一种b类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备方法
【专利摘要】一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂条的制备与使用方法，属于生物及食品安全检测【技术领域】。本发明涉及应用可特异性识别B类单端孢霉烯族毒素抗体来制备一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂条及其使用。其目的是为实现我国粮食谷品中B类单端孢霉烯族毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。这种新型免疫速测产品的研制，不仅帮助解决因毒素标准品来源困难而影响检测这一难题，而且降低了检测成本，更为检测人员提供了安全的检测条件，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好、安全、环保等优点。
【专利说明】一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备
【技术领域】
[0001]一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备与使用方法，属于生物及食品安全检测【技术领域】。
【背景技术】 [0002]B类单端孢霉烯族毒素是一类由镰刀菌属类真菌产生的代谢物，在自然界分布极为广泛，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，是自然发生的最危险的食品污染物，对人畜危害十分严重。它不但引起人畜急慢性中毒，还具有致癌、致畸、致突变的潜在危险。B类单端孢霉烯族毒素主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-DON，3-Ac_D0N)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-D0N, 15-々(:-0010、雪腐键刀菌烯醇(11；[￥3161101,1^1\0和键刀菌酮(fusarenonX，FUS-X )等。
[0003]B类单端孢霉烯族毒素是一类全球性的谷物污染物，在多重谷物(小麦、玉米、燕麦、大麦、黑麦)、谷物制品(面包、啤酒、谷物类早餐)和饲料中均有检出。
[0004]Muller等对德国西南部小麦的B类单端孢霉烯族毒素污染状况进行了调查，从79个农场中抽取了 84个样品，结果样品中B类单端孢霉烯族毒素D0N、3-Ac-D0N、NIV,5-Ac-DON、15-Ac-DON、FUS-X 的污染率分别为 96%、59%、26%、15%、9%、7% 平均污染水平为1632、7、9、5、9、10 μ g/kg，最大污染水平为 20538、18、32、14、21、33 μ g/kg。
[0005]1998年，Schollenberger等从德国西南部地区市场上随机抽取了 237个谷类食品，包括面包、面条、谷类早餐、婴幼儿食品、大米等，进行了 B类单端孢霉烯族毒素污染的调查，所有样品中，D0N、3-Ac-D0N、NIV、5-Ac_D0N、15-Ac-DON 的污染率分别为 71%、4%、2%、4%、3%，平均污染水平为103、17、109、20、24 μ g/kg而FUS-X在样品中没有检测到。
[0006]目前B类单端孢霉烯族毒素的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层层析发(TLC)等，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员吧、检测费用昂贵，不利于推广应用。
[0007]金免疫层析技术(Gold immunochromatography,GICA)是一种将纳米金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。纳米金标记抗体的技术在临床检验上已得到广泛和成功的运用，如早早孕(HCG)检测试纸，乙肝表面抗原(HbsAg)检测试纸。而纳米金技术检测小分子化合物也有成功的产品，去吗啡纳米金检测试剂盒和瘦肉精纳米金检测试剂盒等。另外国内外已有B类单端孢霉烯族毒素抗体的制备文献报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备与使用方法，其目的是为实现我国粮食谷品中B类单端孢霉烯族毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。[0009]本发明的技术方案:一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备方法，速测试剂板由上下两块塑料模板及试剂条两部分组成。试剂条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分组成；样品垫和样品吸收垫为:吸水纸；金标垫为:用胶体金和B类单端孢霉烯族毒素抗体结合制成金标抗体，结合过程为:将50 mL浓度为I X 10_4 g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾，然后迅速加入1.5 mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15 min得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1:1体积比的比例逐滴加入到胶体金中，变加变搅拌，反应5 min后即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A54tl=L 0的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用硝酸纤维素膜为:用自动点样仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被B类单端孢霉烯族毒素抗原一BSA，浓度为Img/mL为检测线,线段横线包被羊抗鼠IgG,浓度为2 mg/mL为质控线,包被检测线和质控线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用0.1 mo I/L的BSA的pH7.4的PBS溶液浸泡30 min进行封闭处理，干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分一次相互叠加粘贴于试剂板上，以一定宽度切条后即为B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂条。塑料板起固定试剂条及标示功能区(加样孔、测试区、质控区)的作用，将制备好的试剂条按照样品吸收垫在加样孔一端这一正确方向卡在下块塑料模板的卡槽中，然后按照加样孔与吸水纸在同一端的原则盖上上块塑料模板即为B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板。
[0010]B类单端孢霉烯族毒素抗体可以特异性识别B类单端孢霉烯族毒素。
[0011]样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、和吸水垫各部分之间有1-2 mm的重叠。
[0012]所制备的B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的应用方法:
(1)检测小麦、玉米或稻谷:
准确称取5 g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25 mL体积浓度为10%的甲醇水溶液作为提取液，震荡10 min,以定性滤纸快速过滤，收集滤液，取滤液用试剂板进行分析；
(2)检测啤酒或麦芽:
取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2，直至不产生明显的气泡，静置后用试剂板检测分析；麦芽汁样品直接用试剂板进行检测分析；
(3)检测面包或蛋糕:
用粉碎机将样品粉碎，室温保存，称取20 g粉碎式样，置于200 mL具塞锥形瓶中，加入8 mL水和100 mL二氣甲烧一无水乙醇，二氣甲烧一无水乙醇的体积比为8:2，密塞,在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡I小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25 mL滤液于75 mL玻璃蒸发皿中，置于90°C水浴上通风挥干，用50 mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20 mL甲醇水，甲醇:水体积为8:2，分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇分液漏斗1.5 min，静置15 min后使分层，将下层甲醇水提取液进行样品检测。不要将两项交界处的白色絮状物放入柱内。
[0013]本发明的有益效果:本发明对B类单端孢霉烯族毒素各类型的交叉反应率分别在100%左右，而对其他毒素类的交叉反应率均低于1% ;本发明涉及应用可特异性识别B类单端孢霉烯族毒素抗霉烯族毒素抗原复合物、羊抗鼠IgG以条带状分别包被于硝酸纤维素膜的检测区(T)和质控区(C)，用纳米金标记另一株抗体，并将其吸附于金标垫上，成功建立了快速、特异、灵敏的检测B类单端孢霉烯族毒素抗原的纳米金免疫层析试剂板(GICA)。本发明为实现我国粮食谷品中B类单端孢霉烯族毒素的快速检测开辟了广泛的应用前景。这种新型免疫速测产品的研制，不仅帮助解决因毒素标准品来源困难而影响检测这一难题，从而降低了检测成本；更为检测人员提供了安全的检测条件，具有简便、快速、特异性好、灵敏度高、安全、环保等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1 B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板检测示意图，A阴性显示，B阳性显示，C无效显示
图2 B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板组合示意图，1:样品垫 2:PVC底板3:检测线(C线)(羊抗鼠多抗)4:NC膜(硝酸纤维素膜)5:吸水滤纸6:对照线(T线)7:胶体金垫
【具体实施方式】
[0015]B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板制备如上述技术方案所述。
[0016]实施例1小麦中B类单端孢霉烯族毒素检测:
1)前处理:
准确称取5 g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25 mL体积浓度为10%的甲醇水溶液作为提取液，震荡10 min,以定性滤纸快速过滤，收集滤液，取滤液用试剂板进行分析；
2)B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板产品的使用方法:
取样品滤液100 UL缓慢滴加于试剂板的玻璃纤维膜上，15 min后观察试剂板上检测线(T线)、对照线(C线)的显色情况。根据试剂板的检测原理来限量判定样品提取液中B类单端孢霉烯族毒素的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于I U g/g)，B类单端孢霉烯族毒素超标；若出现两条红色色带出现则判定样液为阴性(小于I U g/g),B类单端孢霉烯族毒素没有超标；若无色带出现则该试剂板失效。
[0017]实施例2啤酒中B类单端孢霉烯族毒素检测 I)前处理:
取10 mL的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2，直至不产生明显的气泡，静置后用试剂板检测分析；
2) B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板产品的使用方法:
取样品滤液100 u L缓慢滴加于试剂板的玻璃纤维膜上，15min后观察试剂板上检测线(T线)、对照线(C线)的显色情况。根据试剂板的检测原理来限量判定样品提取液中B类单端孢霉烯族毒素的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于I U g/g), B类单端孢霉烯族毒素超标；若出现两条红色色带出现则判定样液为阴性(小于I U g/g), B类单端孢霉烯族毒素没有超标；若无色带出现则该试剂板失效。
[0018]实施例3饲料中B类单端孢霉烯族毒素检测
I)前处理:
用粉碎机将样品粉碎，室温保存，称取20 g粉碎式样，置于200 mL具塞锥形瓶中，加入8 mL水和100 mL二氣甲烧一无水乙醇，二氣甲烧一无水乙醇的体积比为8:2，密塞,在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡I小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25 mL滤液于75 mL玻璃蒸发皿中，置于90°C水浴上通风挥干，用50 mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20 mL甲醇水，甲醇:水体积为8:2，分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇分液漏斗1.5 min，静置15 min后使分层，将下层甲醇水提取液进行样品检测。不要将两项交界处的白色絮状物放入柱内；
2)B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板产品的使用方法:
取样品滤液100 UL缓慢滴加于试剂板的玻璃纤维膜上，15 min后观察试剂板上检测线(T线)、对照线(C线)的显色情况。根据试剂板的检测原理来限量判定样品提取液中B类单端孢霉烯族毒素的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性(大于I U g/g), B类单端孢霉烯族毒素超标；若出现两条红色色带出现则判定样液为阴性(小于I U g/g), B类单端孢霉烯族毒素没有超标；若无色带出现则该试剂板失效。
【权利要求】
1.一种B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的制备方法，其特征如下:速测试剂板由上下两块塑料模板及试剂条两部分组成。
2.试剂条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分组成；样品垫和样品吸收垫为:吸水纸；金标垫为:用胶体金和B类单端孢霉烯族毒素抗体结合制成金标抗体，结合过程为:将50 mL浓度为I X 1(T4 g/mL的氯金酸溶液加热到沸腾,然后迅速加入1.5 mL柠檬酸三钠，继续加热搅拌反应15 min得到胶体金溶液，然后将抗体溶液以1:1体积比的比例逐滴加入到胶体金中，变加变搅拌，反应5 min后即得到金标抗体溶液，将制备好的金标抗体调成A54tl=L O的浓度，分散在玻璃纤维滤膜上，自然干燥后即为金标垫备用；所用硝酸纤维素膜为:用自动点样仪对硝酸纤维素膜进行检测试剂线性包被，下端横线包被B类单端孢霉烯族毒素抗原一BSA,浓度为I mg/mL为检测线,线段横线包被羊抗鼠IgG,浓度为2 mg/mL为质控线，包被检测线和质控线后的硝酸纤维素膜自然干燥后用0.1 mol/L的BSA的pH7.4的PBS溶液浸泡30 min进行封闭处理,干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸收垫四部分一次相互叠加粘贴于试剂板上，以一定宽度切条后即为B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂条；塑料板起固定试剂条及标示功能区(加样孔、测试区、质控区)的作用，将制备好的试剂条按照样品吸收垫在加样孔一端这一正确方向卡在下块塑料模板的卡槽中，然后按照加样孔与吸水纸在同一端的原则盖上上块塑料模板即为B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板。
3.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于B类单端孢霉烯族毒素抗体可以特异性识别B类单端孢霉烯族毒素。
4.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、和吸水垫各部分之间有1-2 mm的重叠。
5.如权利要求1所述方法制备的B类单端孢霉烯族毒素半定量速测试剂板的应用方法，其特征是: 1)检测小麦、玉米或稻谷: 准确称取5 g粉碎均匀的样品于三角瓶中，加入25 mL体积浓度为10%的甲醇水溶液作为提取液，震荡10 min,以定性滤纸快速过滤，收集滤液，取滤液用试剂板进行分析； 2)检测啤酒或麦芽: 取一定量的啤酒样品，搅拌，除去过量的CO2，直至不产生明显的气泡，静置后用试剂板检测分析；麦芽汁样品直接用试剂板进行检测分析； 3)检测面包或蛋糕: 用粉碎机将样品粉碎，室温保存，称取20 g粉碎式样，置于200 mL具塞锥形瓶中，加入.8 mL水和100 mL二氣甲烧一无水乙醇，二氣甲烧一无水乙醇的体积比为8:2，密塞,在瓶塞上涂层水，盖严防漏，震荡I小时，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25 mL滤液于75 mL玻璃蒸发皿中，置于90°C水浴上通风挥干，用50 mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20 mL甲醇水，甲醇:水体积为8:2，分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇分液漏斗1.5 min，静置15 min后使分层，将下层甲醇水提取液进行样品检测。
【文档编号】G01N33/558GK103792348SQ201210435324
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜道林, 吴湾湾 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司