专利名称：采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域中的标记免疫分析方法，具体涉及一种采用光激发化学发光(Light initiatd Chemiluminescence Assay, LiCA)免疫分析对血清中的祀物质进行定性与定量检测的方法。
背景技术：
均相免疫指全部的反应与结果的观察均在均一的液相界面进行的免疫学检测方法，操作简洁是均相免疫的主要特征。光激发化学发光(LiCA)免疫分析是这类方法的主要代表，亦是目前已经商品化的主要均相免疫技术之一，与酶联免疫分析(ELISA)、电化学发光免疫分析等固相免疫分析相比，LiCA免疫分析涉及时间分辨荧光，纳米微球研究，受体(生物素与亲和素)固定，特殊的能量转递方式及均相免疫反应等多种前沿科学成果，其技·术含量最高，实验操作最简洁，但因Hooks效应的影响妨碍了其市场推广。Hooks效应即钩状效应，其表现为当反应体系中待测物质(包括抗原或抗体)的浓度升高到一定程度后，检测信号反而下降或显著下降，甚至出现假阴性结果，由此造成的后果首先是个别靶物质含量极高的强阳性标本表现出假阴性，其次为阳性标本中大约10 30%左右强阳性标本，被误判为弱阳或低浓度阳性。这种存在于多种血清学检测中的量(待测物浓度)效(检测信号)分离现象的产生虽可能与待测免疫分子的结构相关，但反应体系中靶物质与对应免疫物质比例的高度失调是其最主要的原因。这一效应如果发生于某些特殊临床检测如血清HBsAg的筛选，则可造成大量临床标本的定量检测结果偏离真值，部分强阳性标本测值降低或显著降低，甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选，则势必导致受血者发生输血相关性肝炎的严重临床事件。鉴于血清HBsAg检测的范围及其社会影响面极大，我国已明令禁止“一步法”检测在献血员HBV感染者筛选中的应用。通过近十余年的努力，对Hooks效应干扰的认识已有很大提高，针对固相免疫实验中的Hooks效应纠正方法不断出现。但由于反应方式的大相径庭，这些方法都不能用于均相免疫实验，而有效拮抗均相免疫中Hooks效应影响的方法迄今尚未见报道与公布。均相与固相免疫的主要差别，还在于全部的固相免疫试验在操作上均存在一次甚至多次已反应物与未反应物质的分离，而均相免疫在整个的实验过程中，尤其是实验信号的米集完成后，试剂体系中的未反应物单独或与反应后物质一道存在于同一反应孔(管)中，并很好地保留着与随后加入靶物质结合的能力，这一差别，为“靶物质叠加反应”在均相免疫实验中的实施提供了契机。此外，免疫学检测方法的定量检测范围通常均较为局限，敏感性越高的试验方法其定量范围通常越窄，发光分析虽然在一定程度上能纠正这一现象，然而在兼顾方法敏感性，特异性，稳定性及试剂成本的前提下，其定量检测范围亦仅在1000ng/ml左右。如何采用单一检测对多数靶物质实施全程或亚全程定量分析已经成为制约免疫学技术发展的重要技术瓶颈。血清学免疫检测技术至少包括固相与均相免疫两类，能接受本专利措施的血清免疫学检测实验方法须具备以下前提。①不发生试剂系统对靶物质的结合能力的自消耗不发生已反应物与未反应物间的相互分离与清除“未参与反应的试剂”能在系统中较长时期保留与靶物质反应并生成检测信号的能力。符合上述条件的实验方法多集中在均相免疫实验，光激发化学发光免疫分析(LiCA)是其中的重要代表。现有血清免疫学试验尽管存在上述缺点，但在技术发展上均达到或基本达到在当前物质与技术条件下该技术可具备的最佳的状态。包括合理的实验步骤与反应条件，完善的试验操作与检测系统(仪器)，稳定的试剂质量，以及良好地检测品质(高度的特异性敏感性与稳定性)等。部分还预留进一步完善与发展的技术方向。本专利发明以上述各实验方法的最新技术成果为基础，全盘接受上述试验技术发展所取得的优良技术特征，不排斥正在或将要进行的适合本专利技术实施的任何技术革新与改造，为适应本专利实施所进行的相关改造(包括试剂改造与实验仪器改造)亦以不妨碍原有试验的操作以及技术特征的充分发挥为前提。
发明内容
本发明的目的是对现有的光激发化学发光免疫分析方法进行改进，提供一种能纠正Hooks效应并扩大定量检测范围的光激发化学发光免疫分析方法。上述目的是通过以下技术方案实现的一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法，包括如下步骤向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球，混匀后温育以发生免疫反应；然后用激发光激发上述免疫反应后的反应体系，并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度，检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系，第一次确定靶物质含量；在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后，向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂，混匀后温育发生免疫叠加反应；然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系，并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度；根据第一次和第二次的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系，并据此计算待测标本中的靶物质浓度所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5-50:1，当所述待测靶物质为抗原时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10_200000ng/ml ；当所述待测靶物质为抗体时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为I. 0-20000IU/ml ο当所述待测靶物质为抗原(如血清HBsAg)时，优选的抗He试剂中靶物质的浓度为2000ng/ml。当所述待测靶物质为抗体(如血清抗HBc)时，优选的抗He试剂中靶物质的浓度为1000IU/ml。优选的，所述的反应体系与抗He试剂的体积比为10:1。
优选的，所述激发光波长为680nm,发射光波长为610_615nm。所述包被靶物质抗体的发光微球的浓度为lO-lOOPg/ml，所述生物素标记的靶物质抗体浓度为I. O-lOPg/ml，所述链亲和素包被的感光微球浓度为lO-lOOPg/ml，所述血清与包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球的体积比依次为1:1:1:7。所述室温下温育的时间为5-60分钟。所述上述各项试验条件，以能产生足以可供分析的试验信号，并以不发生对试验效果的干扰为前提，由于本专利主要发明点为抗He介入及其靶物质叠加免疫反应，现阶段LiCA检测部分的主要实验条件(即优选实验条件)的选择依据市售试剂的规定，并接受可能出现的适宜本专利实施的改进；所述的方法在血清HBsAg、抗HBc、AFP定性和定量检测中的应用。在LiCA检测中，当第一次LiCA反应及其检测完毕后，包括标本在内的全部的反应体系仍旧存在于反应孔中。阴性，及其低浓度阳性孔中的抗体或包被了抗体与亲和素的发光微球未经或仅部分与靶物质(如抗原)发生反应，全部或多数抗体或包被了抗体的发光微球得以保留并具备与后续加入的靶物质发生反应的能力，其反应强度足以使第二次LiCA检测所获得的信号(单独或与一次LiCA反应信号叠加)达到饱和或过饱和状态。在“靶物质叠加反应”过程中能与随后加入的靶物质(其浓度以能产生可供识别与分析的试验信号为度，通常以产生饱和LiCA信号的靶物质的2倍为佳)发生反应并产生新的实验信号，这一信号与第一次LiCA检测的信号有机叠合，可使第二次LiCA所检测出的信号强于或显著强于该类标本所产生的第一次LiCA检测信号。通过对其信号增强幅度的分析，可提示被检测标本中的靶物质为阴性，或低浓度阳性状态。而靶物质强阳性与超强阳性(即假阴性)孔中的抗体或包被了抗体的发光微球体系已经与靶物质充分反应并为其饱和与过饱和，在一次LiCA检测中已表现出试验信号强度与靶物质浓度的负相关关系(不同程度Hooks效应所致)。不仅不具备与后续加入的靶物质继续反应的能力，其信号强度并可能存在受再次加入抗原的负面影响而出现降低的趋势。在“靶物质叠加反应”后的LiCA反应中，所检测到的信号(第二次LiCA信号)基本由第一次LiCA反应产生，其强度与一次LiCA相当，略低或略强于(因测试原因)一次LiCA检测的信号。如图I所示，受Hooks效应影响，高与超高浓度靶物质区段标本一次LiCA检测信号的强度与靶物质的浓度呈负相关，这种因浓度升高而造成的检测信号渐进性降低，其原理与竞争抑制法(如竞争抑制性ELISA)类似，其表现呈检测信号的渐进性降低，两者的改变亦具有良好地剂量相关性。综合上述靶物质叠加LiCA所体现的种种实验信号内涵，可将被测标本划分为如下5类即①阴性LiCA常规定量范围内的低阳性；③饱和信号的阳性信号因Hooks效应降低的高阳性；⑤信号接近或低于域值的超高阳性(即假阴性)。表I为对上述5类标本实施靶物质叠加反应前后两次LiCA检测试验信号特征的分析。表I靶物质叠加免疫反应LiCA检测实验标本浓度区间评估方法浓度冈间第一次LiA分析第二次LjCA分析I两者信号比较结果认定方式
接近或达饱和信根据第一次LiCA确
阴性域值以下十分显著升高
号认阴性
随浓度h升渐进接近或达饱和信根据第一次LiCA定
低浓度阳性不同程度升高
升高号量分析
接近或达饱和信仅能提示浓度区间， 中浓度阳性信号饱和状态基本无改变
号暂时无法定量分析
随浓度上升渐进根据第一次LiCA定
高浓度阳性随浓度渐进降低基本无改变
降低量分析
域值附近或以
超高浓度阳性域值附近或以下基本无改变能提示浓度区间
下，假阴性从表I可以看出，通过靶物质免疫叠加反应及对第一次LiCA检测信号和第二次LiCA检测信号进行对比分析，便可消除Hooks效应所致的假阴性，并大幅提升定量分析能力。从而实现对靶物质在更高层面上的定性和定量分析。所述的方法同时可用于血清HBsAg、抗HBc、AFP等以外的其它抗原与抗体的定性和定量检测。当然，本发明的原理也可用于其它均相免疫分析，如酶联均相免疫分析与免疫凝集试验分析等，能接受此改进措施的方法如前所述。这类方法通过引入“靶物质叠加反应”，亦可达到消除Hooks效应影响并提升定量检测范围的目的。
图I是受Hooks效应影响的LiCA检测分段曲线图。图2是低浓度组标本HBsAg浓度与LiCA信号之间的线性关系曲线图。图3是高浓度标本HBsAg浓度与第一次LICA检测信号之间的线性关系曲线图。图4是高浓度标本HBsAg浓度与第二次LiCA检测信号之间的线性关系曲线图。图5是高浓度标本HBsAg浓度与第二次LiCA检测信号饱和度之间的线性关系曲线图。图6是低浓度组标本抗HBc浓度与LiCA信号之间的线性关系曲线图。图7是高浓度标本抗HBc浓度与第一次LICA检测信号之间的线性关系曲线图。图8是高浓度标本抗HBc浓度与第二次LiCA检测信号之间的线性关系曲线图。图9是高浓度标本抗HBc浓度与第二次LiCA检测信号饱和度之间的线性关系曲线图。图5、图9中，横坐标为待测靶物质浓度，纵坐标为第一 /第二次LiCA检测光子数比率(％)。其余各图中，横坐标为待测靶物质浓度，纵坐标为检测到的光子数。
具体实施例方式实施例I 检测HBsAg的方法一、检测方法方法名称HBsAg检测靶抗原叠加LiCA ；原有方法名称HBsAg检测LiCA;敏感性0.05-1. Ong/ml ；定量范围0·1-500 至 1000ng/ml 内；Hooks效应起点(即反应信号呈浓度依赖性降低起点)约50 000ng/ml左右； 假阴性出现浓度(反应信号接近cut off值)大于I OOOPg/ml ；二、材料I、仪器与耗材检测仪器LiCA HT光激化学发光检测仪；由中国博阳生物(上海)科技有限公司制造;2、试剂(I)血清HBsAg检测光激化学发光试剂盒由博阳生物(上海)科技有限公司制造，市售获得。包括下述试剂试剂I :Anti-HBs包被发光微球，浓度为4(^g/ml ；试剂2 :生物素化Anti-HBs，浓度为4· 0μδ/πι1 ；试剂3 :链亲和素(SA)包被感光微球(通用微球)，浓度为5(^g/ml。(2)抗 He 试剂(全称:抗 Hooks 效应试剂,Anti Hooks Effect Agent,抗 He):主要成分为HBsAg，浓度范围10-200 000ng/ml ;本实施例选用三种不同HBsAg浓度的抗He，分别为2000ng/ml、10. Ong/ml、200 000ng/ml。(3)标准血清，含已知浓度HBsAg的血清，或纯化HBsAg溶液。窄幅标准血清自制，或由上述LiCA试剂盒配备；用于低靶物质浓度标本的计量分析(通常6个，浓度范围在1000ng/ml以内)；宽幅标准血清自制，浓度经卫生部生物制品检定所标定。用于高及超高靶物质浓度组的计量分析(通常6个，浓度范围在200(^g/ml以内)；本次使用的自制参比血清系纯化自然表达HBsAg，紫外光谱吸收检测其浓度；免疫活性未与市售标准品作严格比对。(4)阴性对照与阳性对照血清自制或市售试剂配备；用于域值确认，反应性评价，以及饱和信号强度的确认(现阶段主要用自制阳性对照血清);(5)待检标本血清,血浆或其它体液；其它标本(如基因重组表达产物)。三、操作步骤I.试验准备取出所有试剂与标本，并恢复至室温。2.实验操作(I)取待测标本，阴、阳性对照，及其HBsAg定量标准血清系列各25μ1，分别加至LiCA板各反应孔中，每份标本加一孔(或根据需要的任意孔)；
(2)旋即加入试剂1，每一反应孔加入各25μ1。(3)旋即加入试剂2，每一反应孔加入各25μ1，37 温育15分钟，(4)加入试剂3，每一反应孔加入各175μ1，混匀，37°C温育15分钟；(5)置LICA发光检测仪上，采用680nm波长激发，610nm波长检测各孔信号，初步评价检测标本的信号强度，并绘制标准曲线；(6)每一反应孔加入抗He试剂各25μ1,混勻，37°C温育20分钟；(7)再次置LiCA发光检测仪上，采用680nm波长激发，610nm波长检测各孔信号，并初步评价各反应孔信号强度；根据第一，第二次LiCA检测结果，将待测标本分别归类为5个靶物质浓度区间，归 类方式见表I。四、结果分析根据阴性对照结果按常规确定检测域值；根据阳性对照孔(既定浓度靶物质)均值确定饱和信号强度；根据饱和信号强度计算各实验孔二次LiCA信号饱和度；根据一，二次LiCA测值计算各实验孔(两者)信号比值；根据第一及第二次检测结果及其上述分析指标对被检测标本进行靶物质浓度分类，分类方式见下表。表2受检标本中靶物质表达浓度状态分类表
类别与表I 一次实验信号二次实验信号I 二次信号饱I一/二次信I大致浓度范围估 达状态和度号比评
I阴性域值或以下贴近饱和信号接近100% <5%无
2低阳低于饱和信号95% 贴近饱和信号接近100% 5S100% < 1000ng/nil
3中阳贴近饱和信号贴近饱和信号接近100%接近100% 1000-40000ng/ml
4高阳低于饱和信号95%低于饱和信号9』<95% 彡100% 40-1000Pg/ml
5超高阳域值或以下域值或以下<5%接近100% >1000Rg/ml( I)根据各标本的检测数据以及前述分析，自上表中确定各自的靶物质浓度状态，并对阴性，中等程度阳性，及其假阴性(即第1、3、5类标本)作出定性报告；(2)采用前述制备的低及高浓度标准品系列孔检测数据绘制的标准曲线，分别对归类于低阳与高阳组(即第2、4类标本)的标本以回归法判读定量检测数据。五、检测效果(一)采用抗He ( (2000 ng/ml)检测
I、域值与饱和信号值域值697. 5 (阴性对照均值)X2. I =1464. 8饱和信号值862478 (两孔阳性对照均值)。2、低浓度靶物质的检测效果对一组系列稀释的低浓度靶物质(参比法标定)进行检测，结果见表3。表3低浓度组HBsAg含量与LiCA信号之间的剂量相关性
权利要求
1.一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法，包括如下步骤向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球，混匀后温育以发生免疫反应；然后用激发光激发上述免疫反应后的反应体系，并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度，检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系，第一次确定靶物质含量；其特征在于在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后，向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂，混匀后温育发生免疫叠加反应；然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系，并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度； 根据第一次和第二次 的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系，并据此计算待测标本中的靶物质浓度 所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5-50:1 ； 所述待测靶物质为抗原时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10-200000ng/ml ； 所述待测靶物质为抗体时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为l-20000IU/ml。
2.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述待测靶物质为抗原，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为 2000ng/ml。
3.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述待测靶物质为抗体，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为 1000IU/ml。
4.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述的反应体系与抗He试剂的体积比为10:1。
5.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述激发光波长为680nm,发射光波长为610_615nm。
6.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述包被靶物质抗体的发光微球的浓度为IO-IOOPg/ml，所述生物素标记的靶物质抗体浓度为I. O-lOPg/ml，所述链亲和素包被的感光微球浓度为lO-lOOPg/ml，所述血清与包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球的体积比依次为1: 1: 1: 7。
7.如权利要求I所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，其特征在于所述温育的时间为5 60分钟。
8.权利要求I所述的方法在血清HBsAg定性和定量检测中的应用。
9.权利要求I所述的方法在血清抗HBc定性和定量检测中的应用。
10.权利要求I所述的方法在血清AFP定性和定量检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的靶物质进行定性与定量检测的方法，包括向待测标本中加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素包被靶物质抗体、链亲和素(SA)包被的感光微球进行第一次免疫反应和检测的步骤，还包括向反应体系中加入抗He试剂发生靶物质免疫叠加反应，并进行第二次光激发化学发光免疫检测的步骤。本发明通过对两次LiCA检测结果的综合分析达到全方位纠正Hooks效应的目标，分析过程包括根据其在一次LiCA与二次LiCA检测的信号特征将被检标本区分为阴、低阳、中阳，高阳与超高阳等五个浓度区间；根据第一次LiCA对低阳与超高阳浓度区段的标本进行定量分析。本发明具有结果准确，操作简便，适用范围广等特点。
文档编号G01N21/76GK102944672SQ20121046152
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者李方和, 李时君 申请人:李方和