专利名称：一种夹心型电化学免疫传感器、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子作为二抗的标记物构建的夹心型电化学免疫传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学免疫传感器在测定肿瘤标志物中的用途。
背景技术：
肿瘤标志物的存在或含量变化可以指示肿瘤的性质，有助于了解肿瘤的组织起源和细胞分化，从而帮助肿瘤的病理诊断、组织学分类、判断预后及指导临床治疗。它的发现及应用成为继影像诊断和病理诊断之后，当前临床检测肿瘤常用的方法之一，并用于肿瘤的随访及治疗效果观察。目前肿瘤标志物的临床检测方法很多，有放射免疫测定法、酶联免疫分析测定法和化学发光免疫分析测定法等。但这些检测方法存在如下不足。(I)放射免疫测定法虽具有操作简便、成本低等优点，但该法放射性污染严重，且灵敏度低，检测限高，因此限制了它的应用。(2)酶联免疫分析测定法酶联免疫分析测定法因标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，得到了迅速的普及和发展。但酶联免疫分析测定法中的酶容易失活，导致其信号时间短，降低了该方法的灵敏度和重现性。(3)化学发光免疫分析测定法这一方法具有灵敏、快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作，方法灵活多样的优点。但是影响化学发光分析的检测结果的因素较多，因此其稳定性较差，而且在发生化学反应之后，样品的发光无法再现。电化学免疫传感器，尤其是夹心型电化学免疫传感器，由于具有检测灵敏度高、选择性好并且易于小型化等优点，备受人们的关注。石墨烯具有极好的结晶性和非凡的电子学、热力学和力学性能，因此是人们广泛关注的焦点。在石墨烯的研究和应用中，为了充分发挥其优良性质，必须对石墨烯进行功能化。也就是在石墨烯材料优势基础上，进一步对材料进行性能改性和优化，合成了生物相容性优异的氮掺杂石墨烯，从而达到更好固定修饰材料的目的。为了实现对肿瘤早期低丰度蛋白质标志物的准确检测，人们通常采用纳米材料作为标记物，如金属纳米粒子、量子点、碳纳米管等，由于它们具有比表面积大、表面活性位点多、优良的光电特性和较强的生物亲和性等优点，能够加快响应界面电子传导或催化电极表面化学反应的速度，因此被广泛应用于电化学免疫传感器的构建之中。纳米材料的这种信号放大作用，使得传感器的灵敏度得到了大大提高。其中，哑铃型纳米粒子是一种非常理想的具有良好应用前景的纳米材料，它是由两种不同功能的纳米粒子紧密接触形成的哑铃型结构的纳米粒子。哑铃型纳米粒子中的两个独立纳米粒子通过因在界面产生的电子转移而导致的界面相互作用得到了单一纳米粒子所不具备的独特性能。而哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子用于检测多种肿瘤标志物电化学免疫传感器的构建尚未见报道。本发明将壳聚糖分散的氮掺杂石墨烯滴涂到玻碳电极表面，以戊二醛作交联剂用于固定一抗及抗原，哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子作为二抗的标记物，制备了检测多种肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，测试结果显示，上述方法制备的电化学免疫传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种夹心型电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖分散的氮掺杂石墨烯、戊二醛、一抗、牛血清蛋白、肿瘤标志物抗原和哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗。本发明的再一个目的在于提供一种夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。本发明的另一目的是提供所述夹心型电化学免疫传感器在测定肿瘤标志物中的用途。所述肿瘤标志物为宫颈癌、胃癌、肝癌和卵巢癌的肿瘤标志物。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的夹心型电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖分散的氮掺杂石墨烯、戍二醒、一抗、牛血清蛋白、肿瘤标志物抗原和哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗。所述工作电极与参比电极、对电极组成夹心型电化学免疫传感器来检测多种肿瘤标志物抗原。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为钼丝电极。本发明的夹心型电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤
a、合成氮掺杂的石墨烯；
b、制备哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗(Ab2)溶液；
C、制备电化学免疫传感器工作电极；
d、制作电化学免疫传感器工作曲线。其中，步骤a的合成氮掺杂的石墨烯，具体包括以下步骤
①氧化石墨稀的合成将石墨和闻猛酸钟混合(质量比1:9),放入带有磁子的二口瓶中，然后加入浓硫酸和磷酸混合液(体积比9:1 )，将三口瓶放入油浴，加热到50 °C，反应12h之后，将样品倾倒在冰上，加入过氧化氢，磁力搅拌0.5 h。反应结束后，将得到的混合物离心、洗涤、弃去上清液，经干燥后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯；
②氮掺杂石墨烯的合成称取上述步骤①制备的氧化石墨烯，溶于水后，用30%的氨水调节其PH=IO. 0，加入水合肼(与氧化石墨烯溶液体积比为1:35)，室温磁力搅拌10 min,转移至高压釜，120 °C条件下，反应12 h。得到的混合液，离心洗涤，洗到中性，室温真空干燥，得到氮掺杂石墨烯。步骤b的制备哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液,具体包括以下步骤
①在不断流动的氩气环境中，将乙酰丙酮钼(II)，油酸，油胺和正十八烷混合(物质的量之比为1:3:3:30)；
②将上述混合溶液以恒定的速率加热到120°C。然后加入Fe(CO)5 (与乙酰丙酮钼
(II)的物质的量之比为4:1)，温度升高至280 °C并保持20 min ； ③将所得到的混合溶液用过量乙醇沉淀，然后离心10min，再将制备的沉淀物溶解在正己烷中，并用乙醇反复洗涤、离心；
④将上述得到的产品溶解在甲苯中，然后真空干燥，即可得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子固体；
⑤将称取好的上述Pt-Fe3O4纳米粒子加入到CTAB(质量比为1:18)溶液中，超声0. 5 h。离心15 min后加入Ab2和pH= 7. 4的PBS缓冲溶液，在4°C震荡24 h，得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液。步骤c的制备电化学免疫传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤
①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；
②用质量分数0.5%的壳聚糖溶液为溶剂配制浓度为Img/mL的氮掺杂石墨烯溶液。然后将氮掺杂石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③将戊二醛滴到电极表面，并保持湿润放置Ih左右，在电极半干的时候滴上I mg/mL的一抗溶液，晾干；
④再在电极表面修饰质量分数为1%的BSA溶液以消除电极的非特异性活性位点。用PH为7. 4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液；
⑤将Pt-Fe3O4预先孵化好的二抗溶液修饰到电极上，在4°C保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。步骤d的制作电化学免疫传感器工作曲线，步骤如下
①将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；
②pH7. 4的PBS缓冲溶液(含0. I mol/LKCl作为支持电解质)作为底液，通过计时电流法检测修饰好的工作电极对过氧化氢的响应；根据所得电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学免疫传感器在测定多种肿瘤标志物中的用途。所述肿瘤为宫颈癌、胃癌、肝癌和卵巢癌，所述宫颈癌肿瘤标志物为see、CA 12-5和CEA，所述胃癌肿瘤标志物为CA72-4、CEA和CA19-9，所述肝癌肿瘤标志物为AFP和CEA，所述卵巢癌肿瘤标志物为CA12-5、AFP、HCG和CEA。本发明的有益成果
(I)本发明的发明人首次将哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子作为二抗标记物引入到肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备当中，利用Pt纳米粒子和Fe3O4纳米粒子的协同作用，使所制作的电极有更高的灵敏度和更宽的检测范围。(2)在本发明的制备方法中，由于氮原子的引入可以调整石墨烯的能带结构和物理化学形式，使得氮掺杂的石墨烯进一步提高了传感器的灵敏度。(3)使用完全相同的纳米材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变肿瘤标志物种类即可实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测，此方法操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的测定，有利于肿瘤标志物传感器的商品化。(4)将哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子与肿瘤标志物二抗直接孵化，利用其优异的生物相容性和高的催化性能，在二抗的标记物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的检测误差，简化了二抗标记物的制作步骤，显著提高了电化学免疫传感器的重现性和稳定性。
本发明的电化学免疫传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析。
下面结合
和具体实施例对本发明做进一步详细描述。图I为本发明的哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子的TEM照片。图2为本发明的(A) Pt，⑶Fe3O4, (C) Pt-Fe3O4对H2O2的循环伏安图。图3为本发明的免疫传感器对SCC测定的工作曲线。
具体实施例方式本发明使用的SCC、CA12-5、CEA、AFP、HCG、CA72-4和CA19-9均购自上海生工生物工程有限公司，乙酰丙酮钼(98%)购自百灵威公司，油胺(80%-90%)、正十八烷购自阿拉丁试剂有限公司，无水乙醇(分析纯)购自天津市福宁精细化工有限公司；正己烷、油酸、石墨粉和铁氰化钾均购于国药集团化学试剂有限公司，戊二醛、牛血清白蛋白(96%-99%)购自Sigma-Aldrich公司，过氧化氢(30%)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。实施例I制备夹心型电化学免疫传感器
(I)合成氮掺杂的石墨烯
氧化石墨稀的合成将0. 3 g的石墨和I. 8 g闻猛酸钟混合，放入带有磁子的二口瓶中，将体积比为9:1混合的浓硫酸和磷酸混合液40 mL加入到以上三口瓶中。将三口瓶放入油浴，加热到50 °C，反应12 h，反应结束之后，将样品倾倒到大约40 mL的冰上，同时把磁子放到倾倒的冰水混合物上,慢慢的磁力搅拌,加入30 %过氧化氢0. 3 mL，冰逐渐融化，磁力搅拌0.5 h。反应结束后，将得到的混合物在8000 R的转速下离心0.5 h，然后分别用20 mL的水、20 mL 30%的盐酸、20 mL乙醇分别离心洗涤三次，弃去上清液，最后用20 mL乙醚离心洗涤，弃去上清液，最后得到的固体样品放到真空干燥箱35 °C干燥，干燥完后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯；
氮掺杂石墨烯的合成称取140 mg上述步骤制备的氧化石墨烯，加入70 mL水，加入30%的氨水，调节pH=10.0，加入2 mL水合肼，室温磁力搅拌10 min，转移至高压釜，80 °〇条件下，反应12 h。得到的混合液，离心分离后用水洗涤至中性，室温真空干燥，得到氮掺杂石墨稀。(2)制备哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液
①在不断流动的IS气环境中，将2mmol乙酰丙酮钼(11),6 mmol的油酸,6 mmol油胺和20 mL的正十八烷混合；
②将上述混合溶液以3°C/min的恒定速率被加热到120°C。达到这个温度后，加入8 mmol 的 Fe(CO)5Jj1Ii度升高至 280 °C并保持 20 min ；
③将所得到的混合溶液用过量乙醇沉淀，然后以9000R离心10 min。再将得到的沉淀物溶解在20 mL正己烷中，并用乙醇反复洗涤。这个过程中仍然釆用9000 R的转速离心
10min ；
④将上述得到的产品溶解在甲苯中，然后放入真空干燥箱内在35°C进行干燥，即可得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子固体；图I为制得的哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子固体的TEM照片，由该图可知，合成的Pt-Fe3O4纳米粒子确实为哑铃形，而且粒径大约为5 nm左右；
⑤为了显示哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子的优越性能,在探讨Pt-Fe3O4作为二抗标记物之前，首先对Pt-Fe3O4纳米粒子及其Pt纳米粒子、Fe3O4纳米粒子对H2O2的催化能力进行了对比实验。由图2可知Pt-Fe3O4纳米粒子对H2O2的催化能力远比Pt纳米粒子以及Fe3O4纳米粒子对H2O2的催化能力，主要是由于Pt-Fe3O4的协同作用导致了其对H2O2催化能力明显增强。因此，实验采用哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子作为二抗的标记物；
⑥称取0.018g CTAB配成I mL的水溶液，然后称取I mg的Pt-Fe3O4纳米粒子加入到已配好的CTAB溶液中，超声0.5 h。将此溶液以9000 R的转速离心15 min。然后加入25 ML 60 mg/mL的Ab2和475 ML pH为7. 4的PBS缓冲溶液，在4°C震荡24 h，得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液。(3)制备电化学免疫传感器工作电极
①将直径为4mm的玻碳电极用1.0、0. 3、0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05 mol/L铁氰化钾溶液中，在-0. 2 0.6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干；
②用质量分数0.5%的壳聚糖溶液为溶剂配制浓度为Img/mL的氮掺杂石墨烯溶液。然后取6 ML的氮掺杂石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干；
③将6ML的戊二醛滴到电极表面，并保持湿润放置I h左右，在电极半干的时候滴上6ML I mg/mL的一抗溶液(如表I、表2、表3和表4所不)，晾干；
④再在电极表面修饰6ML质量分数为1%的BSA溶液以消除电极的非特异性活性位点。用pH为7. 4的PBS溶液对电极进行清洗,晾干后，滴上一系列6 ML不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液；
⑤将6ML Pt-Fe3O4孵化好的二抗溶液修饰到电极上，在4 1保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。(4)制作电化学免疫传感器工作曲线
打开电化学工作站，将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；
10mL pH 7.4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测修饰好的工作电极对过氧化氢的响应；根据所得电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液的浓度关系，绘制工作曲线。实施例2宫颈癌肿瘤标志物的检测SCC、CA 12-5或CEA
按照实施例I所述的步骤制备电化学免疫传感器，采用该电化学免疫传感器检测表I所示的宫颈癌肿瘤标志物，其检测技术指标见表I。表I宫颈癌肿瘤标志物的检测技术指标
权利要求
1.一种夹心型电化学免疫传感器,所述电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖分散的氮掺杂石墨烯、戊二醛、一抗、牛血清蛋白、肿瘤标志物抗原和哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极。
2.—种权利要求I所述的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所述方法包括如下步骤 a、合成氮掺杂的石墨烯； b、制备哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗(Ab2)溶液； C、制备电化学免疫传感器工作电极； d、制作电化学免疫传感器工作曲线。
3.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤a合成氮掺杂的石墨烯包括以下步骤 ①氧化石墨烯的合成将质量比1:9的石墨和高锰酸钾混合，放入带有磁子的三口瓶中，然后加入体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合液，将三口瓶放入油浴，加热到50 V，反应12h之后，将样品倾倒在冰上，加入过氧化氢，磁力搅拌O. 5 h;反应结束后，将得到的混合物离心、洗涤、弃去上清液，经干燥后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯； ②氮掺杂石墨烯的合成称取上述步骤①制备的氧化石墨烯溶于水后，用30%的氨水调节其PH=IO. O,加入水合肼，其中所述水合肼与氧化石墨烯溶液体积比为1:35，室温磁力搅拌10 min，转移至高压釜，120 °C条件下反应12 h，得到的混合液，离心洗涤，洗到中性，室温真空干燥，得到氮掺杂石墨烯。
4.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤b制备哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液包括以下步骤 ①在不断流动的氩气环境中，将物质的量之比为1:3:3:30的乙酰丙酮钼(II)、油酸、油胺和正十八烷混合； ②将上述混合溶液以恒定的速率加热到120°C，然后加入Fe(CO)5，其中，所述Fe(CO)5与乙酰丙酮钼(II)的物质的量之比为4:1，温度升高至280 °C并保持20 min ； ③将所得到的混合溶液用过量乙醇沉淀，然后离心10min，再将制备的沉淀物溶解在正己烷中，并用乙醇反复洗涤、离心； ④将上述得到的产品溶解在甲苯中，然后真空干燥，即可得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子固体； ⑤将称取好的上述Pt-Fe3O4纳米粒子加入到CTAB溶液中，二者的质量比为1:18，超声O. 5 h，离心15 min后加入Ab2和pH= 7. 4的PBS缓冲溶液，在4°C震荡24 h，得到哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子孵化的二抗溶液。
5.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤c制备电化学免疫传感器工作电极的方法包括以下步骤 ①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ②用质量分数O.5%的壳聚糖溶液为溶剂配制浓度为I mg/mL的氮掺杂石墨烯溶液，然后将所述氮掺杂石墨烯溶液滴到电极上，室温晾干； ③将戊二醛滴到电极表面，并保持湿润放置Ih左右，在电极半干的时候滴上I mg/mL的一抗溶液，晾干；④再在电极表面修饰质量分数为1%的BSA溶液以消除电极的非特异性活性位点，用PH为7. 4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，滴上一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液； ⑤将Pt-Fe3O4预先孵化好的二抗溶液修饰到电极上，在4°C保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。
6.如权利要求2所述的制备方法，其中，步骤d制作电化学免疫传感器工作曲线的步骤如下 ①将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上； ②含0.I mol/LKCl作为支持电解质的pH 7. 4的PBS缓冲溶液作为底液，通过计时电流法检测修饰好的工作电极对过氧化氢的响应；根据所得电流响应与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
7.如权利要求I所述的夹心型电化学免疫传感器在测定肿瘤标志物中的用途。
8.权利要求7所述的用途，其中，所述肿瘤为宫颈癌、胃癌、肝癌和卵巢癌。
9.权利要求8所述的用途，其中，所述宫颈癌肿瘤标志物为SCC、CA12-5和CEA，所述胃癌肿瘤标志物为CA72-4、CEA和CA19-9，所述肝癌肿瘤标志物为AFP和CEA，所述卵巢癌肿瘤标志物为CA12-5、AFP、HCG和CEA。
全文摘要
本发明涉及一种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于哑铃型Pt-Fe3O4纳米粒子作为二抗的标记物构建的夹心型电化学免疫传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学免疫传感器在测定肿瘤标志物中的用途。本发明的电化学免疫传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析。
文档编号G01N27/26GK102980925SQ201210485750
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者吴丹, 张勇, 魏琴, 范海霞, 杜斌 申请人:济南大学