文献6.王咏，王春霞，徐静波.多环芳烃化合物对鲤鱼肝微粒体EROD的体外诱导.环境科学学报.2000. 20 (增刊)p. 176-180)。而对CYP3A4的研究主要集中在药物代谢及其相互作用的机理方面(文献7. Afshar, M. and ff. Thormann, Capillaryelectrophoretic investigation of the enantioselective metabolism of propafenoneby human cytochrome P-450SUPERS0MES Evidence for atypical kinetics by CYP2D6andCYP3A4. Electrophoresis, 2006. 27 (8):p.1526-1536 ;文献 8. Araki, N. , et al. , HumanCYP3A4_introduced HepG2cells: In vitro screening system of new chemicals forthe evaluation of CYP3A4_inhibiting activity. Xenobiotica, 2008.38 (11):p.1355-1364 ;文献 9. Boobis, A. R.，et al. , Interlaboratory comparison of the assessmentof P450activities in human hepatic microsomal samples. Xenobiotica, 1998. 28(5):p. 493-506 ;文献 10.Choi，I.，et al. , Classification models for CYP450 3A4inhibitors and non-inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry,2009. 44(6) :p. 2354-2360 ；文献 11. Falzoi，Μ·，et al.，Multiplex genotyping ofCYP3A4，CYP3A5，CYP2C9 and CYP2C19 SNPs using MALDI-T0F mass spectrometry. Pharmacogenomics, 2010. 11(4) :p. 559-571.)，有关环境污染物对CYP3A4活性影响的研究至今未见报道。作为分布广泛、含量如此丰富的一种CYP酶，准确地评价CYP3A4活性与污染物之间的响应关系将对环境污染的生态毒理研究具有重要的意义。有关土壤污染早期诊断的生物标记物研究近年来受到越来越多的关注。与传统毒理方法相比，生物标记物可以提供污染物对生物体健康潜在影响的更为全面的生物相关信息(文献 12. Calisij A. , M. G. Lionettoj and T. Schettinoj Biomarker responsein the earthworm Lumbricus terrestris exposed to chemical pollutants.Science of The Total Environment, 2011. 409(20) :p. 4456-4464.)，因此，可以作为土壤污染监测的敏感指标起到早期的预警作用。蚯蚓在土壤中分布广泛，约占土壤总生物量的 60%_80% (文献 13. Saint-Denis，M.，et al.，Biochemical responses of theearthworm Eisenia fetida andrei exposedto contaminated artificial soil: effectsofbenzo (a)pyrene. Soil Biology&Biochemistry,1999. 31 (13):p. 1837-1846. ) 它能够与土壤中的孔隙水直接接触，进而与土壤中污染物的生物有效态直接接触，因此常将其作为土壤生态毒理评价的模式生物(文献14. van Gestelj C. A. Μ.，et al.，Effectsof metal pollution on earthworm communities in a contaminated floodplainarea:Linking biomarker, community and functional responses. EnvironmentalPollution，2009. 157(3) :p. 895-903 ;文献 15. DJ，S.，W. JM，and V. G. C. A. M. , Asummaryof eleven years progress in earthworm ecotoxicology PED0BI0L0GIA，2003. 47:p.588-606.)，对于土壤环境监测具有重要的作用(文献16. Manerikarj R. S.，A. A. Aptej andV. S. Gholej In vitro and in vivo genotoxicity assessment of Cr (VI) using cometassay in earthworm coelomocytes. Environmental Toxicology and Pharmacology,2008. 25 (I) : p. 63-68 ;文献 17. Reineckej S. A. and A. J. Reineckej The comet assay asbiomarker of heavy metal genotoxicity in earthworms. Archives of EnvironmentalContamination and Toxicology,2004. 46(2):p. 208-215 ；文献 18. Massicotte，R.，etal.，Immunotoxicological response of the earthworm Lumbricus terrestrisfollowing exposureto cement kiln dusts. Ecotoxicology and Environmental Safety,2004. 59(1) :p. 10-16.)。目前，蚯蚓的毒理诊断试验多利用其在不同污染状态下生存、生长和繁殖等个体水平上的响应(如蚯蚓急性致死率和慢性体重抑制率等)来反映环境状况。然而，随着生态毒理诊断研究的深入开展，这些指标已不能满足低剂量污染条件下毒理诊断的需要，寻求更为敏感的生物标记物是土壤生态毒理学研究向细胞、分子水平发展的新的重要内容，也是生态风险评价的基本要素。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，I)将蚯蚓微粒体溶解在2 3ml保存缓冲液中混匀，待用；2)取20 30 μ I步骤I)的微粒体溶液并加入120 140 μ I反应液和10 30 μ I底物液混匀，混匀后于25 35°C预热5 lOmin，预热后再加入20 40 μ INADPH溶液反应2(T30min后加入10(Γ 20μ I预冷的甲醇终止反应；3)将步骤2)中的产物混合液混匀，在T5°C以400(T5000rpm离心l(T20min，上清
液用于测定产物含量。所述步骤3)离心收集的上清液用于测定产物含量，以单位时间内每毫克微粒体蛋白生成的产物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。所述产物含量的测定是采用HPLC法，流动相为甲醇和水，按体积比为40:60 60:40，流速 Γ1. 5ml/min，检测波长为 250 260nm。所述步骤I)中保存缓冲液组成为250mmol/L鹿糖,50mmol/L Tris pH7. 5, lmmol/L DTT, lmmol/L EDTA，20% 甘油。将蚯蚓微粒体溶解在2 3ml保存缓冲液中混匀，混匀后取出30(Γ500 μ I用于测定蛋白含量，其余部分于-7(T-80°C中保存待用。所述步骤2)中反应液的组成为0. f0. 15mol/L磷酸钾缓冲溶液(1^#04与K2HPO4) pH7. 4,4 5mmol/L 葡萄糖-6-憐酸，4 5mmol/LMgCl2,0. 5 lU/ml 葡萄糖-6-憐酸脱氢酶。所述步骤2)中底物液为0. 5 lmmol/L的睾酮溶液。所述睾酮用乙腈溶解，再用磷酸钾缓冲溶液进行稀释。本发明所具有的优点本发明参考鼠肝微粒体CYP3A4的实验方法，首次对蚯蚓体内CYP3A4活性进行了尝试测定，经过大量的探索与改进，最终建立了蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法；本发明简单、快速、低耗、灵敏度高。CYP3A4在生物体内分布广泛、含量丰富，采用本发明方法可将蚯蚓体内CYP3A4活性准确测定，同时可以得出，蚯蚓体内的CYP3A4活性可以被污染物诱导，具有作为土壤污染生态毒理诊断的生物标志物的潜能。
图I为本发明实施例提供的底物睾酮和产物6 β -羟基睾酮的色谱图(I为6 β -羟基睾酮；2为睾酮)。
具体实施例方式实施例I 利用本方法测定蚯蚓体内CYP3A4活性，按如下步骤操作I)将实验用蚯蚓用蒸馏水洗净后用滤纸吸干，于20°C培养条件下在湿润的滤纸上放置24h，使其排净体内的物质。将排净体内物质后的体蚯蚓在4°C甘油溶液(20%)中浸泡IOmin后，以内脏为试验材料进行蚯蚓微粒体蛋白含量的测定。内脏用大量0. 15mol/L KCl溶液清洗，直至洗脱液为无色。洗净后，滤纸吸干并转移到2ml保存缓冲液中，采用玻璃组
5织研磨器将其细胞破碎。于低温4°C超速离心机上以12800rpm离心30min，取上清液备用。取出400 μ I微粒体溶液，采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白的含量，其余部分于-70°C中保存待用。其中，所用的保存缓冲液组成为250mmol/L蔗糖，50mmol/L Tris pH 7. 5, lmmol/L DTT, lmmol/L EDTA，20%甘油。保存缓冲液的作用为控制pH的变动在一定范围内，防止酶失活；加入20%甘油的目的也是为了防止细胞色素P450酶系在制备时失活；此步骤中，于-70°C低温冰箱中保存微粒体溶液的目的为可以避免酶活性在短期内失活，保证测定时酶活性的稳定。2)在离心管中依次加入120 μ I反应液，30 μ I底物液及30 μ I步骤I)中的微粒体溶液混合均匀，混合后用枪头抽吸后于25° C预热5min，预热后加入40 μ I NADPH溶液启动反应，反应20min后加入100μ I预冷的甲醇终止反应。其中，反应液的组成为0. lmol/L磷酸钾缓冲溶液PH7. 4，4. 8mmol/L葡萄糖-6-磷酸，4. 8mmol/L MgCl2,0. 6U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。底物液为0. 6mmol/L的睾酮溶液，所述睾酮用乙腈溶解，再加入磷酸钾缓冲溶液稀释至所需浓度，溶剂含量不高于0. 1% (目的为避免过多的有机溶剂影响酶活性，含量小于0. 1%的有机溶剂对CYP3A4酶活性的影响可以忽略不计)。此步骤中，100%甲醇应提前于-20°C预冷20min，其目的为使酶促反应迅速停止，保证反应终点的准确性；枪头抽吸混匀的目的为既可以使反应液、底物及微粒体充分混匀，又避免仪器混匀时对酶活性的破坏。3)将步骤2)中的产物混合液于涡旋混合器中混匀5s，在低温4°C离心机上以5000rpm离心lOmin，小心转移上清液于进样瓶中，即刻测定产物含量，产物含量的测定是采用 HPLC 法，采用 C18 反相色谱柱(5 μ m, 4. 6mm ID X 250mm, Vydac 201TP54，USA)，流动相为甲醇和水，按体积比为50:50,流速I. 5ml/min,运行8min,柱温为25°C,检测波长为254nm,标准物质出峰时间为2min左右(参见图I)。以单位时间内每毫克微粒体蛋白生成的产物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。结果参见表1，其样品编号为样品组11，对照组10，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。实施例2与实施例I不同之处在于将微粒体溶解在3ml保存缓冲液中混匀；于_80°C低温冰箱中保存微粒体溶液；其它步骤及参数与实施例I相同。结果参见表1，其样品编号为样品组21，对照组20，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。实施例3与实施例I不同之处在于在离心管中依次加入130 μ I反应液，20 μ I底物液及25 μ I步骤I)中的微粒体溶液，枪头抽吸混匀后于30°C预热5min，加入30 μ I NADPH溶液启动反应，反应25min后加入100 μ I预冷的甲醇终止反应。其它步骤及参数与实施例I相同。结果参见表1，其样品编号为样品组31，对照组30，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。实施例4与实施例I不同之处在于在离心管中依次加入140 μ I反应液，10 μ I底物液及20 μ I步骤I)中的微粒体溶液，枪头抽吸混匀后于35°C预热5min，加入20 μ I NADPH溶液启动反应，反应30min后加入120 μ I预冷的甲醇终止反应。其它步骤及参数与实施例I相同。结果参见表1，其样品编号为样品组41，对照组40，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。实施例5与实施例I不同之处在于将步骤2)中的产物混合液于涡旋混合器中混匀5s，在低温4°C离心机上以4000rpm离心15min，小心转移上清液于进样瓶中，即刻测定产物含量。其它步骤及参数与实施例I相同。结果参见表1，其样品编号为样品组51，对照组50，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。表I不同条件下蚯蚓CYP3A4的活性
权利要求
1.一种生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于1)将蚯蚓微粒体溶解在2 3ml保存缓冲液中混匀，待用；2)取20 30μ I步骤I)的微粒体溶液并加入120 140 μ I反应液和10 30 μ I底物液混匀，混匀后于25 35°C预热5 lOmin，预热后再加入20 40 μ INADPH溶液反应2(T30min后加入10(Γ 20μ I预冷的甲醇终止反应；3)将步骤2)中的产物混合液混匀，在T5°C以400(T5000rpm离心l(T20min，上清液用于测定产物含量。
2.按权利要求I所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述步骤3)离心收集的上清液用于测定产物含量，以单位时间内每毫克微粒体蛋白生成的产物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。
3.按照权利要求2所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述产物含量的测定是采用HPLC法，流动相为甲醇和水，按体积比为40:6(Γ60:40，流速I. 5ml/min，检测波长为25(T260nm。
4.按权利要求I所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述步骤I)中保存缓冲液组成为250mmol/L鹿糖,50mmol/L Tris pH 7. 5, lmmol/L DTT,lmmol/L EDTA，20% 甘油。
5.按权利要求I所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于将蚯蚓微粒体溶解在2 3ml保存缓冲液中混匀，混匀后取出30(Γ500μ I用于测定蛋白含量，其余部分于-7(T-80°C中保存待用。
6.按权利要求I所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述步骤2)中反应液的组成为0. Γ0. 15mol/L磷酸钾缓冲溶液pH7. 4，r5mmol/L葡萄糖-6-磷酸,4 5mmol/LMgCl2,0. 5 lU/ml葡萄糖_6_磷酸脱氢酶。
7.按权利要求I所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述步骤2)中底物液为0. 5 lmmol/L的睾酮溶液。
8.按权利要求7所述的生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法，其特征在于所述睾酮用乙腈溶解，再用磷酸钾缓冲溶液进行稀释。
全文摘要
本发明涉及生物标记物的检测，具体地说是一种生物标记物-蚯蚓体内CYP3A4活性的测定方法。具体为将蚯蚓微粒体溶解在2~3ml保存缓冲液中混匀，待用；取20~30μ微粒体溶液并加入120~140μl反应液和10~30μl底物液混匀，混匀后于25~35℃预热5~10min，预热后再加入20~40μlNADPH溶液反应20~30min后加入100~120μl预冷的甲醇终止反应；将产物混合液混匀，在3~5℃以4000~5000rpm离心10~20min，上清液用于测定产物含量。本发明测定方法简单、快速、低耗、灵敏度高。
文档编号G01N30/02GK102937629SQ20121043141
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者曹秀凤, 宋玉芳 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所