专利名称：一种荧光寿命显微成像系统的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光显微成像技术领域，尤其涉及一种基于声光器件的可寻址定位的突光寿命显微成像系统。
背景技术：
荧光寿命是指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。在生物医学领域，通过对样品进行荧光寿命成像，可以对分子所处微环境中生化参数的分布进行定量监测，例如，监测细胞内蛋白质的水解过程等。目前，可对荧光寿命进行监测的荧光显微成像系统主要有双光子激发荧光显微成像系统、激光扫描共焦(荧光)显微成像系统、多模式光学显微复合成像系统等。其中，双光子激发荧光显微成像系统具有高的层析能力和更深的测量深度，是生物学功能性成像的重要研究手段。在双光子激发荧光显微成像系统中，只有在焦点位置的激发光光子数密度才足以实现多光子荧光激发的要求，这一特点决定了双光子激发荧光显微成像技术是一种扫描成像技术，一般通过对激发光束进行扫描来实现成像。现有技术中，用于对荧光寿命进行监测的双光子激发荧光显微成像系统采用振镜扫描技术，由于受制于机械惯性的影响，其每秒只能得到几帧扫描图像，远不能满足对诸如神经功能成像等毫秒级中快事件的监测需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光寿命显微成像系统，旨在解决现有用于对荧光寿命进行监测的双光子激发荧光显微成像系统采用振镜扫描技术，由于受制于机械惯性的影响，不能满足对毫秒级中快事件的监测需要的问题。本发明是这样实现的，一种荧光寿命显微成像系统，上述系统包括激光器，用于发出脉冲激光；基于声光器件的扫描成像光路，用于将所述脉冲激光投射到样品池中待监测样品表面；荧光探测光路，用于探测所述样品产生的荧光光子，并转换为相应的电信号；时间相关单光子计数单元，用于根据所述电信号生成荧光光子的时间分布图；监测单元，用于对所述时间分布图进行拟合分析，得到所述样品的荧光寿命；驱动电路，用于在所述监测单元的控制下，改变所述扫描成像光路中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。本发明提出的突光寿命显微成像系统米用基于声光器件的双光子激发突光显微成像系统，并结合时间相关单光子计数技术，通过控制声光器件中的声波频率，实现光束寻址定位扫描，进而对样品中感兴趣的组织或部位进行精确定位扫描。
图1是本发明实施例一提供的荧光寿命显微成像系统的结构图；图2是图1中预处理光路、扫描光路、显微成像光路的结构图；图3是图2中第一时间相关单光子计数单元的结构图；图4是图2中监测单元、驱动电路的结构图；图5是本发明实施例二提供的荧光寿命显微成像系统的结构图；图6是本发明实验中，荧光素样品随机点扫描的荧光强度图像和对荧光光子的时间分布直方图拟合后的荧光强度衰减拟合曲线；图7a是本发明实验中，区域扫描双光子激发荧光强度图像；图7b是本发明实验中，区域扫描双光子激发荧光重构强度图像；图7c是本发明实验中，区域扫描双光子激发荧光寿命图像；图8a是本发明实验中，Ieica样片选择环形区域荧光强度的成像8b是本发明实验中，Ieica样片荧光寿命的成像图；图Sc是本发明实验中，Ieica样片区域寿命成像分析图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。针对现有技术存在的问题，本发明提出的荧光寿命显微成像系统采用基于声光器件的双光子激发突光显微成像系统，并结合时间相关单光子计数(Time-CorrelatedSingle-Photon Counting, TCSPC)技术,通过控制声光器件中的声波频率,实现光束寻址定位扫描，进而对样品中感兴趣的组织或部位进行精确定位扫描。具体而言，本发明提供的荧光寿命显微成像系统包括激光器，用于发出脉冲激光；基于声光器件的扫描成像光路，用于将激光器发出的脉冲激光投射到样品池中待监测样品表面；荧光探测光路，用于探测样品产生的荧光，并转换为相应的电信号；时间相关单光子计数(Time-Correlated Single PhotonCounting, TCSPC)单元,用于根据突光探测光路转换后的电信号，生成突光光子的时间分布图，该时间分布图表征了突光光子随时间的衰减强度；监测单元，用于对时间相关单光子计数单元生成的时间分布图进行拟合分析，得到样品的荧光寿命；驱动电路，用于在监测单元的控制下，改变扫描成像光路中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。以下结合实施例说明本发明的详细技术方案实施例一在本发明实施例一中，如图1所不，突光寿命显微成像系统包括基于声光器件的扫描光路13 ;激光器11，用于发出脉冲激光，激光器11优选为光谱物理公司生产的钛蓝宝石激光器，其输出波长为700-1000nm，脉冲宽度为lOOfs，使用时将其输出的中心波长调到820nm，进行双光子激发；放置在激光器11的出射光光路上的预处理光路12，用于将激光器11发出的脉冲激光投射到扫描光路13中；放置在扫描光路13的出射光光路上的显微成像光路14，用于将扫描光路13输出的光束投射到样品池中待监测样品表面；放置在待监测样本的荧光出射光路上的荧光探测光路15，用于探测样品产生的荧光，并转换为相应的电信号，荧光探测光路15优选为一光电倍增管(PhotoMultiplier Tube，PMT);时间相关单光子计数单元16，用于根据荧光探测光路15转换后的电信号，生成荧光光子的时间分布图，该时间分布图表征了荧光光子随时间的衰减强度；监测单元17，用于对时间相关单光子计数单元16生成的时间分布图进行拟合分析，得到样品的荧光寿命；驱动电路19，用于在监测单元17的控制下，改变扫描光路13中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。公知地，声波是弹性波。声波在媒质中传播时，由于弹性应变，媒质的折射率随空间和时间周期地变化，光通过媒质时会发生衍射，这种现象称为声光效应。由于弹光效应，当超声纵波以行波形式在介质中传播时会使介质折射率产生正弦或余弦规律变化，并随超声波一起传播，当激光通过此介质时，就会发生光的衍射，即声光衍射。衍射光的强度、频率、方向等都随着超声波场而变化。其中衍射光偏转角随超声波频率的变化现象称为声光偏转。通过改变超声波频率即可对衍射光的方向进行调整，且调整过程不受机械惯性的影响，本发明即是基于此原理实现可寻址定位的光束扫描。进一步地，本发明实施例一中，荧光寿命显微成像系统还可以包括放置在待监测样本的荧光出射光路上的成像光路18，用于采集样品产生的荧光分布图像，并转换成电信号后输出给监测单元17显示。成像光路18优选是一电荷稱合元件(Charge-coupledDevice, CCD)图像传感器。本发明实施例一中，成像光路18与荧光探测光路15的放置位置相同，在实际应用时，可通过在设备上设置一滑动槽，成像光路18和荧光探测光路15均可在该滑动槽中自由滑动，从而实现成像光路18与荧光探测光路15的切换使用。如图2所不,本发明实施例一中，扫描光路13具体包括一声光偏转器131。预处理光路12具体包括缩束器123 ;等边棱镜126 ;放置在激光器11的出射光光路上的第一反射镜组，用于将激光器11发出的脉冲激光投射到缩束器123的入射端，第一反射镜组包括第一反射镜121和第二反射镜122 ;放置在缩束器123的出射光光路上的第二反射镜组，用于将缩束器123的出射端射出的光束投射到等边棱镜126，第二反射镜组包括第三反射镜124和第四反射镜125 ;放置在等边棱镜126的出射光光路上的第三反射镜组，用于将等边棱镜126出射的光束投射到扫描光路13中，第三反射镜组包括第五反射镜127和第六反射镜 128。其中，缩束器123用于对光束进行扩束及准直调节；等边棱镜126作为色散元件，能够实现与声光偏转器131大小相等而方向相反的色散效应，达到空间色散补偿的目的。本发明实施例一中，显微成像光路14具体包括放置在扫描光路13的出射光光路上的第七反射镜141 ;顺次放置在第七反射镜141的反射光光路上的扫描镜142、管镜143和物镜144，且扫描镜142的前焦面和管镜143的后焦面重合，以使得光束能充满物镜144的后光阑。进一步地，显微成像光路14还可以包括放置在物镜144的出射光光路上的双光子滤光片145。如图3所示,本发明实施例一中，时间相关单光子计数单元16包括存储单元163 ;时间计算单元161，用于计算荧光光子在信号周期内对应的探测时间；累加单元162，用于对存储单元163中与探测时间对应的寄存器进行累加；时间分布生成单元164，用于根据累加单元162的累加结果，生成荧光光子的时间分布图。如图4所示，本发明实施例一中，监测单元17包括监控主机171，用于显示监测平台界面，对时间相关单光子计数单元16生成的时间分布图进行拟合分析，得到样品的荧光寿命并显示在监测平台界面上，同时还可用于接收成像光路18采集到的荧光分布图像并显示；数据采集卡172，用于在监控主机171的控制下，生成频率控制信号并输出给驱动电路19。驱动电路19根据该频率控制信号，改变扫描光路13中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。优选地，数据采集卡172的型号是N1-6259，其每输出一组频率控制信号的同时，还输出一触发信号；而若时间相关单光子计数单元16采用单点采集模式，则需要一外部信号触发才可工作。有鉴于此，本发明实施例一中，信号采集卡172输出的触发信号即可作为时间相关单光子计数单元16的单点采集模式下的触发信号，时间相关单光子计数单元16在该触发信号控制下，触发寿命监测，可快速的实现对待监测样品各区域的荧光寿命测量。优选地，监控主机171的监测平台采用Labview语言编写，对时间相关单光子计数单元16输出的荧光光子的时间分布图像和成像光路18采集到的荧光分布图像采用统一的参考图像。在使用过程中，应保持系统的稳定，在更换CCD图像传感器之后，参考图像的像素坐标位置会发生变化，这时需要采用Matlab曲线拟合方法对参考图像进行校准，得到唯一的像素坐标与声波频率的关系参数后，执行下一操作过程。此时，驱动电路19包括频率发生器191，用于根据数据采集卡172输出的频率控制信号，生成相应的频率信号；功率放大器192，用于对频率信号进行放大处理后输出给扫描光路13中的电声换能器，以改变电声换能器发出的超声波频率。实施例二本发明实施例二中，激光器11、预处理光路12、扫描光路13、成像光路18、监测单元17、时间相关单光子计数单元16、荧光探测光路15、驱动电路19的结构均与本发明实施例一相同，在此不赘述。与本发明实施例一不同，如图5所示，本发明实施例二中，成像光路18与荧光探测光路15所放置的位置不同。成像光路18仍放置在待监测样品的荧光出射光路上，而荧光探测光路15则放置在待监测样品发出的荧光经显微成像光路14分向后的出射光路上。此时，显微成像光路14中，第七反射镜141替换为一二向色镜，待监测样本的荧光出射后，顺次经物镜144、管镜143、扫描镜142返回到二向色镜，经二向色镜出射到荧光探测光路15，其它结构与本发明实施例一相同，在此不赘述。下面以待监测样品为标准样品-荧光素为例，采用上述实施例一和实施例二提供的荧光寿命显微成像系统对其进行成像分析及寿命测定—、突光素样品的单点实验。如图6不出了突光素样品随机点扫描的突光强度图像和对荧光光子的时间分布直方图拟合后的荧光强度衰减拟合曲线。通过对荧光素样品单点寿命的曲线拟合，可得到该点的寿命值为3. 6ns，与现有报道值相等。二、荧光素样品的区域寿命成像实验。如图7a至图7c所示，该荧光素区域内的寿命直方图如右侧所示，灰度与寿命值大小相对应，由图可知，该区域的寿命为2. 2-2. 55ns,平均寿命为2. 38ns。三、对上述实验的结果分析在本实验中，首先用荧光素样品进行实验，通过上述实验可知，荧光素样品的荧光寿命值为2. 2-2. 55ns (如图7c所示区域)不同点处所对应的荧光寿命值有所差别，因此可根据此寿命成像对组织的微环境等参数进行测量。由于荧光素样品的分布比较均匀，结构差异不大，所以测量出的荧光寿命值分布区间也比较集中。在本发明的另一实验中，也对Ieica样片进行了随机区域荧光寿命测量与成像，通过Ieica样片的区域荧光寿命成像分析，Ieica样品的不同位置处的荧光寿命不同。如图8a和图Sb所示，表征了 Ieica样片选择环形区域荧光强度成像和荧光寿命成像的对比，图Sc是Ieica样片区域寿命成像分析图；所选环形区域内荧光寿命分布区间为366. 3ps-731. 7ps，平均寿命值为 599. 6ps。从上述实验可以看出，通过对荧光素样品和Ieica样片的不同区域强度成像和寿命测量及成像分析，利用本发明系统可得到任意感兴趣点和区域的荧光寿命信息，初步实现了基于声光偏转器的随机介入和寻址扫描的寿命成像方法，成功地将声光扫描机制应用到了荧光寿命成像系统中。本发明提出的突光寿命显微成像系统米用基于声光器件的双光子激发突光显微成像系统，并结合时间相关单光子计数技术，通过控制声光器件中的声波频率，实现光束寻址定位扫描，进而对样品中感兴趣的组织或部位进行精确定位扫描。本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来控制相关的硬件完成，所述的程序可以在存储于一计算机可读取存储介质中，所述的存储介质，如R0M/RAM、磁盘、光盘等。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种突光寿命显微成像系统，其特征在于，所述系统包括 激光器，用于发出脉冲激光； 基于声光器件的扫描成像光路，用于将所述脉冲激光投射到样品池中待监测样品表面； 荧光探测光路，用于探测所述样品产生的荧光光子，并转换为相应的电信号； 时间相关单光子计数单元，用于根据所述电信号生成荧光光子的时间分布图； 监测单元，用于对所述时间分布图进行拟合分析，得到所述样品的荧光寿命； 驱动电路，用于在所述监测单元的控制下，改变所述扫描成像光路中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。
2.如权利要求1所述的突光寿命显微成像系统，其特征在于，所述基于声光器件的扫描成像光路包括 基于声光器件的扫描光路； 放置在所述激光器的出射光光路上的预处理光路，用于将所述激光器发出的脉冲激光投射到所述扫描光路中； 放置在所述扫描光路的出射光光路上的显微成像光路，用于将所述扫描光路输出的光束投射到所述待监测样品表面。
3.如权利要求2所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述系统还包括 放置在所述待监测样本的荧光出射光路上的成像光路，用于采集所述样品产生的荧光分布图像，并转换成电信号后输出给所述监测单元显示。
4.如权利要求3所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述荧光探测光路放置在所述待监测样本的荧光出射光路上；所述显微成像光路包括 放置在所述扫描光路的出射光光路上的第七反射镜； 顺次放置在所述第七反射镜的反射光光路上的扫描镜、管镜和物镜，且所述扫描镜的前焦面和所述管镜的后焦面重合； 放置在所述物镜的出射光光路上的双光子滤光片。
5.如权利要求3所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述荧光探测光路放置在所述待监测样品发出的荧光经所述显微成像光路分向后的出射光路上；所述显微成像光路包括 放置在所述扫描光路的出射光光路上的二向色镜； 顺次放置在所述二向色镜的反射光光路上的扫描镜、管镜和物镜，且所述扫描镜的前焦面和所述管镜的后焦面重合； 放置在所述物镜的出射光光路上的双光子滤光片。
6.如权利要求2所述的突光寿命显微成像系统,其特征在于,所述扫描光路包括一声光偏转器；所述预处理光路包括 缩束器； 等边棱镜； 放置在所述激光器的出射光光路上的第一反射镜组，用于将所述激光器发出的所述脉冲激光投射到所述缩束器的入射端，所述第一反射镜组包括第一反射镜和第二反射镜； 放置在所述缩束器的出射光光路上的第二反射镜组，用于将所述缩束器的出射端射出的光束投射到所述等边棱镜，所述第二反射镜组包括第三反射镜和第四反射镜； 放置在所述等边棱镜的出射光光路上的第三反射镜组，用于将所述等边棱镜出射的光束投射到所述扫描光路中，所述第三反射镜组包括第五反射镜和第六反射镜。
7.如权利要求1所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述时间相关单光子计数单元包括 存储单兀； 时间计算单元，用于计算所述荧光光子在信号周期内对应的探测时间； 累加单元，用于对所述存储单元中与所述探测时间对应的寄存器进行累加； 时间分布生成单元，用于根据所述累加单元的累加结果，生成所述荧光光子的时间分布图。
8.如权利要求1所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述监测单元包括 监控主机，用于显示监测平台界面，对所述时间相关单光子计数单元生成的所述时间分布图进行拟合分析，得到所述待监测样品的荧光寿命并显示在所述监测平台界面上；数据采集卡，用于在所述监控主机的控制下，生成频率控制信号并输出给所述驱动电路； 所述驱动电路包括 频率发生器，用于根据所述数据采集卡输出的所述频率控制信号，生成相应的频率信号; 功率放大器，用于对所述频率信号进行放大处理后输出给所述电声换能器。
9.如权利要求8所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述数据采集卡的型号是 N1-6259。
10.如权利要求1至9任一项所述的荧光寿命显微成像系统，其特征在于，所述激光器为钛蓝宝石激光器，所述脉冲激光的中心波长是820nm ;所述荧光探测光路是一光电倍增管。
全文摘要
本发明属于荧光显微成像技术领域，提供了一种荧光寿命显微成像系统，包括激光器；基于声光器件的扫描成像光路，用于将脉冲激光投射到待监测样品表面；荧光探测光路，用于探测样品产生的荧光光子，并转换为相应的电信号；时间相关单光子计数单元，用于根据电信号生成荧光光子的时间分布图；监测单元，用于对时间分布图进行拟合分析，得到样品的荧光寿命；驱动电路，用于在监测单元的控制下，改变扫描成像光路中声光器件的电声换能器发出的超声波频率。由于本系统采用基于声光器件的双光子激发荧光显微成像技术，并结合时间相关单光子计数技术，通过控制声光器件中的声波频率，实现光束寻址定位扫描，进而对感兴趣的组织或部位进行精确定位扫描。
文档编号G01N21/64GK102998290SQ201210456989
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者屈军乐, 邵永红, 齐璟, 王凯歌, 黄丽强 申请人:深圳大学