串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法
【专利摘要】本发明属生物检测领域，涉及一种串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向参考线和检测线，所述检测线包被有串珠镰刀菌素-牛血清白蛋白偶联物，参考线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗串珠镰刀菌素单克隆抗体，所述抗串珠镰刀菌素单克隆抗体由杂交瘤细胞株产生。该试纸条用于检测串珠镰刀菌素，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。
【专利说明】串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及食品中残留物质的检测方法，特别是一种串珠镰刀菌素胶体金试纸条的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002]串珠镰刀菌素是某些镰刀菌的代谢产物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠镰刀菌的培养物中提取出来的，而被命名为串珠镰刀菌素串珠镰刀菌素。该菌素为水溶性，对动物各器官，特别对心血管有极强的毒性作用。串珠镰刀菌的化学名为3，4_ 二酮-1-羟基环丁烯，自然界中以钠盐或钾盐的方式存在。它是淡黄色针状结晶，具有水溶性。串珠镰刀菌素的毒性很强，小鸡经口 LD5tl为4.0mg/kg。急性中毒的大鼠可导致进行性肌肉衰弱。呼吸困难，发绀，昏迷和死亡。有人认为某些疾病与摄食玉米有关。该毒素的毒理作用是选择性抑制氧化戊二酸盐脱氢酶和丙酮酸盐脱氢酶系统。Wilson等发现了串珠镰刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和饲料中，串珠镰刀菌素的检测方法有薄层色谱法，气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法，由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，对样品经过简单处理即可检测的串珠镰刀菌素快速试纸半定量检测方法。
[0004]本发明的目的可通过以下技术方案来实现:
串珠镰刀菌素胶体金试纸条检测方法其技术要点是:试纸的背衬上依次贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，金标垫上标记的物质为第二种属动物蛋白与串珠镰刀菌素检测用抗原的混合物或第二种属动物蛋白与串珠镰刀菌素抗体的混合物；硝酸纤维素膜上包被有串珠镰刀菌素抗体I条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG I条作为参考线或包被有串珠镰刀菌素检测用抗原I条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的工IgG I条作为参考线。在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。
[0005]所述的检测用抗原是指串珠镰刀菌素与载体物质明胶形成的偶合物，免疫用抗原是指串珠镰刀菌素与载体物质匙孔血蓝蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0006]所述的载体物质也可以选用其他大分子物质，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋白等，但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。
[0007]所述的第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为兔源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、猪血清白蛋白等鸡、鸭或其他非兔源性动物蛋白。
[0008]本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下:
背衬:为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用；
样品垫制备:将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH 7.0- 8.4的PBS中约莫2 min，取出，80°C烘干或其他方式干燥，即作为样品垫，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动；
胶体金标记部分的制备:该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用；制备步骤包括胶体金溶液的制备、胶体金标记串珠镰刀菌素抗原或串珠镰刀菌素抗体；
胶体金标记部分处理:
(1)胶体金溶液的制备:将氯金酸(HAuCl4)用超纯水配制成1%的母液，取ImL的母液，用超纯水定容至100 mL，配成0.01%的溶液，加热至沸腾，加入1- 5 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，继续加热至出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液；
(2)胶体金标记串珠镰刀菌素抗原:将串珠镰刀菌素检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS (0.01mol/L, pH 7.0-7.5)溶解稀释至2-4 mg/mL，每100 mL胶体金溶液加入1-3 mL 2-4 mg/mL的检测用抗原和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白震荡2 min,用 0.211101/1的1(20)3:，调节口!1至8.4，震荡5 min 加入 11% PEG-10000 2 mL，震荡 5 min,8000-15000r/min 离心 15 min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L，pH 7.0-7.5)复溶，以 6000-13000r/min 离心 15 min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)稀释500-2000倍产物作为金标记串珠镰刀菌素抗原；
(3)胶体金标记串珠镰刀菌素抗体:将串珠镰刀菌素单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属蛋白分别用PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)溶解稀释至2-4 mg/mL，每100 mL胶体金溶液加入1-3 mL 2- 4 mg/mL的串珠镰刀菌素抗体和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白，震荡 2 min，用 0.2 mol/L 的 K2CO3，调节 pH 至 8.4，震荡 5 min，加 11% PEG-100002 mL,震荡 5 min, 8000-15000r/min 离心 15 min,除上清,将沉淀用 PBS (0.01 mo I /L, pH7.0-7.5)复溶，6000-13000 r/min 离心 15 min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH
7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标串珠镰刀菌素抗体；
(4)金标垫处理:将串珠镰刀菌素抗原或串珠镰刀菌素抗体倒入一槽中，将玻璃纤维或滤纸浸入I min，取出，室温干燥后，即作为金标垫；
(5)硝酸纤维素膜分制备:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30 min，取出，37°C烘干，上边包被I条不同浓度的串珠镰刀菌素检测用抗原线或串珠镰刀菌素抗体线作为检测线，同时包被I条抗第二种属动物蛋白的工IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为串珠镰刀菌素检测用抗原和第二种属蛋白时，检测线则包被串珠镰刀菌素抗体。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来；
(6)吸水纸制备:将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收；
(7)试纸组装:在背衬上依次粘贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，即成串珠镰刀菌素检测试纸。
[0009]检测原理:检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。
[0010]当胶体金标记部分标记对象为串珠镰刀菌素检测用抗原和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有串珠镰刀菌素，样品溶液被试纸的样品垫吸收并通过毛细作用上移，样品中的游离串珠镰刀菌素分子量小移动速度快，先到达检测线，先与检测线上包被的串珠镰刀菌素抗体结合，因检测线上包被的串珠镰刀菌素抗体只有特定的结合位点，而且样品中游离的串珠镰刀菌素结合能力比偶合态的串珠镰刀菌素检测用抗原强，于是胶体金标记的检测用抗原不能再被检测线上的串珠镰刀菌素抗体捕获，于是检测线无色，此即为阳性；如果样品中无串珠镰刀菌素，则胶体金标记的串珠镰刀菌素检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的串珠镰刀菌素抗体捕获，形成肉眼可见的红色，此即为阴性。无论样品中是否含有串珠镰刀菌素，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的工IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。
[0011]当胶体金标记部分标记对象为串珠镰刀菌素抗体和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有串珠镰刀菌素，样品溶液被试纸的样品垫吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的串珠镰刀菌素与胶体金标记的串珠镰刀菌素抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的串珠镰刀菌素抗体只有特定的结合位点，样品溶液中的串珠镰刀菌素与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的串珠镰刀菌素抗体结合，于是检测线无色，此即为阳性；当样品中没有串珠镰刀菌素时，胶体金标记的串珠镰刀菌素抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见的红色。无论样品中是否含有串珠镰刀菌素，胶体金标记的第二种属蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的工IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。
[0012]以上两种方式的试纸，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图1为本发明检测试纸条的结构示意图:
图中I为样液吸收部分2为胶体金标记部分3为检测反应部分4为检测线5为参考线6为吸水部分。
[0014]实施方式
串珠镰刀菌素半定量快速检测试纸条制备如上述技术方案所述。
[0015]实施例1玉米中串珠镰刀菌素检测
前处理:取3 g粉碎样品，加入30 mL样品提取液(用去离子水将甲醇按7:3体积比进行稀释，即7份甲醇加3份去离子水，用于提取样本中的串珠镰刀菌素)；剧烈振荡5 min ；4000 r/min离心5 min,或用普通滤纸过滤；上清液或滤液用去离子水按1:19比例稀释；取稀释后液体待测。
[0016]串珠镰刀菌素半定量快速检测试纸条产品的使用方法:取样品滤液100 μ g缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维膜上，15分钟后观察试纸条上检测线(T线)、参考线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中串珠镰刀菌素的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性，串珠镰刀菌素超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性，B类单端孢霉烯族毒素没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。
[0017]实施例2饲料中串珠镰刀菌素检测
前处理:取3 g粉碎样品，加入30 mL样品提取液(用去离子水将甲醇按7:3体积比进行稀释，即7份甲醇加3份去离子水，用于提取样本中的串珠镰刀菌素);剧烈振荡5min ；4000r/min离心5 min，或用普通滤纸过滤；上清液或滤液用去离子水按1:49比例稀释；取稀释后液体待测。
[0018]串珠镰刀菌素半定量快速检测试纸条产品的使用方法:取样品滤液100 μ L缓慢滴加于试纸条的玻璃纤维膜上，15分钟后观察试纸条上检测线(Τ线)、参考线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定样品提取液中串珠镰刀菌素的含量:若只有一条红色色带出现则判定样液为阳性，串珠镰刀菌素超标；若出现两条红色色带出现则判定样液为阴性，串珠镰刀菌素没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。
【权利要求】
1.串珠镰刀菌素胶体金试纸条，其特征在于:在试纸的背衬上依次贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，金标垫上标记的物质为第二种属动物蛋白和串珠镰刀菌素抗体的混合物；硝酸纤维素膜包被有检测用串珠镰刀菌素抗原I条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG I条作为参照线。
2.根据权利要求1所述的串珠镰刀菌素胶体金试纸条，其特征在于:串珠镰刀菌素检测用抗原为串珠镰刀菌素与载体物质形成的偶合物。
3.根据权利要求2所述的串珠镰刀菌素胶体金试纸条，其特征在于:所述的载体物质，为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。
4.根据权利要求1所述的串珠镰刀菌素胶体金试纸条，其特征在于:所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质。
【文档编号】G01N33/68GK103792365SQ201210435631
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜道林, 尚苏林 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司