专利名称：一种检测h5n1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测H5N1亚型禽流感病毒的电化学免 疫传感器及其制备方法。
背景技术：
禽流感(Avian inf luenza, Al)不仅严重的影响养禽业的发展,而且危害人类的健 康。据世界卫生组织(WHO)报道，自2003年11月2012年11月，H5N1感染人类的病例为 606例，死亡357例，死亡率高达58. 9%。因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测H5N1的方 法对于防控H5N1型病毒的传播具有重要的意义。
目前，用于检测AIV的方法有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)、血凝(HA) 和血凝抑制(HI)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核酸序列扩增(NASBA)、荧光定量 RT-PCR、以及环介导等温扩增(LAMP)。ELISA、荧光定量RT_PCR、NASBA和LAMP等方法能够 检测出各种样品中的AIV，但这些方法或特异性差、或敏感性低、或操作复杂、或需要昂贵的 仪器设备及专业的技术人员。
电化学免疫传感器将电化学分析方法和免疫分析相结合，既具备了电化学分析特 有的检测快速、操作简单、灵敏度高、可微型化等优点，也具有免疫反应中特有的抗原-抗 体特异性结合的特点。目前电化学免疫传感器已经成功应用于环境分析、食品工业和临床 医学。石墨烯由于具有大的比表面积、好的导电能力，在电化学传感器的研究中已经得到很 广泛的应用。但是氧化石墨烯由于其表面带有丰富的羧基、羟基和环氧基等含氧基团，使其 具有很好的相容性，却破坏了原来石墨的SP2杂化体系，导致氧化石墨烯的导电性与石墨 相比差很多，因此很大程度上限制它在电化学传感器研究领域中的应用。发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物。
本发明提供的一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物，为将H5N1亚型禽流 感病毒抗体A和牛血清白蛋白(BSA)均与氧化石墨烯通过酰胺键连接，得到抗体A-氧化石 墨烯-BSA复合物。
上述复合物中，所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A为H5N1亚型禽流感病毒的多克 隆抗体，在实施例中具体为鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供一种制备用于检测H5N1亚型禽流感病毒复合物的方 法。
本发明提供的方法，包括如下步骤
I)将氧化石墨烯、EDC、NHS和水混合，活化，得到活化后氧化石墨烯；
2)将所述活化后氧化石墨烯、H5N1亚型禽流感病毒抗体A、BSA和水混匀，反应，即 得到用于检测禽流感病毒的复合物。
上述方法中，
步骤I)中，所述氧化石墨烯、所述EDC和所述NHS的质量比为O. 4:5 6 ；
步骤2)中，所述活化后氧化石墨烯、所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A和所述BSA 的质量比为400 1 20o
上述方法中，
步骤I)中，所述活化的时间为8 - 12min，所述活化的温度为25 — 28°C ；
步骤2)中，所述反应的温度为25_28°C，所述反应时间为12_14h。
上述方法中，
所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A为H5N1亚型禽流感病毒的多克隆抗体，在实施 例中具体为鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物和电 化学免疫传感器；
所述电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极；
所述工作电极按照如下方法制备
I)将金电极用硫脲修饰，得到硫脲修饰金电极(简写为硫脲-金电极);
2)将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子,得到金纳米粒 子修饰硫脲-金电极(简写为金纳米粒子-硫脲-金电极);
3)将所述金纳米粒子修饰的硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合，得 到抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极(简写为抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极)；
4)将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点， 得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极，即为工作电极。
上述试剂盒中，
所述电化学免疫传感器的工作电极的制备方法中，
所述将金电极用硫脲修饰的方法为将金电极浸入5mmol/L硫脲水溶液中反应，得 到硫脲修饰金电极(简写为硫脲-金电极);
所述将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的方法为将 所述硫脲修饰金电极放置于质量百分含量为1%HAuC14水溶液中用电化学方法沉积金纳米 粒子，得到金纳米粒子修饰硫脲-金电极；
所述将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合的 方法为将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极浸泡在H5N1亚型禽流感病毒抗体B中，得到抗 体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极；
所述将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点 的方法为将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极浸入质量百分含量为O. 25%的BSA 水溶液中，反应，得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(纳米复合物修饰的金 电极)，即为工作电极。
上述试剂盒中，
所述将金电极用硫脲修饰的方法中，所述反应的温度为25_28°C，所述反应的时间 为24小时；
所述将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的方法中，所述电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的条件为-O. 2V恒电位沉积60秒；
所述将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合的方法中，所述浸泡的时间为12-14h，所述浸泡的温度为4°C ；
所述将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点的方法中，所述反应的温度为37°C，所述反应的时间为Ih ；
所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼电极；
所述H5N1亚型禽流感病毒抗体B为H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，在实施例中具体为H5N1亚型禽流感病毒HA抗原表位蛋白的单克隆抗体。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器。
本发明提供的用于检测H5N1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器，为上述试剂盒中的电化学免疫传感器。
本发明的实验证明，本发明提供了一种具有放大功能的抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物，并利用了该纳米复合物的信号放大性质，构建了超灵敏的电化学免疫传感器检测H5N1亚型禽流感病毒；当样品中H5N1亚型禽流感病毒含量很少时(小于 2_7HAunit/50 μ L)，用抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物进行信号放大，有效的达到分析检测的目的。本方法操作简单，灵敏度高，且特异性强。
本发明的优点具体如下
I)将硫脲自组装到金电极表面，通过电化学还原HAuCl4将金纳米粒子沉积到金电极的表面，得到一层均匀 、稳定的金纳米粒子层，用于固定H5N1亚型禽流感病毒抗体B，利用抗体B和不同浓度的H5N1亚型禽流感病毒反应，改变电极界面的电子传导能力引起响应电流值的变化，从而达到对H5N1亚型禽流感病毒进行定量分析检测的目的；
2)本发明首次提出采用氧化石墨烯(GO)负载H5N1亚型禽流感病毒抗体A及牛血清蛋白(BSA)作为该传感器的信号放大材料，提高传感器的灵敏度。可以用于检测病发初期、H5N1亚型禽流感病毒含量较低的样品，而本发明利用氧化石墨烯大的比表面积、差的导电性及好的水溶性等特点，首次提出采用氧化石墨烯负载H5N1亚型禽流感病毒抗体A和牛血清白蛋白作为该传感器的信号放大材料，具有一定的突破性。
图1为不同材料修饰电极的交流阻抗图
图2为不用抗体A-氧化石墨烯-BSA作为信号放大时检测结果图
图3为抗体A-氧化石墨烯-BSA作为信号放大时检测结果图
图4为电化学免疫传感器特异性检测结果具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的仪器有CHI电化学工作站(北京华科普天科技责任有限公司)，使用常规的三电极电化学池进行电化学测量，免疫电极作为工作电极，饱和甘汞电极 (SCE)作为参比电极，钼电极作为对电极、KQ-250DB型数控超声清洗器(昆山市超生仪器有限公司)、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)、旋涡混合器(北京金北德工贸有限公司)、离心机(BECKMAN COULTER)。
H5N1亚型禽流感病毒(Chicken/Guangxi/1/04 H5N1)、H1N3亚型禽流感病毒 (Duck/HK/717/79-dl H1N3)、H3N6 亚型禽流感病毒(Duck/HK/526/79/2B H3N6)、H9N2 亚型禽流感病毒(Duck/Guangxi/1/00 H9N2)均记载在A multiplex RT-PCR fordetection of type A infI uenza virus and differentiation of avian H5, H7, andH9 hemagglutinin subtypes ；Zhixun Xiea' *, Yao-shan Panga, Jiabo Liua, XianwenDenga, Xiaofei Tanga, Jianhua Suna, Mazhar1. Khanb'^* ；Molecular and CellularProbes 20 (2006) 245 -249中；公众可均从广西壮族自治区兽医研究所获得。
灭活H5N1亚型禽流感病毒(37 °C下用O. 1%甲醛振荡灭活H5N1亚型禽流感病毒毒株4小时得到灭活H5N1亚型禽流感病毒)、H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体为H5N1 亚型禽流感病毒HA抗原表位蛋白的单克隆抗体(由杂交瘤细胞W2-2制备得到的H5N1亚型禽流感病毒HA抗原表位蛋白的单克隆抗体溶液；杂交瘤细胞W2-2及禽流感病毒H5N1 亚型单克隆抗体的制备方法记载在重组蛋白McAbs的制备及应用，中国动物检疫2012 年第29卷第10期，庞耀珊，谢芝勋，邓显文，谢志勤，谢丽基，刘加波，范晴；公众可均从广西壮族自治区兽医研究所获得)、鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体(灭活H5N1亚型禽流感病毒Chicken/Guangxi/1/04 H5N1免疫BALB/c小鼠得到的抗血清)、1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(N- (3-dimethyIaminopropyI) -N-ethylcarbodi imde hydrochloride, EDC)、N-轻基玻拍酸亚胺(N-hydroxysucc inimide, NHS)、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)和氯金酸购自 Sigma 公司；K4Fe (CN) 6、K3Fe (CN) 6、硫脲、无水乙醇、柠檬酸三钠和硫酸等均为国产分析 纯，实验用水为二次去离子水。
鸡白痢沙门氏菌SE购自国家兽医生物菌种管理中心，目录号cvcc534，全称鸡白痢沙门氏菌。
NDV毒株GX1/00记载在文献陈安莉，谢芝励，周辰瑜，等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学，2011，41 (09) :917-922 ;公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
IBV毒株Massachussetts 41记载在文献谢志勤，谢芝励，吕华刚.等.30 株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分尚株SI基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报，2008，21 (6) : 1733-1736 ;公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、抗体A-氧化石墨烯-BSA的制备
I)氧化石墨烯(GO)的制备
根据Hrnnmer方法改进后制备氧化石墨烯,具体步骤如下冰水浴条件下,在200mL 的烧杯中加入Ig石墨粉、2. 5g硝酸钾、IOOmL H2SO4，搅拌均匀后缓慢加入5gKMn04，随后将烧杯置于35°C水浴反应2h，逐步加入IOOmL去离子水，温度升至95°C继续反应lh，混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温(25°C)后加入300mL水稀释，并加入质量分数为30%的 H2O2中和未反应的高锰酸钾，先用0. 5mol/L的盐酸水溶液洗涤，再用水反复离心洗涤，真空干燥，得到氧化石墨。
称取IOmg上述制备的氧化石墨置于烧杯中，加入IOOmL去离子水，超声lh，得到氧化石墨烯(GO)。
2 )抗体A-氧化石墨烯-BSA制备
移取4mL 氧化石墨稀(O. lmg/mL),加入 ImL EDC(5mg/mL)、2mL NHS(3mg/mL)进行活化(25°C反应10分钟)，得到活化后氧化石墨烯(氧化石墨烯、EDC和NHS的质量比为 O. 4:5 :6);然后向活化后氧化石墨烯中加入lmL(lug/mL)鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体、2mL O. 25%的BSA溶液(BSA溶解在浓度为O. Olmol/L、pH值为8. O的PBS缓冲溶液) 室温(25°C )下反应过夜(12h ;其中活化后氧化石墨烯、鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体和BSA的质量比为400 1 :20)，浓度为O. 01mol/L、pH值为7. O的PBS缓冲溶液离心洗涤 3次，最后加入4mL PBS缓冲液溶解并于4°C下保存备用，得到抗体A-氧化石墨烯-BSA复合物(溶液)。
抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物为将鼠抗H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体和牛血清白蛋白均与氧化石墨烯通过酰胺键连接，该复合物用于H5N1亚型禽流感病毒检测的复合物。
实施例2、H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器及试剂盒的制备
—、H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器的制备
1、免疫电极(工作电极)的制备
将金电极(0 = 3 mm)以O. 05μπι的Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后用蒸馏水洗干净，再分别在二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水中超声清洗5min，用N2吹干。然后在 O. 5mol · Γ1 H2SO4溶液(扫描前通入N2除氧15min)中用循环伏安进行扫描，扫描速度为 50mV/s,电压范围为-O. 3 +1. 5V，持续扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净， N2吹干待用，得到待修饰金电极；
再将上述待修饰金电极浸入5mmol/L硫脲水溶液中室温(25°C )反应24小时，取出用二次去离子水洗净，得到硫脲-金电极；将硫脲-金电极置于5mL 1%HAuC14水溶液中于-O. 2V恒电位沉积60秒，得到金纳米粒子修饰硫脲-金电极，然后将金纳米粒子修饰硫脲-金电极置于H5N1亚型禽流感病毒HA抗原表位蛋白的单克隆抗体中于4°C下浸泡过夜， 得到抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极，最后将抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极浸入 O. 25%的BSA水溶液中37°C下反应Ih以封闭电极上其余的非特异性活性位点，得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(纳米复合物修饰的金电极)，即为免疫电极，也就是工作电极。
上述BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极悬于PBS缓冲液(浓度为 O. 01mol/L, pH=7. 2)上方于4°C下保存备用。
2、H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器
H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极为上述I制备BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(免疫电极)，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，钼电极作为对电极。
3、H5N1亚型禽流感病毒试剂盒的制备
将实施例1得到的抗体A-氧化石墨烯-BSA复合物和本实施例制备的H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器可以作为检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒组分。
实施例3、H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器和试剂盒的应用
—、H5N1亚型禽流感病毒电化学免疫传感器电极表征
UH5N1亚型禽流感病毒待测液的制备
将灭活H5N1亚型禽流感病毒用O. 01mol/L浓度、pH值为7. 2的PBS缓冲液进行稀释至浓度为2_4HA unit/50 μ L，得到Η5Ν1亚型禽流感病毒待测液。
2、方法和结果
电极表面修饰过程采用交流阻抗法(EIS)进行表征，同时采用差分脉冲伏安法 (DVP)法实现了 CEA的定量检测。采用常规的三电极体系统对免疫传感器的电化学性能进行研究。所制备的BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(金电极直径3mm)为工作电极，钼电极作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。所制备电极(工作电极) 在含 5mM K4Fe (CN) 6、5mM K3Fe(CN)6 和 O.1M KCl 的 O. 01mol/L PBS (pH=7. O)缓冲溶液中进行电化学性能测试，除特别说明外电势扫描范围均为-O. 2 O. 6V，扫速为50mV · s_l，电化学测试前在测试液中通入高纯氮气15min，以除去溶解在测试液中的氧。所有电化学测试均在25 °C恒温条件下进行。
本实验所制备的免疫传感器电流响应信号的检测是用夹心免疫反应模式完成的； 具体如下
(I)将实施例2得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极浸泡到200 μ L 的Η5Ν1亚型禽流感病毒待测液中免疫反应35min，取出用PBS缓冲溶液(浓度为O. Olmol/ L，pH=7. 2)洗净，得到H5N1亚型禽流感病毒固定于BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(简写为H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极)；
(2)再将经过(I)处理得到的H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极与由实施例1的得到的抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物(溶液)反应40min，再用PBS缓冲溶液(浓度为O. 01mol/L, pH=7)冲洗去非特异性结合的粒子；得到抗体A-氧化石墨烯-BSA 纳米复合物固定于H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极；
(3)再将经过(2)处理得到的抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物固定于 H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极、饱和甘汞电极(SCE)、钼电极均放入IOmM PBS (含 5mM K4Fe (CN) 6+5mM K3Fe (CN) 6+0.1M KCl, pH 7.0)混合溶液中，进行电化学检测。
上述反应中，固定在电极表面上的H5N1亚型单克隆抗体与H5N1亚型禽流感病毒待测液中发生免疫反应后，其响应电流降低，再与抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物结合，抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物进一步减弱了响应电流值，随着H5N1亚型禽流感病毒浓度的增加，测得的响应电流值也随之呈线性的减少。
I0为免疫传感器发生免疫反应前的响应电流值，H5N1亚型禽流感病毒发生免疫反应后的响应电流值I1，将免疫传感器完成夹心免疫反应后的响应电流记为I2，则免疫电极的响应电流(ΛΙρ Λ I2)为
AI1 = I1-10(I)
Δ I2=I2-10⑵
电化学交流阻抗(EIS)可以有效的用于表征修饰电极的表面，半圆出现在高频区，半圆的直径反应电极表面的电子转移电阻(electron-transfer resistance, Ret),半圆的直径越大，其对应电极表面的Ret值越大，反之亦然。直线低将出现在频区，反应电极表面扩散过程。
用电化学交流阻抗(EIS)表征金电极修饰过程(扫描频率0. Γ100, OOOHz,电位O.24，对电极为饱和甘汞电极)，结果如图1所示图1为固定不同修饰材料的金电极在 IOmM PBS (含 5mM K4Fe (CN) 6+5mM K3Fe (CN) 6+0.1M KCl, pH 7.0)混合溶液中的交流阻抗图； 其中图1a为待修饰金电极的交流阻抗图，没有出现半圆，说明了其电极表面的电阻很小， 出现一条直线，说明电极表面受扩散控制；图1b为硫脲-金电极的交流阻抗图，其交流阻抗图出现了一个明显的半圆(Ret=)和一条斜线(图1b)，这是因为硫脲的不可导电性增大了电极表面的电阻；图1c为金纳米粒子修饰硫脲-金电极的交流阻抗图，其交流阻抗图又出现一条直线，这是因为金纳米粒子具有很好的导电性，提高了电子传递的能力；图1d为抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极的交流阻抗图，图1e为BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极的交流阻抗图；图f为H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极的交流阻抗图，图1g为抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物固定于H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极的交流阻抗图，从上述Id-1g均可看出，其阻抗半径依次递增，其电阻依次增加，主要是由于H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体B、H5N1亚型禽流感病毒和抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物阻碍了电极表面的电子转移，说明H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体B、H5N1亚型禽流感病毒和抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物均已成功的修饰于电极的表面。
三、检测H5N1亚型禽流感病毒灵敏度检测
UH5N1亚型禽流感病毒待测液的制备
将灭活H5N1亚型禽流感病毒用浓度为O. 01mol/L, pH=7. 2的PBS缓冲液进行稀释，得到2°HA unit/50 μ L^2_16HA unit/50 μ L浓度的H5N1亚型禽流感病毒待测液。
2、检测
方法一
(I)将实施例2得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲_金电极作电极)浸泡到200 μ L的不同浓度的Η5Ν1亚型禽流感病毒待测液中免疫反应30min，取出用PBS缓冲溶液(浓度为O. 01mol/L, pH=7)洗净，得到H5N1禽流感病毒固定于BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极；
(2)再将经过(I)处理得到的H5N1亚型禽流感病毒固定于BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极、饱和甘汞电极(SCE)、钼电极均放入IOmM PBS(含5mMK4Fe(CN)6+5mM K3Fe (CN) 6+0.1M KCl, pH 7. O)混合溶液(含 5mM K4Fe (CN) 6+5mMK3Fe (CN) 6+0.1M KCl，pH 7. 0)混合溶液中，用差分脉冲伏安法进行电化学检测。扫描电位-O. 2-0. 6V,扫速0. 05V/ S。
结果如图2所示，(a)免疫传感器在不同浓度H5N1亚型禽流感病毒中的DVP曲线和(b)峰电流变化值与H5N1亚型禽流感病毒浓度之间的关系，在最优条件下，对不同浓度 H5N1亚型禽流感病毒液进行定量检测，随着H5N1亚型禽流感病毒液浓度的增加，吸附到电极表面的病毒数量随之增加，导致[Fe (CN) 6] 3_/4_氧化还原反应在电极表面的电子传递阻力增大，引起DVP峰电流值均随之降低。当不用抗体A-氧化石墨烯-BSA作为信号放大时，传感器对H5N1亚型禽流感病毒的线性范围为2_7 2°ΗΑ unit/50 μ L，检测灵敏度(检测下限值) 为 2_7HA unit/50 μ L ;无法检测出 2-1H unit/50 μ L。
方法二
(I)将实施例2得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极(工作电极) 浸泡到200 μ L的不同浓度的(2_15 2_8ΗΑ unit/50 μ L) H5N1亚型禽流感病毒待测液中免疫反应30min，取出用PBS缓冲溶液(浓度为O. 01mol/L, pH=7)洗净，得到H5N1禽流感病毒固定于BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极；
(2)再将经过(I)处理得到的H5N1亚型禽流感病毒固定于BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极与由实施例1的得到抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物溶液反应40min，再用PBS缓冲溶液(浓度为O. 01mol/L, pH=7)冲洗去非特异性结合的粒子；得到抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物固定于H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极；
(3)再将经过(2)处理得到的抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物固定于H5N1-BSA-抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极；饱和甘汞电极(SCE)、钼电极均放入 IOmM PBS (含 5mM K4Fe (CN) 6+5mM K3Fe (CN) 6+0.1M KCl, pH 7. 0)混合溶液(含 5mM K4Fe (CN)6+5mMK3Fe (CN)6+0.1M KCl, pH 7.0)混合溶液中，用差分脉冲伏安法进行电化学检测。扫描电位-0.2-0. 6V，扫速0. 05V/S。
结果如图3所示，其中，(a)免疫传感器在不同H5N1亚型禽流感病毒浓度中的循环伏安曲线和(b)峰电流变化值与H5N1亚型禽流感病毒浓度之间的关系；在抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物放大作用下，所制得的免疫电极对H5N1检测的线性范围为2_15 2_8HA unit/50 μ L，检测下限可达为 2_15ΗΑ unit/50 μ L。
四、特异性检测
1、抗原待测液的制备
按照实验三的I的方法，分别制备Η1Ν3亚型禽流感病毒、Η3Ν6亚型禽流感病毒、 Η9Ν2亚型禽流感病毒、NDV 毒株GX1/00、鸡白痢沙门氏菌SE和IBV毒株Massachussetts41 的病毒阳性待测液，以H5N1亚型禽流感病毒阳性样品作为对照。
2、检测
按照实验三的2的方法二检测，以PBS缓冲液(浓度为O. 01mol/L, pH=7. 2)为空白对照。
结果如图4所示，可以看出，与空白对照相比，H1N3亚型禽流感病毒、H3N6亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、NDV毒株GX1/00、鸡白痢沙门氏菌SE和IBV毒株 Massachussetts 41的病毒阳性待测液中的响应电流值没有均发生明显的变化，而H5N1亚型禽流感病毒阳性样品中的响应电流值有明显变化，说明该传感器具有较好的选择性。
权利要求
1.一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物，为将H5N1亚型禽流感病毒抗体A和牛血清白蛋白均与氧化石墨烯通过酰胺键连接，得到抗体A-氧化石墨烯-BSA复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A为H5N1亚型禽流感病毒的多克隆抗体。
3.一种制备用于检测H5N1亚型禽流感病毒复合物的方法，其特征在于1)将氧化石墨烯、EDC、NHS和水混合，活化，得到活化后氧化石墨烯；2)将所述活化后氧化石墨烯、H5N1亚型禽流感病毒抗体A、牛血清白蛋白和水混匀，反应，即得到用于检测禽流感病毒的复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤I)中，所述氧化石墨烯、所述EDC和所述NHS的质量比为0.4:5 6 ；步骤2)中，所述活化后氧化石墨烯、所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A和所述牛血清白蛋白的质量比为400 1 20o
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于步骤I)中，所述活化的时间为8 - 12min，所述活化的温度为25 — 28°C ；步骤2)中，所述反应的温度为25-28°C，所述反应时间为12-14h。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述H5N1亚型禽流感病毒抗体A为H5N1亚型禽流感病毒的多克隆抗体。
7.一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述的用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物和电化学免疫传感器；所述电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极；所述工作电极按照如下方法制备1)将金电极用硫脲修饰，得到硫脲修饰金电极；2)将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰硫脲-金电极；3)将所述金纳米粒子修饰的硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合，得到抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极；4)将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点，得到BSA封闭的抗体B-金纳米粒子-硫脲-金电极，即为工作电极。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述电化学免疫传感器的工作电极的制备方法中，所述将金电极用硫脲修饰的方法为将金电极浸入5mmol/L硫脲水溶液中反应，得到到硫脲修饰金电极；所述将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的方法为将所述到硫脲修饰金电极放置于质量百分含量为1%HAuC14水溶液中用电化学方法沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰硫脲-金电极；所述将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合的方法为将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极浸泡在H5N1亚型禽流感病毒抗体B中，得到抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极；所述将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点的方法为将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极浸入质量百分含量为O. 25%的BSA水溶液中，反应，得到BSA封闭的抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极，即为工作电极。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述将金电极用硫脲修饰的方法中，所述反应的温度为25-28°C，所述反应的时间为24小时；所述将所述硫脲修饰金电极通过电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的方法中，所述电化学还原HAuCl4沉积金纳米粒子的条件为-O. 2V恒电位沉积60秒；所述将所述金纳米粒子修饰硫脲-金电极与H5N1亚型禽流感病毒抗体B结合的方法中，所述浸泡的时间为12-14h，所述浸泡的温度为4°C ；所述将所述抗体B修饰金纳米粒子-硫脲-金电极用BSA封闭非特异性活性位点的方法中，所述反应的温度为37°C，所述反应的时间为Ih ；所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼电极；所述H5N1亚型禽流感病毒抗体B为H5N1亚型禽流感病毒的单克隆抗体。
10.一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器,为权利要求7-9中任一所述试剂盒中的电化学免疫传感器。
全文摘要
本发明公开了一种检测H5N1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及试剂盒。本发明提供的一种用于检测H5N1亚型禽流感病毒的复合物，为将H5N1亚型禽流感病毒抗体A和牛血清白蛋白均与氧化石墨烯通过酰胺键连接，得到抗体A-氧化石墨烯-BSA复合物。本发明的实验证明，本发明提供了一种具有放大功能的抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物，并利用了该纳米复合物的信号放大性质，构建了超灵敏的电化学免疫传感器检测试剂盒；当样品中H5N1亚型禽流感病毒含量很少时，用抗体A-氧化石墨烯-BSA纳米复合物进行信号放大，有效的达到分析检测的目的。本方法操作简单，灵敏度高，且特异性强。根据电化学免疫传感器的特点，当实验中选择其它抗体，本方法可以实现对其它病原微生物的检测。
文档编号G01N33/577GK102998447SQ20121051107
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者谢芝勋, 黄娇玲, 罗思思, 谢志勤, 谢丽基, 刘加波, 庞耀珊, 范晴 申请人:广西壮族自治区兽医研究所