硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明的试纸条属于食品安全快速检测领域。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜上包被有硝基咪唑类-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线；结合物释放垫包被有硝基咪唑类的胶体金标记物。该试纸条可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液充分吸收与金标抗体完全接触而充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中的一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
【专利说明】硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。
技术背景
[0002]硝基咪唑类药物是带有硝基的咪唑化合物，为白色或淡黄色结晶，弱碱性，能和酸结合成盐，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于预防和治疗家禽的滴虫病、猪的出血性下痢及厌氧菌感染。畜禽常用的硝基咪唑类药物包括甲硝唑(metronidazole, MNZ)、二 甲硝咪唑(dimertidazole, DMZ)、异丙硝唑(ipronidazole, IPZ)、洛硝唑ronidazole, DMZ)、奥硝唑(omidazole, ONZ)> 赛克硝唑 secnidazole, SCZ)和替硝唑(tinidazole, TNZ)等。这些药物在动物体内通过C2侧链的氧化而被代谢，代谢物与原药具有相似的潜在毒性。硝基咪唑类药物具有三致作用和遗传毒性，其中残留对食品安全构成威胁，因此，在各国该类化合物的使用严格限制。在欧盟，RNZ与1993年，MNZ和IPZ于1998年被禁止用于食品动物，DMZ于1995年被禁止作为兽药使用，但仍可作为饲料添加齐U。2011年11月，欧盟禁止在饲料中投放DMZ作为添加剂。2002年美国食品与药物管理局(FDA)公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11中药物，其中包括了 DMZ及其他硝基咪唑类药物。2003年加拿大公布了新的修改条例，基于缺乏结合残留物的毒性信息，而取消所有5-硝基咪唑类化合物作为药物在食源性动物中的使用。2002年3月，我国也开始对硝基咪唑类药物进行严格控制，农牧发[2002] I号文件中规定在食品动物中禁用DMZ和MNZ，在中华人民共和国农业行业标准NY 5030-2006无公害食品畜禽饲养兽药使用准则NY/T472-2006绿色食品兽药使用准则中规定了禁止以促进生长为目的在所有食品动物中使用MNZ、DMZ及其盐、酯及制剂。对饲料中硝基咪唑类药物的不合理添加而造成的可食源性动物组织中药物残留问题受到世界各国的关注。因此研制灵敏、快速、准确的硝基咪唑类药物的检测方法检测食源性动物组织中是否含有硝基咪唑类药物有着十分重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条。
[0004]本发明的技术方案:
一种硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ II ”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附硝基咪唑类药物的金标抗体玻璃棉，硝基咪唑类药物金标抗体为胶体金标记硝基咪唑类药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白溶液为硝基咪唑类药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA )，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
[0005]本发明的硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条具有以下优点:
(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性；
(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μ I左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果；
(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I ”及“II”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“ I ”印迹表示在被检测样品液中含有喹乙醇代谢物，两条棕红色“ II ”印迹表示在被检样品中不含喹乙醇代谢物，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判；
(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用；
(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1为硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条结构示意图(其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板)。
[0007]图2为硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图(其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线)。
[0008]图3为硝基咪唑类药物快速检测试纸卡阴性(图3.a )、阳性(图3.b)，无效(图
3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。
【具体实施方式】
[0009]制备硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。
[0010]1.硝基咪唑类药物半抗原的合成
称取硝基咪唑类药物0.9 g放在50 mL的圆底烧瓶中；加入IM的NaOH溶液20 mL充分溶解后，放在恒温磁力加热搅拌反应器上，回流反应15h ;向反应液中加入IM HCl使pH值呈中性，此时有沉淀析出，离心，取沉淀，烘干，得到硝基咪唑类药物水解产物①。称取化合物①0.6 g、戊二酸酐0.5 g放在50 mL的圆底烧瓶中；加入20 mL无水吡啶充分溶解后，放在恒温磁力加热搅拌反应器上，回流反应24 h ;用旋转蒸发仪旋蒸，除去毗陡，然后添加30 mL蒸馏水，用乙酸乙酷进行萃取，取有机层；旋转蒸干有机层得黄色油状物，加入乙酸乙酯和石油醚析出晶体，即硝基咪唑类药物半抗原。
[0011]2.硝基咪唑类药物半抗原与载体蛋白的偶联
分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将前述半抗原和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原(用于固定在反应膜上)和免疫原(用于制备单克隆抗体)。
[0012](1)包被原的制备:
①将1Omg步骤I得到的半抗原用0.5mL甲酰胺(DMF )溶解，冷却至10°C，加入氯甲酸异丁酯5 μ 1，10°C搅拌反应30min，即可得到反应液I液；
②称取卵清蛋白(OVA)36mg,使之充分溶解在2mL 50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液II液；其中硝基咪唑类药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为(12-18 ):1 ；
③将反应I液逐滴缓慢滴加到该反应II溶液中，10°C反应4h，4°C过夜。取最终反应物于pH7.4，0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化24 h,3000 g以上离心30 min，收集上清液，即得到包被原。
[0013](2)免疫原的制备:
①将IOmg步骤I得到的半抗原将、10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以及12.5 mg碳化二亚胺(EDC)充分溶解于I mL DMF中，于室温下搅拌24 h，即可得到反应液I液；
②称取血蓝蛋白50mg，使之充分溶解在3 mL 40 mM碳酸钠溶液中，即得到反应液II液，其中硝基咪唑类药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为(8-10):1 ；
③将反应液I液逐滴缓慢滴加到反应液II液中，并于室温下搅拌3h，然后4 °C过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。
[0014]3.抗硝基咪唑类药物单克隆抗体的制备
(1)动物免疫:将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μ g/只，使其产生抗血清；
(2)细胞融合和克隆化:小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7:1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(3)细胞冻存和复苏:将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成IXlO6个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
(4)单克隆抗体的生产与纯化:将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射硝基咪唑类药物的单克隆杂交瘤细胞株5X IO7个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，于_20°C保存。
[0015]4.硝基咪唑类药物金标抗体和金标抗体玻璃棉的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在5(Tl00 mL沸腾的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4 mL的0.5~2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15 nm左右的胶体金。以0.1 mo I/L的K2CO3调胶体金pH至8.5^9.5，置于以1:100(Tl300的标记比将待标记的硝基咪唑类药物单克隆抗体加入PH8.5~9.5的金溶胶中，标记10 min后，加20%PEG 10000至终浓度0.05%,4°C、1500~3000 rpm离心20 min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C, 15000 rpm离心I h,弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获硝基咪唑类药物的胶体金标记抗体。将1:(100-500 )稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4°C低温真空干燥，制备硝基咪唑类药物金标抗体玻璃棉。
[0016]5.羊抗或兔抗小鼠IgG的制备
以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS (pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4°C冰箱2 h，4°C，1200 r/min离心15 min，弃上清;以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4°C冰箱2h，4°C，1200 r/min离心15 min，弃上清，以少量PBS印H7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (pH7.2)过夜透析，换液2~3次，4°C，12000 r/min离心15 min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50-?00 μ g/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3 ^4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于硝基咪唑类药物快速检测试纸条对照显示印迹的制备。
[0017]6.硝基咪唑类药物快速检测试纸条反应原理
(1)当待检样品溶液滴入试纸条加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有硝基咪唑类药物残留，硝基咪唑类药物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的硝基咪唑类药物占据而无法与检测线上硝基咪唑类药物抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“ I ”，呈一条印迹为阳性；相反样本溶液中无硝基咪唑类药物则不能阻止金标抗体与纤维素膜上硝基咪唑类药物抗原偶联载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“ I ”，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“ I ”，形成两条红线“ II ”阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。
[0018](2)硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条的结构，参见图1、图2。图中I为样品吸收垫，用玻璃棉制成，2为结合物释放垫层，根据上述【具体实施方式】4中所述的制备方法，制备吸附有硝基咪唑类药物单克隆抗体的金标抗体纤维层，3为反应膜层，采用硝酸纤维素膜，4为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号1，2，3，4各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条7上，各层交界处纤维互相交叉渗透。5为用偶联硝基咪唑类药物的卵清蛋白(OVA)溶液印上检测印迹“ I ”，6为用羊抗小鼠IgG溶液印上对照印迹“ I ”，两印迹平行排列形成组合印迹带“II”。8-1为覆盖在样品吸收垫层I和金标抗体纤维层2上面的测试样品端白色保护膜，在I和2交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸收垫一侧0.5 cm处印有标记线9,9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4为吸水层(手柄端)上覆盖有其它颜色(如黄色)保护膜8-2。
[0019]7.检测样品液的制备:
(1)取2g动物组织匀浆物于50mL聚苯乙烯离心管中；
(2)加入2mL 0.15-0.25M的氢氧化钠溶液和8 mL乙酸乙酯，充分混匀，室温以3000 g以上的速度离心5-10 min ；
(3)取4mL上层液体吹干，加入I mL正己烷和0.5 mL 0.02 M的PBS缓冲液，混匀，室温以3000 g以上的速度离心离心5 min ；
(4)去除上层正己烷层，取下层液待测。
[0020]8.检测操作方法:从包装袋中取出试纸条，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 μ L)，加样后开始计时，结果应在3-5分钟读取，其他时间判读无效。
[0021]9.检测结果判断:如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“ I ”显示，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品液中含硝基咪唑类药物(如图3b所示)，含量超过国家残留标准的产品不能在市场上流通；如果硝基咪唑类药物快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条红棕色标记“ II ”，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含硝基咪唑类药物成份(如图3a所示)，如未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效(如图3.c所示)。
[0022]
【权利要求】
1.一种硝基咪唑类药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ II ”。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:吸水材料层用吸水纸制成。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜制成。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:金标抗体纤维层用吸附硝基咪唑类药物的金标抗体玻璃棉，硝基咪唑类药物金标抗体为胶体金标记的硝基咪唑类药物单克隆抗体或多克隆抗体，偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白溶液为硝基咪唑类药物与载体蛋白偶联的复合溶液。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5 cm处。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是:偶联硝基咪唑类药物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或为鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白
【文档编号】G01N33/558GK103792349SQ201210435614
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜道林, 邢海龙 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司