专利名称：一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法
技术领域：
本发明涉及一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，具体涉及一种检验野生仙人掌多糖对欧文氏软腐菌抑菌效果的方法，属于植物活性成分功能鉴定的技术领域。
背景技术：
仙人掌(Opuntia dillenii Haw.)为仙人掌科仙人掌属肉质多年生植物,又名观音刺、神仙掌、火焰等。我国的野生仙人掌主要分布在广西、广东、江西、福建等省，资源丰富。大量药理学研究表明，仙人掌具有抗炎、抗病毒、抗癌等作用，并对大肠杆菌、枯草杆菌、欧文氏软腐菌等有高度抑制效果。其药用的主要有效成分为类黄酮化合物、生物碱、甾类化合物、三萜类化合物及有机酸等。同时，仙人掌多糖具有降血糖血脂、降血清胆固醇、抗氧化、调节免疫、抗癌和护肝等功效。目前，全世界正面临化学抗生素危机，因此，越来越多的人把眼光放到了天然植物活性物质的研究上，从而使仙人掌这种传统抗菌药材得到了人们越来越多的重视。仙人掌的提取物，具有多种活性物质，可冶疗多种疾病，而且具有不易产生抗药性和提取成本低等优点，因此，作为一种天然抗菌药物和食品保鲜剂有着广阔的前景。近几年来，国内外对仙人掌的抑菌作用虽然有所研究，但抑菌作用的大小大多采用抑菌圈法进行测定，测定方法较复杂，费时费力，特别是对于欧文氏软腐菌的抑菌能力的方法还未见报导。欧文氏菌属(Erwinia)是肠杆菌科的一个成员，菌体短杆状，分为两个组群，一是以梨火疫病菌为代表的解淀粉菌群，二是以胡萝卜软腐菌为代表的软腐菌群。有15个种，5个亚种，7个变种。该属大多数种是植物病原菌，引起植物坏死、溃疡、萎蔫、及软腐症状。软腐菌群寄主范围很广，包括十字花科、禾本科、茄科等20多个科的数百种果蔬和大田作物，大多由伤口侵染或介体传带侵染，引起肉汁或多汁的组织软腐，尤其在厌氧条件下最易受害，大白菜软腐病常在贮藏期间表现症状。常见种(1)胡萝卜欧文菌(E. carotovara)俗称大白菜软腐病菌，寄生范围很广，包括十字花科、禾本科、茄科等20多科的数百种果蔬和大田作物，尤其是在厌氧条件下最易受害，多在仓库中贮藏期间表现症状。(2)菊欧文菌(E. chrysanthemi):引起多种亚热带植物和观赏植物软腐病。(3)玉米细菌性枯萎病(P.stewartii)和梨火疫病(E. amylovara):是我国的对外检疫对象。由于仙人掌含有类黄酮化合物、生物碱、留类化合物、三萜类化合物及有机酸等，对欧文氏菌属致病菌具有较好的抑菌效果。但目前将一定浓度的仙人掌多糖与致病菌混合接种马铃薯片后，通过马铃薯片的腐烂程度来测定抑菌能力的研究还没有报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，为发展天然抗菌药物与植物保鲜剂提供依据。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
(I)挑取致病菌单菌落接种于50 mL NB液体培养基中，25°C条件下振荡培养24 h，再将菌液制备成菌悬液备用；
(2)将马铃薯用自来水冲洗干净，在无菌操作台中，用75%酒精浸泡马铃薯30S，再用无菌水将酒精冲洗干净，用灭菌过的刀片将马铃薯切成Icm左右的均匀锥形薄片；
(3)用一定量的菌悬液和含有一定浓度的野生仙人掌多糖溶液混合，分别取10μ L接种在上述马铃薯薄片上，将接种混合液的马铃薯片放置在垫有3层消毒滤纸的培养皿中；
(4)用未接种致病菌、只单独接种致病菌的马铃薯薄片作为对照，将培养皿密封后置于25°C培养箱中培养2 d，根据马铃薯片的腐烂程度判断野生仙人掌多糖抑菌效果；
所述的致病菌是桃色欧文氏软腐菌；
所述的菌悬液的浓度为I X IO7 cfu-mr1 ；
所述的菌悬液与野生仙人掌多糖溶液的混合体积比为1:1;
所述的野生仙人掌多糖溶液的浓度为lmg/mL ；
本发明的有益效果是该方法操作简便，容易实施，实用性强。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1
(1)挑取桃色欧文氏软腐菌单菌落接种于50mL NB液体培养基中，25°C条件下振荡培养24 h，再将桃色欧文氏软腐菌液制备成浓度为I X IO7 cfu-mr1的菌悬液备用；
(2)将马铃薯用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，用75%酒精浸泡马铃薯30S，再用无菌水将酒精冲洗干净，用灭菌过的刀片将马铃薯切成Icm左右的均匀锥形薄片；
(3)用等量的桃色欧文氏软腐菌菌液和含有lmg/mL野生仙人掌多糖溶液混合，分别取10 μ L混合液接种在上述马铃薯薄片上，将马铃薯薄片放置在垫有3层消毒滤纸的培养皿中；
(4)用未接种软腐菌、只单独接种软腐菌的马铃薯薄片作为对照，将培养皿密封后置于25°C培养箱中培养I d，未接种软腐菌的马铃薯片没有变化，与新切的马铃薯片类似；只单独接种软腐菌的马铃薯薄片表面有轻微腐烂现象出现；而接种仙人掌多糖与桃色欧文氏软腐菌混合液的马铃薯薄片未见明显的变化，与未接种软腐菌的马铃薯片相似。说明野生仙人掌多糖具有一定的抑菌能力。实施例2
(1)挑取一个桃色欧文氏软腐菌单菌落接种于50mL NB液体培养基中，25°C条件下160转/分钟转速振荡培养24 h，再将桃色欧文氏软腐菌液制备成浓度为I X IO7 cfirmL—1的菌悬液备用；
(2)将马铃薯用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，用75%酒精浸泡马铃薯30S，再用无菌水将冲洗马铃薯5飞遍，用灭菌过的刀片将马铃薯切成Icm左右的均匀锥形薄片；
(3)用等量的桃色欧文氏软腐菌菌液和含有lmg/mL野生仙人掌多糖溶液混合，分别取10 μ L混合液接种在上述马铃薯薄片上，将马铃薯薄片放置在垫有3层消毒滤纸的培养皿中；
(4)用未接种软腐菌、只单独接种软腐菌的马铃薯薄片作为对照，将培养皿密封后置于25°C培养箱中培养2 d，观察马铃薯片的腐烂情况，未接种软腐菌的马铃薯片没有腐烂现象发生；只单独接种软腐菌的马铃薯薄片表面大部分发生腐烂；而接种仙人掌多糖与桃色欧文氏软腐菌混合液的马铃薯薄片未见明显的腐烂现象出现。说明野生仙人掌多糖具有一定的抑菌能力。实施例3
(1)挑取桃色欧文氏软腐菌单菌落接种于50mL NB液体培养基中，25°C条件下振荡培养24 h，再将桃色欧文氏软腐菌液制备成浓度为I X IO7 cfu-mr1的菌悬液备用；
(2)将马铃薯用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，用75%酒精浸泡马铃薯30S，再用无菌水将酒精冲洗干净，用灭菌过的刀片将马铃薯切成Icm左右的均匀锥形薄片；
(3)用等量的桃色欧文氏软腐菌菌液和含有lmg/mL野生仙人掌多糖溶液混合，分别取 10 μ L混合液接种在上述马铃薯薄片上，将马铃薯薄片放置在垫有3层消毒滤纸的培养皿中；
(4)用未接种软腐菌、只单独接种软腐菌的马铃薯薄片作为对照，将培养皿密封后置于25°C培养箱中培养3 d，未接种软腐菌的马铃薯片没有腐烂现象发生、只单独接种桃色欧文氏软腐菌的马铃薯薄片表面严重腐烂，而接种仙人掌多糖与桃色欧文氏软腐菌混合液的马铃薯薄片只有轻微的腐烂现象发生。说明野生仙人掌多糖具有一定的抑菌能力。
权利要求
1.一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)挑取致病菌单菌落接种于50mL NB液体培养基中，25°C条件下振荡培养24 h，再将菌液制备成菌悬液备用； (2)将马铃薯用自来水冲洗干净，在无菌操作台中，用75%酒精浸泡马铃薯30S，再用无菌水将酒精冲洗干净，用灭菌过的刀片将马铃薯切成Icm左右的均匀锥形薄片； (3)用一定量的菌悬液和含有一定浓度的野生仙人掌多糖溶液混合，分别取10μ L接种在上述马铃薯薄片上，将接种混合液的马铃薯片放置在垫有3层消毒滤纸的培养皿中； (4)用未接种致病菌、只单独接种致病菌的马铃薯薄片作为对照，将培养皿密封后置于25°C培养箱中培养2 d，根据马铃薯片的腐烂程度判断野生仙人掌多糖抑菌效果。
2.根据权利要求1所述的一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，其特征在于步骤(I)所述的致病菌是桃色欧文氏软腐菌。
3.根据权利要求1所述的一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，其特征在于步骤(I)所述的菌悬液的浓度为I X IO7 cfu.mL—1。
4.根据权利要求1所述的一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，其特征在于步骤(3)所述的菌悬液与野生仙人掌多糖溶液的混合体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，其特征在于步骤(3)所述的野生仙人掌多糖溶液的浓度为lmg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种检验野生仙人掌多糖抑菌效果的方法，该方法是挑取欧文氏软腐菌制备菌悬液，取等量的菌悬液与含有一定浓度野生仙人掌多糖的溶液制成混合液，用未接种致病菌、单独接种致病菌和接种混合液的马铃薯片做对照，通过观察马铃薯片的腐烂情况来判断野生仙人掌多糖的抑菌效果；该方法操作简便，容易实施，实用性强。
文档编号G01N33/00GK103018409SQ20121052880
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者李莉梅, 曾富华, 李恒, 欧阳乐军 申请人:湛江师范学院