专利名称：转基因植物材料消化率的体外测定方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域及蛋白鉴定及检测领域技术领域，尤其涉及表达的外源基因蛋白在外的消化率继续定量检测测定技术领域，特别是涉及一种转基因植物材料消化率的体外测定方法。
背景技术：
地球上适于耕种的土地不足1%，其余为干旱、半干旱、冷土、沼泽和盐碱地等。尽管如此，理论上地球可以供养比现在多得多的人口，但是优良的土壤和良好的气候及良好的耕作条件在时空上分布不均匀，与人口分布更不相称。随着人口数量的增加，人类需要更多的粮食，这种需求因越来越多的土地非农田化、沙化、退化及气候变化引起的频繁自然灾害而更加严重；粮食问题已经是全球面临的严重问题，转基因生物就是解决人类粮食问 题的有效途径之一。伴随着转基因生物的产生，转基因生物的食用与饲用安全评价技术与方法也应运而生，而对于转基因生物的安全性问题随着转基因生物的产生就一直没有停止过，尤其对于转基因生物的外源基因及其蛋白的生物安全性问题。虽然理论上任何食物中都存在DNA，在消化道系统中的DNA能被很好地消化吸收，这意味着DNA分子并无毒性，但转基因本身要受一些不确定因素的影响，进而还具有非预期性效应与结果，这种非预期性效应与结果也是所有人所不想看到，甚至是无法接受的风险，所以如何对转基因生物进行安全性评价问题就成为一个现实课题。本申请人及其所在的课题组前期在国家转基因重大专项基金“转基因生物食用饲用安全性评价技术研究”(2008ZX08011-005 ；2010ZX08011-005 ；2013ZX08011-005)择优滚动项目的资助下，对转基因生物的饲用安全性从转基因生物对动物营养、免疫、微生态和残留四个方面进行了系统研究，其中营养、免疫和微生态都是从转基因生物对试验动物性能、形态、功能进行对比研究，而残留研究也仅在DNA水平上(PCR检测)进行了定性的检测。而众所周知的过敏与变态反应就是在蛋白水平上的反应，蛋白水平上也是衡量其安全性的一个重要方面，所以本发明是一个对转基因生物表达的外源蛋白定量水平上(即检测转基因生物外源蛋白在动物消化道的各段的消化率)的一个方法。此外，涉及转基因植物材料中，现有技术大都涉及大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆柏为原料生产的一种全价蛋白类食品。蛋白质含量在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。其营养丰富，不含胆固醇，近年的研究证实，大豆蛋白具有肉类蛋白所不具有的保健价值，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一，对维系人类生命和保证人们的健康起着重要作用。但大豆蛋白分子结构紧密，对酶解具有很强的抵抗力，不利于人体内的消化和吸收，其生理活性和消化性是开发大豆蛋白加工技术的主要难题。因此，测定蛋白在人体内的消化率对提高和改善大豆蛋白加工难题具有重要的现实意义。目前对蛋白质消化的研究方法主要有化学法分析、体内消化法(人体及动物实验法)和体外模拟法等。化学分析法快速简便，但这种利用概略养分分析所测得的蛋白养分与人体消化吸收养分间存在很大差异，不足以准确地反映出蛋白的实际营养价值。体内消化法(人体及动物实验法)是测定蛋白质消化最好的方法，但是这种方法复杂、时间长、费用高；且由于很多因素影响而很难做到。与前两种方法相比，体外模拟法具有快速、简便、重复性好等优点，虽体内消化过程难以精确再现，但是，存在于体内的条件是可以在体外再现的。通过对体内真实情况的模拟，能很好的反映食物在体内消化吸收，可在短时间内对多个样品进行评定。现有技术文献中已有关于对大豆蛋白进行体外消化率测定的记载。例如，黄沧海等(几种蛋白质原料体外消化率测定方法的比较，饲料工业，高压物理学报，2005年第26卷第20期)分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类(如鲈鱼)消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类(如草鱼)消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆柏、菜籽柏、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白原料的消化率。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。Pedersen, B.和 Eggum, B. O. (Prediction ofprotein digestibility by anin vitro enzymatic pH-stat procedure, 1983 年第 49 期)用体外法测定了 61 种食物蛋白质的消化率，其中57种植物蛋白或植物蛋白与动物蛋白的混合物，体外实验测的消化率 与体内实验(大鼠试验)有很好的相关性。李清晓等(豆柏粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究，家畜生态学报，2005年第26卷第5期)采用胃蛋白酶一胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎粒度豆柏的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆柏粉碎粒度。蛋白质在体内的消化是一个两步过程，第一步是蛋白质与预可消化性的胃蛋白酶相接触，第二步是蛋白质和氨基酸与胰蛋白酶的接触消化。目前，胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法是公认的一种较好的测定蛋白质消化率的方法。但该方法大多用于饲料的消化率测定，虽有关于大豆蛋白体外消化的研究，但这些研究中所采用的蛋白酶没有经过酶的标准化，在体外消化中酶的活性变化范围可能会较大，且对体内条件的模拟及仿真度不高。这样，会使体内消化率的测定结果不稳定且无对比参考性。因此，还需要对现有的大豆蛋白体外消化法进行改进以提高其测定结果的稳定性和对比参考性。与此同时，主要以大豆为主要处理消化率检测对象的是目前检测中的主要对象，蛋白质是食品重要组成部分，大豆蛋白以其较高的营养价值和独特的功能特性，已经成为目前世界上开发利用的最具有商业价值的植物蛋白之一。我国大豆资源丰富，被冠以“蔬菜肉”美称的大豆蛋白，富含19种以上氨基酸，赖氨酸含量最高，还含有大量对人体健康有益的必需脂肪酸、磷脂和丰富的钙、磷等矿物质，且不含胆固醇。近年的研究证实，大豆蛋白具有肉类蛋白所不具有的保健价值，被称认为是人类所需最理想的蛋白质，对维系人类生命和保证人们的健康起着重要作用。国内外资料显示，大豆蛋白在体内消化后所产生的生物活性肽，因具有降血压、降胆固醇、增强免疫力、促进生长等特殊的生理功能而日益受到广泛关注。大豆分离蛋白粉是以低温脱溶大豆柏为原料生产的一种全价蛋白类食品，属于全价优质蛋白，没有动物蛋白的副作用，与人体的必需氨基酸组成比例最接近，不会引起肥胖症、心血管病、高胆固醇症等。随着社会的发展和人们生活水平的提高，大豆分离蛋白愈来愈受到人们的青睐。然而，大豆蛋白高分子结构及生化特性极其复杂，疏水性氨基酸含量较高，对胃肠道蛋白酶的酶解具有很强的抵抗力，限制了蛋白在机体有效的消化、吸收和利用。因此需先采用适当的预处理使其变性，使蛋白分子高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部蛋白酶作用点，从而有助于蛋白在体内的消化。目前国内外普遍采用的热处理方法，虽能有效促进蛋白的消化，却因破坏蛋白分子的共价键而导致蛋白中维生素等小分子成分的变性，从而破坏了营养价值和风味。超高压处理是目前国际上最热门的非热食品加工技术之一，包括静态超高压和动态超闻压。动态超高压(UltraHigh Pressure Shoot Crash, UHPSC),又称为射流破碎。是将液态物料在短时间内高速通过一个微米级别的阀孔，而在此过程中产生诸如高速剪切、强烈碰撞、瞬间膨爆和空穴振荡作用，从而引起被处理物料的结构和性质的各种变化。静态超高压(HighHydrostatic Pressure,HHP)是指在 100 IOOOMPa 静态高压和一定温度下将食品物料处理一定时间的加工技术。它与热处理本质的区别在于能够把压 力瞬间传到物料的各个部位，仅使形成生物高分子立体结构的氢键、离子键等非共价键生变化，而共价键不发生变化，极短的时间内破坏高分子立体结构，使蛋白质变性。由于传递给食物分子的能量很小，不会使食物分子的维生素、香味、色素等较低分子化合物原子间的强有力的连接关系像加热时那样会产生强烈地原子振荡而被破坏，因此加压不会像加热那样引起食品颜色发生变化，同时还能保持其原有的新鲜味道和营养成分。它作为当今世界十大尖端科技之一，具有处理过程简单、能耗少、常温处理能最大限度保留食品营养成份的特点。本方法所指超高压技术为静态超高压。现有技术文献中已有关于对大豆分离蛋白进行静态超高压处理等的记载。例如，李汴生等(高压处理后大豆分离蛋白溶解性和流变特性的变化及其机理，高压物理学报，1999年第I期)对高压处理后的大豆分离蛋白溶解性和流变特性的变化及其机理进行了研究，发现经400MPa、15min高压处理使低浓度大豆分离蛋白溶液中蛋白质溶解性的提高最为显著；张宏康(超高压对生物大分子的影响研究.中国农业大学博士论文，2001)研究发现，经300MPa压力处理IOmin可使豆衆中的β -伴球蛋白完全变性,而经400MPa压力处理5min可使豆衆中的大豆豆球蛋白完全变性。在一定压力(< 400MPa)的高压作用下,球状大豆分离蛋白发生解聚，蛋白质分子解聚成一些更小颗粒亚基单位，而且亚基单位进一步有一定程度的伸展，使得球状蛋白质内部的极性基团和疏水基团暴露出来，使得蛋白质分子(颗粒)的表面电荷分布加强，围绕着新暴露的极性基团的结合水将增多；张少兰等(高静压对大豆分离蛋白变性作用的研究.食品研究与开发，2003，24 (4))发现，常温下经400MPa高静压处理30min，大豆蛋白分子发生解离现象，热力学性质发生变化。而大豆分离蛋白(5 1)100 30010^分别处理3011^11时没有出现降解。刘国琴等(超声和超高压处理对大豆分离蛋白特性影响的研究.河南工业大学学报(自然科学版)2005，26 (3))研究发现，在300MPa压力处理下，SPI溶解度随其浓度增加和超高压处理时间延长、而明显增加；但当压力大于400MPa，大豆分离蛋白浓度大于5%时，由于解缔的蛋白质重新聚合，其溶解度就会降低。在现有技术和上述文献中所记载的均为静态超高压对大豆蛋白结构和功能影响的研究，而关于转基因植物材料消化率的体外测定的影响研究却少见文献报道。因此，将转基因植物材料应用于体外消化的测定，对改善传统消化处理的弊端，提高转基因植物材料的体外消化率，开发绿色、环保的转基因植物材料新产品具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，以将转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定技术应用于提闻转基因植物材料的体外消化率；同时其对转基因生物前安全性评价上具有重要意义；同时，该方法可实现提高其测定结果的高稳定性。为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的本发明的一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，该测定方法依次包括以下步骤转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定；所述转基因植物材料的处理依次包括转基因植物材料的提取和转基因植物材料的纯化；其中所述转基因植物材料的提取选取洁净的转基因植物材料放入微型植物粉碎机中，其中，所述洁净的转基因植物材料包括籽粒、茎叶、果实和根部；再将所述微型植物粉碎机的转速控制在7000-9000转/分钟，粉碎时间保持20 25分钟；将粉碎后的植物原料过60目筛，然后经过圆盘式研磨机进行低速精研磨得到研磨样品液，所述圆盘式研磨机的转速控制在85 115转/分钟，研磨时间保持30 45分钟；将上述研磨样品液精确称取50g加入175ml转基因植物提取液，所述转基因植物提取液是体积比为50 25 25 15=正己烷丙酮乙醇乙二胺四乙酸的混合液；其中，提取后的研磨样品液的残留物用2ml所述转基因植物提取液多次抽提，直到浸出液无色为止，合并浸出液，再将合并后的浸出液放入4°C恒温冰箱中放置25 28分钟，然后将其放入台式密封冷冻离心机，离心处理12分钟，所述台式密封冷冻离心机内置有多个离心管，合并后的浸出液置于上述多个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在I 3°C ;所述转基因植物材料的纯化将上述所述转基因植物材料的提取的离心处理后的液体静置3 5分钟，取上面的上清液转移到玻璃试管中待用；用体积比为2 I I 2=巯基乙醇Na2CO3 HCl 甲醇的混合液溶解下面的沉积物得沉淀物溶解液，其中，上述·沉淀物溶解液的PH值为9. 5 ;然后再将所述沉淀物溶解液放入上述台式密封冷冻离心机，离心处理3分钟，再将上述上清液与所述沉淀物溶解液按照体积比为5 4进行充分震荡混合；所述转基因生物材料的电泳测定将上述转基因植物材料的纯化中的充分震荡混合的混合液加入裂解缓冲液混合后，用超声波超声三次，每次3分钟；再加入预热至45 48°C的CTAB提取液中充分混合，然后再将其在低温下充分混合后放入上述台式密封冷冻离心机并控制其转速为15000转/分钟，进行离心6分钟；其中，所述充分震荡混合的混合液、裂解缓冲液和CTAB提取液的体积比为3 2 I ;然后取离心后的上清液为蛋白提取样品；再对该蛋白提取样品通过电泳设备和含电泳指示剂的缓冲液，进行第一向固定P H梯度等电聚焦电泳，然后进行分离和纯化处理得到处理液；所述转基因生物材料的检测将上述转基因生物材料的电泳测定中经分离和纯化处理得到的处理液加入检测试剂溶液震荡，进行充分震荡混合完全溶解得混合样品检测液；其中，将检测试剂条浸入合样品检测液中，使检测试剂条的基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，通过酶标仪和分光光度仪进行比色检测上述检测试剂条的出线目的条带的数目，进行判断消化率的高低。作为一个优选方式，所述转基因植物材料的提取中的所述微型植物粉碎机的转速控制在8500转/分钟，粉碎时间保持22分钟。作为一个优选方式，所述转基因植物材料的提取中的台式密封冷冻离心机内置有五个离心管，合并后的浸出液置于上述五个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在2°C。与现有技术相比，本发明的优势在于I、实现了转基因生物的定性鉴定；2、更好的实现了未来绿色饲料及饲料原料中转基因生物外源蛋白的定量检测；3、为转基因生物外源蛋白在动物消化道内的消化率检测奠定了良好基础，该方法测定易实现，且测定结果精确以及稳定性高。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。实施例I :一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，该测定方法依次包括以下步骤转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定；所述转基因植物材料的处理依次包括转基因植物材料的提取和转基因植物材料的纯化；其中所述转基因植物材料的提取选取洁净的转基因植物材料放入微型植物粉碎机中，其中，所述洁净的转基因植物材料包括籽粒、茎叶、果实和根部；再将所述微型植物粉碎机的转速控制在7000-9000转/分钟，粉碎时间保持20 25分钟；将粉碎后的植物原料过60目筛，然后经过圆盘式研磨机进行低速精研磨得到研磨样品液，所述圆盘式研磨机的转速控制在85 115转/分钟，研磨时间保持30 45分钟；将上述研磨样品液精确称取50g加入175ml转基因植物提取液，所述转基因植物提取液是体积比为50 25 25 15=正己烷丙酮乙醇乙二胺四乙酸的混合液；其中，提取后的研磨样品液的残留物用2ml所述转基因植物提取液多次抽提，直到浸出液无色为止，合并浸出液，再将合并后的浸出液放入4°C恒温冰箱中放置25 28分钟，然后将其放入台式密封冷冻离心机，离心处理12分钟，所述台式密封冷冻离心机内置有多个离心管，合并后的浸出液置于上述多个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在I 3°C ;所述转基因植物材料的纯化将上述所述转基因植物材料的提取的离心处理后的液体静置3 5分钟，取上面的上清液转移到玻璃试管中待用；用体积比为2 I I 2=巯基乙醇Na2C03 HCl 甲醇的混合液溶解下面的沉积物得沉淀物溶解液，其中，上述沉淀物溶解液的PH值为9. 5 ;然后再将所述沉淀物溶解液放入上述台式密封冷冻离心机，离心处理3分钟，再将上述上清液与所述沉淀物溶解液按照体积比为5 4进行充分震荡混合；所述转基因生物材料的电泳测定将上述转基因植物材料的纯化中的充分震荡混合的混合液加入裂解缓冲液混合后，用超声波超声三次，每次3分钟；再加入预热至45 48°C的CTAB提取液中充分混合，然后再将其在低温下充分混合后放入上述台式密封冷冻离心机并控制其转速为15000转/分钟，进行离心6分钟；其中，所述充分震荡混合的混合液、裂解缓冲液和CTAB提取液的体积比为3 2 I ;然后取离心后的上清液为蛋白提取样品；再对该蛋白提取样品通过电泳设备和含电泳指示剂的缓冲液，进行第一向固定P H梯度等电聚焦电泳，然后进行分离和纯化处理得到处理液；所述转基因生物材料的检测将上述转基因生物材料的电泳测定中经分离和纯化处理得到的处理液加入检测试剂溶液震荡，进行充分震荡混合完全溶解得混合样品检测液；其中，将检测试剂条浸入合样品检测液中，使检测试剂条的基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，通过酶标仪和分光光度仪进行比色检测上述检测试剂条的出线目的条带的数目，进行判断消化率的高低。实施例2 一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，该测定方法依次包括 以下步骤转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定；所述转基因植物材料的处理依次包括转基因植物材料的提取和转基因植物材料的纯化；其中所述转基因植物材料的提取选取洁净的转基因植物材料放入微型植物粉碎机中，其中，所述洁净的转基因植物材料包括籽粒、茎叶、果实和根部；再将所述微型植物粉碎机的转速控制在7000-9000转/分钟，粉碎时间保持20 25分钟；将粉碎后的植物原料过60目筛，然后经过圆盘式研磨机进行低速精研磨得到研磨样品液，所述圆盘式研磨机的转速控制在85 115转/分钟，研磨时间保持30 45分钟；将上述研磨样品液精确称取50g加入175ml转基因植物提取液，所述转基因植物提取液是体积比为50 25 25 15=正己烷丙酮乙醇乙二胺四乙酸的混合液；其中，提取后的研磨样品液的残留物用2ml所述转基因植物提取液多次抽提，直到浸出液无色为止，合并浸出液，再将合并后的浸出液放入4°C恒温冰箱中放置25 28分钟，然后将其放入台式密封冷冻离心机，离心处理12分钟，所述台式密封冷冻离心机内置有多个离心管，合并后的浸出液置于上述多个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在I 3°C ;所述转基因植物材料的纯化将上述所述转基因植物材料的提取的离心处理后的液体静置3 5分钟，取上面的上清液转移到玻璃试管中待用；用体积比为2 I I 2=巯基乙醇Na2CO3 HCl 甲醇的混合液溶解下面的沉积物得沉淀物溶解液，其中，上述沉淀物溶解液的PH值为9. 5 ;然后再将所述沉淀物溶解液放入上述台式密封冷冻离心机，离心处理3分钟，再将上述上清液与所述沉淀物溶解液按照体积比为5 4进行充分震荡混合；所述转基因生物材料的电泳测定将上述转基因植物材料的纯化中的充分震荡混合的混合液加入裂解缓冲液混合后，用超声波超声三次，每次3分钟；再加入预热至45 48°C的CTAB提取液中充分混合，然后再将其在低温下充分混合后放入上述台式密封冷冻离心机并控制其转速为15000转/分钟，进行离心6分钟；其中，所述充分震荡混合的混合液、裂解缓冲液和CTAB提取液的体积比为3 2 I ;然后取离心后的上清液为蛋白提取样品；再对该蛋白提取样品通过电泳设备和含电泳指示剂的缓冲液，进行第一向固定P H梯度等电聚焦电泳，然后进行分离和纯化处理得到处理液；
所述转基因生物材料的检测将上述转基因生物材料的电泳测定中经分离和纯化处理得到的处理液加入检测试剂溶液震荡，进行充分震荡混合完全溶解得混合样品检测液；其中，将检测试剂条浸入合样品检测液中，使检测试剂条的基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，通过酶标仪和分光光度仪进行比色检测上述检测试剂条的出线目的条带的数目，进行判断消化率的高低；所述转基因植物材料的提取中的所述微型植物粉碎机的转速控制在8500转/分钟，粉碎时间保持22分钟。实施例3 一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，该测定方法依次包括以下步骤转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定；所述转基因植物材料的处理依次包括转基因植物材料的提取和转基因植物材料的纯化；其中
所述转基因植物材料的提取选取洁净的转基因植物材料放入微型植物粉碎机中，其中，所述洁净的转基因植物材料包括籽粒、茎叶、果实和根部；再将所述微型植物粉碎机的转速控制在7000-9000转/分钟，粉碎时间保持20 25分钟；将粉碎后的植物原料过60目筛，然后经过圆盘式研磨机进行低速精研磨得到研磨样品液，所述圆盘式研磨机的转速控制在85 115转/分钟，研磨时间保持30 45分钟；将上述研磨样品液精确称取50g加入175ml转基因植物提取液，所述转基因植物提取液是体积比为50 25 25 15=正己烷丙酮乙醇乙二胺四乙酸的混合液；其中，提取后的研磨样品液的残留物用2ml所述转基因植物提取液多次抽提，直到浸出液无色为止，合并浸出液，再将合并后的浸出液放入4°C恒温冰箱中放置25 28分钟，然后将其放入台式密封冷冻离心机，离心处理12分钟，所述台式密封冷冻离心机内置有多个离心管，合并后的浸出液置于上述多个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在I 3°C ;所述转基因植物材料的纯化将上述所述转基因植物材料的提取的离心处理后的液体静置3 5分钟，取上面的上清液转移到玻璃试管中待用；用体积比为2 I I 2=巯基乙醇Na2CO3 HCl 甲醇的混合液溶解下面的沉积物得沉淀物溶解液，其中，上述沉淀物溶解液的PH值为9. 5 ;然后再将所述沉淀物溶解液放入上述台式密封冷冻离心机，离心处理3分钟，再将上述上清液与所述沉淀物溶解液按照体积比为5 4进行充分震荡混合；所述转基因生物材料的电泳测定将上述转基因植物材料的纯化中的充分震荡混合的混合液加入裂解缓冲液混合后，用超声波超声三次，每次3分钟；再加入预热至45 48°C的CTAB提取液中充分混合，然后再将其在低温下充分混合后放入上述台式密封冷冻离心机并控制其转速为15000转/分钟，进行离心6分钟；其中，所述充分震荡混合的混合液、裂解缓冲液和CTAB提取液的体积比为3 2 I ;然后取离心后的上清液为蛋白提取样品；再对该蛋白提取样品通过电泳设备和含电泳指示剂的缓冲液，进行第一向固定P H梯度等电聚焦电泳，然后进行分离和纯化处理得到处理液；所述转基因生物材料的检测将上述转基因生物材料的电泳测定中经分离和纯化处理得到的处理液加入检测试剂溶液震荡，进行充分震荡混合完全溶解得混合样品检测液；其中，将检测试剂条浸入合样品检测液中，使检测试剂条的基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，通过酶标仪和分光光度仪进行比色检测上述检测试剂条的出线目的条带的数目，进行判断消化率的高低；所述转基因植物材料的提取中的所述微型植物粉碎机的转速控制在8500转/分钟，粉碎时间保持22分钟；所述转基因植物材料的提取中的台式密封冷冻离心机内置有五个离心管，合并后的浸出液置于上述五个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在2°C。实施例4 通过以下设备植物万能粉碎机，电加热立式蒸汽灭菌器，超净工作台，恒温培养箱，空气恒温振荡器，台式冷冻离心机，4°C与_80°C恒温冰箱，PCR仪，酶标仪、分光光度仪、振荡器、尚心管、电泳设备等；进行转基因植物材料的处理 将转基因植物材料按照不同的需求进行处理，将转基因生物的籽粒、茎叶以及果实和根部进行前期的处理(如切碎、粉碎等)，冰箱内储存备用，近期使用的样品放在4°C冰箱，对于近期不使用的样品则放在_80°C冰箱。进行转基因材料检测试剂的准备用于转基因定性检测需要一些专用试剂，如SEB4缓冲液，I倍浓度SEB4缓冲液可以由粉末直接制备。在称量前，振荡混匀瓶中粉末。按以下比例待释粉末5. 7g加蒸馏水至1L。即先向5. 7g粉末中加入少量水搅拌成浆状，然后，边搅拌边缓慢加水使最终体积为1L，搅拌30分钟或者直至完全溶解；进行转基因生物材料的检测与鉴定对于有些基因及其转基因产品，比如Bt基因及其Bt杀虫蛋白已经有市场化的定性检测试剂盒，可先用万能粉碎机将转基因植物材料进行粉碎，过60目筛，取l_2g样品加入5ml离心管中，再加入检测试剂溶液震荡，使之完全溶解。将检测试剂条浸入样品溶液中，使基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，取出后观察结果(目的条带是否出现，如果出现表明是转基因材料，否则就不是转基因材料)。可进行转基因生物材料的分子鉴定对于目前还没有市场化的定性检测试剂盒的外源基因的转基因材料检测，看根据所转的外源基因序列设计PCR引物(具体要根据外源基因片段的大小、碱基序列的特点等进行)以便对转基因生物材料进行PCR核酸鉴定。本发明并不局限于上述特定实施例，在不背离本发明精神及其实质情况下，本领域的普通技术人员可根据本发明作出各种相应改变和变形。这些相应改变和变形都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。
权利要求
1.一种转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，该测定方法依次包括以下步骤转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定；所述转基因植物材料的处理依次包括转基因植物材料的提取和转基因植物材料的纯化；其中所述转基因植物材料的提取选取洁净的转基因植物材料放入微型植物粉碎机中，其中，所述洁净的转基因植物材料包括籽粒、茎叶、果实和根部；再将所述微型植物粉碎机的转速控制在7000-9000转/分钟，粉碎时间保持20 25分钟；将粉碎后的植物原料过60目筛，然后经过圆盘式研磨机进行低速精研磨得到研磨样品液，所述圆盘式研磨机的转速控制在85 115转/分钟，研磨时间保持30 45分钟；将上述研磨样品液精确称取50g加入175ml转基因植物提取液，所述转基因植物提取液是体积比为50 25 25 15 =正己烷丙酮乙醇乙二胺四乙酸的混合液；其中，提取后的研磨样品液的残留物用2ml所述转基因植物提取液多次抽提，直到浸出液无色为止，合并浸出液，再将合并后的浸出液放入4°C恒温冰箱中放置25 28分钟，然后将其放入台式密封冷冻离心机，离心处理12分钟，所述台式密封冷冻离心机内置有多个离心管，合并后的浸出液置于上述多个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在I 3°C ;所述转基因植物材料的纯化将上述所述转基因植物材料的提取的离心处理后的液体静置3 5分钟，取上面的上清液转移到玻璃试管中待用；用体积比为2 : I : I : 2=巯基乙醇Na2CO3 HCl 甲醇的混合液溶解下面的沉积物得沉淀物溶解液，其中，上述沉淀物溶解液的PH值为9. 5 ;然后再将所述沉淀物溶解液放入上述台式密封冷冻离心机，离心处理3分钟，再将上述上清液与所述沉淀物溶解液按照体积比为5 4进行充分震荡混合；所述转基因生物材料的电泳测定将上述转基因植物材料的纯化中的充分震荡混合的混合液加入裂解缓冲液混合后，用超声波超声三次，每次3分钟；再加入预热至45 48°C的CTAB提取液中充分混合，然后再将其在低温下充分混合后放入上述台式密封冷冻离心机并控制其转速为15000转/分钟，进行离心6分钟；其中，所述充分震荡混合的混合液、裂解缓冲液和CTAB提取液的体积比为3 2 I ;然后取离心后的上清液为蛋白提取样品；再对该蛋白提取样品通过电泳设备和含电泳指示剂的缓冲液，进行第一向固定P H梯度等电聚焦电泳，然后进行分离和纯化处理得到处理液；所述转基因生物材料的检测将上述转基因生物材料的电泳测定中经分离和纯化处理得到的处理液加入检测试剂溶液震荡，进行充分震荡混合完全溶解得混合样品检测液;其中，将检测试剂条浸入合样品检测液中，使检测试剂条的基准线露在液面以上，静止放置15 20分钟，通过酶标仪和分光光度仪进行比色检测上述检测试剂条的出线目的条带的数目，进行判断消化率的高低。
2.根据权利要求I所述的转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，所述转基因植物材料的提取中的所述微型植物粉碎机的转速控制在8500转/分钟，粉碎时间保持22分钟。
3.根据权利要求I或3所述的转基因植物材料消化率的体外测定方法，其特征在于，所述转基因植物材料的提取中的台式密封冷冻离心机内置有五个离心管，合并后的浸出液置于上述五个离心管中，所述台式密封冷冻离心机的温度控制在2°C。
全文摘要
本发明提供了一种转基因植物材料消化率的体外测定方法。该方法通过转基因植物材料的处理、转基因材料检测试剂的制备、转基因生物材料的检测和转基因生物材料的电泳测定技术处理后，解决了该技术领域中转基因植物材料体外消化率测定精确度和稳定性较低的技术问题；该方法具有操作简易方便，节能环保，安全高效等优点，为转基因生物的安全性评价奠定了重要基础；同时，该方法可实现提高其测定结果的高稳定性；可有效实现改善转基因植物材料体外消化率无法准确测定的难题，为开发我国传统的转基因植物材料资源潜力具有重要意义。
文档编号G01N33/50GK102928581SQ20121044901
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者孙哲, 张宏福 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所