抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法
【专利摘要】本发明提供一种可以高效富集抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法，其特征在于以MWNTs-COOH为固相载体，在MWNTs-COOH表面修饰上TiO2纳米颗粒，具备对转基因大豆种子中磷酸肽有高选择性效果，达到特异性分离的目的，实现对转基因大豆中磷酸肽的灵敏检测。
【专利说明】抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种磷酸肽新型富集材料MWNTs-COOH的合成以及利用液相色谱-质谱联用技术检测转基因大豆中磷酸肽的方法。
【背景技术】
[0002]自抗草甘膦转基因大豆商品化以来，已经建立了不少的检测方法，以检测核酸为目标的各种PCR检测技术以及PCR快速检测试剂盒；以检测外源蛋白为目标的ELISA检测技术以及酶联免疫快速检测试纸条、试剂盒，这些检测方法都可以为鉴定转基因作物以及为转基因作物的环境安全评价提供技术支持。但是自中国2009年批准转基因水稻和转基因玉米生产安全证书的释放，成为第一个批准主粮商业化种植的国家后，对转基因作物安全性评价、特别是转基因作物在食品安全性评价方面提出更高的要求。
[0003]生物信息是按DNA — mRNA —蛋白质一代谢产物方向流动的，代谢物是细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应(Fiehn，2002)，转基因作物均是通过调控基因的表达来控制目的性状的改变，基因表达上极微小的变化即可导致代谢物种类、含量、分布的大幅改变。因此，对转基因作物代谢物的分离鉴定，检测分析可以为生物安全、特别是食品安全相关预警信号提供一个预知平台，也可以为转基因产品在安全性评价方面提供一种新的技术。
[0004]由于植物代谢物在时间和空间都具有高度的动态性，且产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，难于进行分离鉴定，所以人们一直在寻找更为强大的检测分析方法，力求可检测到样品中的每种代谢物。代谢物的分析通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法，比较不同样品中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析，研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究，再结合模式识别方法，有可能找出与之相关的生物标志物。
[0005]用于代谢物检测的主要技术手段是核磁共振(NMR)，质谱(MS)，色谱(HPLC，GC)等。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征，由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物。此夕卜，质谱分析发现，代谢产物的同质性不高，由于缺乏均匀性，使色谱分析变得更加困难，无法识别出样品中的未知物质。采用核磁共振(NMR)的方法，可以弥补色谱的不足，但由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。因此，对代谢产物的分析最大的挑战就是对代谢产物的识别以及高效的检测方法。
[0006]抗草甘膦转基因大豆中外源EPSPS基因的表达阻断植物体内芳香族氨基酸和某些由其参与合成的维生素、生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物质等次生代谢物的生物合成。在这个过程中，一小部分蛋质发生磷酸化，并且被大量的非磷酸肽所遮蔽，很难检测，为了更加灵敏的检测转基因与非转基因在磷酸肽含量方面的差异，建立一种 高灵敏度和高特异性检测磷酸肽的方法十分必要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种可以高效富集抗草甘膦转基因大豆种子中磷酸肽的分离富集方法，可以更加灵敏的检测转基因与非转基因大豆在磷酸肽含量方面的差异。
[0008]本发明提供的一种新型闻效富集材料和富集方法为:
[0009]1、以MWNTs-COOH为固相载体，通过水热法在MWNTs-COOH表面修饰上TiO2纳米颗粒，合成了一种高效富集材料，利用标准磷酸化蛋白β -casein对其富集效率进行评价表明此方法对磷酸肽有较高的选择性，富集效率可以达到25mg/g。
[0010]2、磷酸化肽的分离，富集及检测被以下方法实现:
[0011]I)以50%的乙腈作为上样溶剂，将含有目标物磷酸肽的上样溶剂流过装有IOmg新合成高效富集材料的固相萃取柱；
[0012]2)以浓度为0.1%的IOml三氟乙酸清洗上述吸附有目标物的固相萃取柱3次，收集洗脱液。
[0013]3)所收集的洗脱液使用液质进行磷酸肽含量测定。
[0014]本发明提供的方法可以解决在实际样品中由于磷酸肽含量丰度很低并且被大量的非磷酸肽所抑制而造成的检测困难问题，可以简便高效的实现对转基因大豆种子萌发过程中磷酸肽变化情况的检测。
【具体实施方式】
[0015]实施例1、高效富集材料的合成
[0016]称取羧基化多壁碳纳米管IOOmg于25mL圆底烧瓶中，在浓硫酸/硝酸(V/V =I: I)的条件下超声4h，之后抽滤，用去离子水将MWNTs-COOH冲洗到中性。随后将冲洗好的MWNTs-COOH在超声条件下分散到IOOg正丁醇中得到悬浮液，接着将含有40%钛酸正丁酯(TBT)的正丁醇溶液在搅拌的条件下加入到先前得到的悬浮液中。MWNTs-COOH和TBT的混合物磁力搅拌SOmin后在室温下静置6h，离心和在室温下干燥48h后，得到黑色混合物将其研磨成粉末转入到IOOmL反应釜中，加入30ml的去离子水，280°C反应3小时后自然冷却到室温。经过真空抽滤，80°C条件下干燥后。
[0017]实施例2、磷酸肽的粗分离条件
[0018]将用水浸泡24小时和48小时的转基因和非转基因大豆种子的磷酸肽首先使用离子交换色谱进行粗分离。分离条件为:色谱柱使用Hypersil SCX强阳离子交换柱(Ther-moKeystone,4.6mmX 150mm, 5 μ m, 30nm);流动相:A为8mmol/L ΝΗ4Η2Ρ04/40% 乙臆，pH= 2.7,B 为 A+245mmol/L NH4Cl,流速为 0.7mL/min，检测波长为 214nm。
[0019]实施例3、磷酸肽富集
[0020]精确称取TiO2-MWNTs纳米复合材料10mg，先用去离子水振荡洗涤，离心后弃上清得到沉淀，在用30% ACN-0.1% TFA上样缓冲液将材料重新悬浮，振荡条件下平衡材料IOmin,离心后弃上清得到沉淀。
[0021]取20 μ L粗分离液体，用30% ACN-0.1 % TFA的上样缓冲液稀释至ImL入到先前处理好的材料中，室温条件下振荡孵育80min，之后15000rpm条件下离心，弃去上清液收集沉淀。沉淀物先用800μ? 80% ACN-5% TFA振荡洗涤一次，离心后弃去上清液，再用80% ACN-0.1% TFA振荡洗涤两次，离心后弃去上清液得到沉淀。最后，用200 μ L0.4mol/L的氨水在超声的条件下洗脱TiO2-MWNTs纳米复合材料，洗脱液冻干后重新复溶在60%ACN-0.1% TFA中，用于随后的质谱分析中。
[0022]实施例4、液相色谱-质谱联用条件
[0023]Surveyor 液相部分:(I)色谱柱:Zorbax Eclipse Plus C18,2.1 X 150mm, 3.5 μ m ；
(2)柱温:25°C ；(3)流动相及梯度洗脱程序:乙腈(A)-水⑶(0.1 %甲酸)，洗脱程序为5% -50% A,95% -50% B。(4)流速:0.2mL min-1 ； (5)进样体积:10μ L ；(6)分析时间:45min ； (7)后运行时间:IOmin ；
[0024]LCQ Advantage MAX质谱部分:(I)离子源:ESI ； (2)扫描方式:正离子扫描；(3)检测模式:全扫描，Mass range, m/z 400-1800 ； (4)雾化气:氮气；(5)雾化器压力:40psi ；(6)毛细管电压:4500V ; (7)干燥气温度:350oC ;(8)辅助气流速:5arb ; (9)鞘气流速:30arb；(10)质量分析器:三维离子阱。
[0025]对主要峰进行二级质谱分析时，一级质谱的数据依赖二级质谱扫描模式(DataDependentMS/MS Scan),依次选取一级质谱中离子强度最强的五个离子进行CID串联质谱，碰撞归一化能量为35%;采用串联质谱扫描的动态排除功能(dynamic exclusion),设置排除时间为3min。`
【权利要求】
1.一种可以检测转基因大豆种子中磷酸肽的液相色谱-质谱联用检测方法，其特征在于使用一种新合成的高效富集材料，具备对转基因大豆种子中磷酸肽有高选择性效果，达到特异性分离的目的，实现对转基因大豆中磷酸肽的灵敏检测。
2.权利要求1所述及的高效富集材料，是以MWNTs-COOH为固相载体，通过水热法在MWNTs-COOH表面修饰上TiO2纳米颗粒，合成的一种高效富集材料。
3.权利要求1所述及的磷酸肽选择性富集方法包括: 1)以50%的乙腈作为上样溶剂，将含有目标物磷酸肽的上样溶剂流过装有IOmg权力要求2所合成的富集材料的固相萃取柱； 2)以浓度为0.1%的IOml三氟乙酸清洗上述吸附有目标物的固相萃取柱3次，收集洗脱液。
【文档编号】G01N30/08GK103808837SQ201210449335
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月12日 优先权日:2012年11月12日
【发明者】王俊英, 王俊平, 林敏
申请人:中国农业科学院生物技术研究所