专利名称：白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种白血病细胞特征分子的检测方法，特别是一种检测特征分子(未知蛋白质)在不同类型白血病细胞中表达的敏感性和特异性的方法。
背景技术：
目前血液病的分子检测方法尤其是白血病传统分型(WHO分型)包含了造血细胞形态学信息、免疫学信息及遗传学信息，尚缺乏蛋白质组学特别是质谱特征信息。蛋白质是生命活动及疾病发生发展的物质基础。随着高通量质谱检测方法(SELDI)的发展，质谱检测 方法在疾病的早期检测、疗效观察、微小残留病监测等方面展现了良好的临床应用前景，通过质谱检测发现了大量差异蛋白，特别是有关肿瘤细胞蛋白质谱特征的研究，为恶性肿瘤的早期监测和发现带来新的手段。目前，以单抗为探针检测单个白血病活细胞的蛋白质表达，根据免疫表型分型进行白血病蛋白质免疫分型，具有及时、准确的特点，是临床检测白血病细胞的主要手段，在白血病诊治活动中具有重要作用。然而，这种检测方法以已知蛋白质(单抗检测的抗原)为基础，可检测蛋白质数量仅数十种，对白血病细胞的蛋白质信息的了解很不全面，不能更好地指导白血病治疗。白血病细胞表达的蛋白质数量超过千种，检测其包含未知蛋白质在内的蛋白质组将能获得更多重要信息。目前，关于白血病细胞的蛋白质组特征分子的信息都是基于单个类型白血病的质谱研究，这种研究可以发现特征分子，但不能明确特征分子的多种特性及其分类价值，对进一步纯化和鉴定特征分子缺乏指导作用。对不同类型白血病细胞的蛋白质谱特征分子的研究可以解决该缺点，但尚缺乏可行的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，要解决的技术问题是建立白血病细胞的蛋白质谱分析模型。本发明提供了一种白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，包括如下步骤步骤一用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定四种不同白血病早幼粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性髓系单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及对照组健康骨髓中的单个核细胞的蛋白质谱图，并将其集合成蛋白质谱图库；步骤二 应用蛋白质芯片数据采集系统、生物标志物向导系统处理所述蛋白质谱图库形成蛋白质谱图数据库，再用生物标志物分析系统对蛋白质谱图数据库进行分析，以蛋白质谱图数据库的特征分子建立白血病细胞蛋白质谱分析模型；步骤三从白血病细胞蛋白质谱分析模型中读取不同类型白血病细胞的特征分子及其表达特性，筛选出用来显著区分各组的特征分子健康骨髓单个核细胞特征分子M3667和M3829 ;早幼粒细胞白血病特征分子M1593和M1695 ;急性髓系粒细胞白血病特征分子M2121 ;急性髓系单核细胞白血病特征分子M2536 ;急性淋巴细胞白血病特征分子M1016。
所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z，1047m/z，4884m/z，3025m/z ；2121m/z,2678m/z，1212m/z，1097m/z,11156m/z，1503m/z,1695m/z，1964m/z,1215m/z，5539m/z，1000m/z，1213m/z，1497m/z,llllm/z。所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z,或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1215m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z， 或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1215m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，或3667m/z，1497m/z ；检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或3667m/z，1497m/z ；检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z, 1497m/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；
或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z0所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，16443m/z，1000m/z，2742m/z, 1067m/z，9552m/z，1000m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z，1944m/z，1115m/z，1059m/z，1213m/z，1137m/z，1108m/z，1029m/z，1763m/z。所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z， 或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z，1137m/z，或3829m/z，1763m/z，检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或3829m/z，1763m/z，检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1763m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z,1137m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，
或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z,2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，
或3829m/z，1763m/z，检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或3829m/z，1763m/z0所述步骤三中的筛选是优选以白血病细胞蛋白质谱分析模型中各节点的差异蛋白以及其分类价值为基础，根据分析模型读取的样本数、分离值、特异性和敏感性数值进行多重筛选，进而筛选出节点样本数大于15，分离值大于I. 5，且分类价值明确的用来显著区分各组的特征分子。本发明还提供了一种白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法，包括如下步骤步骤一用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定四种不同白血病早幼粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性髓系单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及对照组健康骨髓中的单个核细胞的蛋白质谱图，并将其集合成蛋白质谱图库；步骤二 应用蛋白质芯片数据釆集系统、生物标志物向导系统处理所述蛋白质谱图库形成蛋白质谱图数据库，再用生物标志物分析系统对蛋白质谱图数据库进行分析，以蛋白质谱图数据库的特征分子建立白血病细胞蛋白质谱分析模型。所述的白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法中，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1215m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，
检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1215m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，
或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，或3667m/z，1497m/z ；检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或3667m/z，1497m/z ；检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1497m/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z，或3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z,4484m/z,1964m/z0所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，16443m/z，1000m/z，2742m/z, 1067m/z，9552m/z，1000m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z，1944m/z，1115m/z，1059m/z，1213m/z，1137m/z，1108m/z，1029m/z，1763m/z。所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z，1137m/z，或3829m/z，1763m/z，检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成
3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，
或3829m/z，1763m/z，
检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1763m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z,1137m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或3829m/z，1763m/z，检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白优选由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或3829m/z，1763m/z0本发明与现有技术相比，建立不同类型白血病的蛋白质谱数据库，构建了白血病细胞蛋白质谱分析模型，临床验证了分析模型的正确性，该分析模型有潜力应用于白血病细胞性质的判别；通过该分析模型明确了 109个白血病蛋白质谱特征分子的多种特性(质荷比、差异性、分离值、特异性、敏感性)及其分类价值；确定了正常骨髓重要特征分子为M3667和M3829、APL重要特征分子为M1593和M1695、AML-Gra重要特征分子为M2121、AML-Mon重要特征分子为M2536 ;ALL重要特征分子为M1016 ;这些重要特征分子可作为白血病靶向药物的靶点研究以及白血病生物标志物临床应用。
图I为白血病的蛋白质谱分析模型-主模型最大规模的分类树的结构示意图。图2为图I的分类树根节点NI放大细节图。图3为图I的分类树节点N2放大细节图。图4为图I的分类树节点N3放大细节图。图5为图I的分类树节点N4放大细节图。 图6为图I的分类树节点N5放大细节图。图7为图I的分类树节点N6放大细节图。图8为图I的分类树节点N7放大细节图。图9为图I的分类树节点N8放大细节图。图10为图I的分类树节点N9放大细节图。图11为图I的分类树节点NlO放大细节图。图12为图I的分类树节点Nll放大细节图。图13为图I的分类树节点N12放大细节图。图14为图I的分类树节点N13放大细节图。图15为图I的分类树节点N14放大细节图。图16为图I的分类树节点N15放大细节图。图17为图I的分类树节点N16放大细节图。图18为图I的分类树节点N17放大细节图。图19为图I的分类树节点N18放大细节图。图20为图I的分类树节点N19放大细节图。图21为图I的分类树节点N20放大细节图。图22为图I的分类树节点N21放大细节图。图23为图I的分类树节点N22放大细节图。图24为图I的分类树终节点TNl放大细节图。图25为图I的分类树终节点TN2放大细节图。图26为图I的分类树终节点TN3放大细节图。图27为图I的分类树终节点TM放大细节图。图28为图I的分类树终节点TN5放大细节图。图29为图I的分类树终节点TN6放大细节图。图30为图I的分类树终节点TN7放大细节图。图31为图I的分类树终节点TN8放大细节图。图32为图I的分类树终节点TN9放大细节图。图33为图I的分类树终节点TNlO放大细节图。
图34为图I的分类树终节点TNll放大细节图。图35为图I的分类树终节点TN12放大细节图。图36为图I的分类树终节点TN13放大细节图。图37为图I的分类树终节点TN14放大细节图。
图38为图I的分类树终节点TN15放大细节图。图39为图I的分类树终节点TN16放大细节图。图40为图I的分类树终节点TN17放大细节图。图41为图I的分类树终节点TN18放大细节图。图42为图I的分类树终节点TN19放大细节图。图43为图I的分类树终节点TN20放大细节图。图44为图I的分类树终节点TN21放大细节图。图45为图I的分类树终节点TN22放大细节图。图46为图I的分类树终节点TN23放大细节图。图47为白血病的蛋白质谱分析模型-最优竞争者模型的分类树的结构示意图。图48为图47的分类树根节点NI放大细节图。图49为图47的分类树节点N2放大细节图。图50为图47的分类树节点N3放大细节图。图51为图47的分类树节点N4放大细节图。图52为图47的分类树节点N5放大细节图。图53为图47的分类树节点N6放大细节图。图54为图47的分类树节点N7放大细节图。图55为图47的分类树节点N8放大细节图。图56为图47的分类树节点N9放大细节图。图57为图47的分类树节点NlO放大细节图。图58为图47的分类树节点Nll放大细节图。图59为图47的分类树节点N12放大细节图。图60为图47的分类树节点N13放大细节图。图61为图47的分类树节点N14放大细节图。图62为图47的分类树节点N15放大细节图。图63为图47的分类树节点N16放大细节图。图64为图47的分类树节点N17放大细节图。图65为图47的分类树节点N18放大细节图。图66为图47的分类树节点N19放大细节图。图67为图47的分类树节点N20放大细节图。图68为图47的分类树节点N21放大细节图。图69为图47的分类树节点N22放大细节图。图70为图47的分类树节点N23放大细节图。图71为图47的分类树终节点TNl放大细节图。图72为图47的分类树终节点TN2放大细节图。
图73为图47的分类树终节点TN3放大细节图。图74为图47的分类树终节点TM放大细节图。图75为图47的分类树终节点TN5放大细节图。图76为图47的分类树终节点TN6放大细节图。图77为图47的分类树终节点TN7放大细节图。图78为图47的分类树终节点TN8放大细节图。
图79为图47的分类树终节点TN9放大细节图。图80为图47的分类树终节点TNlO放大细节图。图81为图47的分类树终节点TNll放大细节图。图82为图47的分类树终节点TN12放大细节图。图83为图47的分类树终节点TN13放大细节图。图84为图47的分类树终节点TN14放大细节图。图85为图47的分类树终节点TN15放大细节图。图86为图47的分类树终节点TN16放大细节图。图87为图47的分类树终节点TN17放大细节图。图88为图47的分类树终节点TN18放大细节图。图89为图47的分类树终节点TN19放大细节图。图90为图47的分类树终节点TN20放大细节图。图91为图47的分类树终节点TN21放大细节图。图92为图47的分类树终节点TN22放大细节图。图93为图47的分类树终节点TN23放大细节图。图94为图47的分类树终节点TN24放大细节图。图95为根据白血病的蛋白质谱分析模型得出的标记有重要的高表达特征分子的健康骨髓蛋白质特征质谱图。图96为根据白血病的蛋白质谱分析模型得出的标记有重要的高表达特征分子的早幼粒细胞白血病蛋白质特征质谱图。图97为根据白血病的蛋白质谱分析模型得出的标记有重要的高表达特征分子的急性髓系粒细胞白血病蛋白质特征质谱图。图98为根据白血病的蛋白质谱分析模型得出的标记有重要的高表达特征分子的急性髓系单核细胞白血病蛋白质特征质谱图。图99为根据白血病的蛋白质谱分析模型得出的标记有重要的高表达特征分子的急性淋巴细胞白血病蛋白质特征质谱图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。本发明涉及试剂的配制如下(1)U9细胞裂解液，总量5ml (含9M的尿素，质量百分数2%的3_环乙胺_1_丙磺酸，质量百分数1%的二硫苏糖醇)先用2ml去离子水溶解2. 7g尿素(美国Sigma公司)，若溶解速度太慢可在37°C水浴下溶解，完全溶解后再加入O. Ig的3-环乙胺-I-丙磺酸(美国Sigma公司),0. 05g 二硫苏糖醇(美国Sigma公司)，定容到5ml，即得到U9细胞裂解液，将配好的U9细胞裂解液用O. 5ml EP管分装，每管100 μ 1，_80°C冰箱保存备用。(2 )半饱和CHCA溶液取乙腈(ACN，美国Sigma公司，HPLC级)100 μ 1，加入三氟乙酸(美国Sigma公司)I μ 1，再加水99 μ 1，配制成溶解液共200 μ 1，取100μ I溶解液并在其中加入CHCA( α-氰基肉桂酸，美国Sigma公司)10毫克，震荡2分钟，充分溶解，12000rpm离心2分钟，取上清100 μ 1，再用剩余100 μ I的溶解液将其稀释一倍，得到半饱和CHCA溶液(避光保存，当天使用)。
本发明实施例标本的准备以及标本分组如下(I)样品的采集、处理和保存采集白血病患者和健康志愿者骨髓每个各3ml，枸橼酸钠抗凝，用FICOLL淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，收集骨髓单个核细胞，用EP管分装，每管50 100 μ 1，放入_80°C冰箱密闭保存。(2)标本的分组从细胞的形态学(Morphology Μ)、免疫学(Immunology I)和细胞遗传学(CytogeneticC)的角度出发，按照世界卫生组织(WHO)现行的白血病分型原则，把起源于造血祖细胞的白血病分为急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)。急性淋巴细胞白血病(ALL)起源于淋巴细胞祖细胞，ALL在形态上分为ALL-Ll和ALL-L2，而在免疫学分为ALL-T和ALL-B ;急性髓系白血病(AML)起源于髓系祖细胞，AML从形态学角度分为MO M7，在免疫学上分为AML-粒系(AML-Gra)、AML-单核(AML-Mon)及AML-巨核(AML-Meg)。急性早幼粒细胞白血病APL是一种具有典型细胞遗传学和免疫学特征的特殊类型的AML-Gra，且发病率较高，因此在建模分组时把这类病例单独作为一组病例。用于构建本发明实施例的白血病分型诊断模型的病例收集自2009年10月至2011年12月期间在深圳市第二人民医院血液科治疗的白血病患者，详细记录标本的临床资料，把收集到的白血病细胞标本及对照组标本一起共分为5组急性淋巴细胞白血病组(ALL)，40例；早幼粒细胞白血病组(APL)，37例；急性髓系粒细胞白血病组(AML-Gra以下简称Gra), 37例；急性髓系单核细胞白血病组(AML-Mon，以下简称Mon)，37例；对照组骨髓单个核细胞(BM)，38例(来自健康志愿者)，总计189例，白血病质谱数据库中样本的分组及临床资料见表 1，其中 CD 分子即 CD2、CD5、CD7、CD10、CD13、CD14、CD19、CD20、CD33、CD34、CD38、CD64、CD117、CD5、胞浆(C) cCD3、cCD79a 以及 HLA-DR、cMPO 的表达通过流式细胞术(FCM)检测；PML/RARa融合基因通过荧光原位杂交法(FISH)检测。表I白血病质谱数据库样本分组及临床资料
权利要求
1.一种白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，包括如下步骤 步骤一用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定四种不同白血病早幼粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性髓系单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及对照组健康骨髓中的单个核细胞的蛋白质谱图，并将其集合成蛋白质谱图库； 步骤二 应用蛋白质芯片数据釆集系统、生物标志物向导系统处理所述蛋白质谱图库形成蛋白质谱图数据库，再用生物标志物分析系统对蛋白质谱图数据库进行分析，以蛋白质谱图数据库的特征分子建立白血病细胞蛋白质谱分析模型； 步骤三从白血病细胞蛋白质谱分析模型中读取不同类型白血病细胞的特征分子及其表达特性，筛选出用来显著区分各组的特征分子健康骨髓单个核细胞特征分子M3667和M3829 ;早幼粒细胞白血病特征分子M1593和M1695 ;急性髓系粒细胞白血病特征分子M2121 ;急性髓系单核细胞白血病特征分子M2536 ;急性淋巴细胞白血病特征分子M1016。
2.根据权利要求I所述的白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1133m/z，1047m/z，4884m/z，3025m/z ；2121m/z,2678m/z，1212m/z，1097m/z,11156m/z，1503m/z,1695m/z，1964m/z,1215m/z，5539m/z，1000m/z，1213m/z，1497m/z,llllm/z。
3.根据权利要求2所述的白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中 检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z,或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1215m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ； 检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z， 检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1215m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，或 3667m/z，1497m/z ； 检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或 3667m/z，1497m/z ； 检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z,1497m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z0
4.根据权利要求I所述的白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，16443m/z，1000m/z，2742m/z, 1067m/z，9552m/z，lOOOm/z,1695m/z，2948m/z，2012m/z,1944m/z，1115m/z，1059m/z，1213m/z，1137m/z，1108m/z，1029m/z，1763m/z。
5.根据权利要求4所述的白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中 检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z， 或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z，1137m/z，或 3829m/z，1763m/z， 检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1763m/z， 检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1763m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z, 1213m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z， 或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z， 检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z, 1213m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或 3829m/z，1763m/z， 检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1763m/z0
6.根据权利要求I至5中任一项所述的白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，其特征在于，所述步骤三中的筛选是以白血病细胞蛋白质谱分析模型中各节点的差异蛋白以及其分类价值为基础，根据分析模型读取的样本数、分离值、特异性和敏感性数值进行多重筛选，进而筛选出节点样本数大于15，分离值大于I. 5，且分类价值明确的用来显著区分各组的特征分子。
7.—种白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法，包括如下步骤 步骤一用表面加强激光解吸电离_飞行时间质谱仪测定四种不同白血病早幼粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性髓系单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及对照组健康骨髓中的单个核细胞的蛋白质谱图，并将其集合成蛋白质谱图库； 步骤二 应用蛋白质芯片数据釆集系统、生物标志物向导系统处理所述蛋白质谱图库形成蛋白质谱图数据库，再用生物标志物分析系统对蛋白质谱图数据库进行分析，以蛋白质谱图数据库的特征分子建立白血病细胞蛋白质谱分析模型。
8.根据权利要求7所述的白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中 检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z,或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1215m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ； 检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z， 检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1215m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z，1047m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，或 3667m/z，1497m/z ； 检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，1097m/z，5539m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1503m/z，1000m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，或 3667m/z，1497m/z ； 检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3667m/z,1497m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，2121m/z，11156m/z，2678m/z，llllm/z，1000m/z ；或 3667m/z，1593m/z，1695m/z，3025m/z，1212m/z，1213m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z，或 3667m/z，1593m/z，2536m/z，3680m/z,1133m/z,4484m/z,1964m/z0
9.根据权利要求7所述的白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中检测四种白血病细胞和健康细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，16443m/z，IOOOm/z，2742m/z, 1067m/z，9552m/z，lOOOm/z,1695m/z，2948m/z，2012m/z,1944m/z，1115m/z，1059m/z，1213m/z，1137m/z，1108m/z，1029m/z，1763m/z。
10.根据权利要求9所述的白血病细胞蛋白质谱分析模型的建立方法，其特征在于，所述步骤二中白血病细胞蛋白质谱分析模型中 检测急性淋巴细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z，1137m/z，或 3829m/z，1763m/z， 检测早幼粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1763m/z， 检测急性髓系粒细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1763m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z, 1213m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，1067m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z， 检测急性髓系单核细胞白血病的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，16443m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z，2012m/z,或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，2948m/z, 1944m/z，1115m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z, 1213m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，1029m/z，或 3829m/z，1763m/z，检测健康骨髓单个核细胞的差异蛋白由以下蛋白质质荷比峰组成 3829m/z，1593m/z，5322m/z，1868m/z，1016m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，5322m/z，2742m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1000m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，，1059m/z,1213m/z，1108m/z，或 3829m/z，1593m/z，9552m/z，1695m/z，1059m/z, 1137m/z，或 3829m/z，1763m/z0
全文摘要
本发明提供了一种白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法，包括如下步骤测定四种不同白血病早幼粒细胞白血病、急性髓系粒细胞白血病、急性髓系单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及对照组健康骨髓中的单个核细胞的蛋白质谱图，并将其集合成蛋白质谱图库；处理所述蛋白质谱图库形成蛋白质谱图数据库，以蛋白质谱图数据库的特征分子建立白血病细胞蛋白质谱分析模型；筛选出用来显著区分各组的特征分子。本发明建立不同类型白血病的蛋白质谱数据库，构建了白血病细胞蛋白质谱分析模型，该分析模型有潜力应用于白血病细胞性质的判别；得出的重要特征分子可作为白血病靶向药物的靶点研究以及白血病生物标志物临床应用。
文档编号G01N27/62GK102967650SQ20121049665
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者许蕴, 史敦云, 王大平, 陈旭红, 杜新, 张晓丽, 卓家才 申请人:深圳市第二人民医院