乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用。所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的氨基酸组成如SEQ?ID?NO.9所示或与SEQ?ID?NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。其制备方法包括：重组质粒pET-28a-S的构建；重组质粒pET-28a-S-S1的构建；乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的表达和纯化。所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白具有较高的灵敏度和特异性，可应用于生物医药领域，特别是应用在乙肝病毒表面抗体胶体金检测试纸条中。
【专利说明】乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白及其制备方法，及其在免疫层析分析领域中的应用。
技术背景
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，它的感染是一个世界性的公共卫生问题，中国有约1.3亿慢性乙肝病毒携带者，其中乙肝表面抗原的携带率约10%，每年约有30万人最终死于乙肝有关的慢性疾病，是慢性传染病中的头号杀手。慢性HBV感染患者主要表现为肝损伤以及脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者还可能发展成为肝硬化和肝细胞癌。乙型肝炎的治疗可分为两大类:一类是抗病毒治疗。抗病毒治疗主要是α干扰素和核苷类药物，干扰素主要刺激细胞介导的免疫反应来抑制HBV，同时通过攻击靶细胞而消除病毒；核苷类药物可以通过抑制HBV的复制控制病毒的增殖。另一类是免疫治疗。主要是宿主针对受病毒感染的干细胞的免疫反应和引起炎症的细胞因子的介导的，免疫治疗可以打破免疫耐受状态，诱导机体有效的机体免疫，抑制并清除病毒。这两种治疗均有一定的疗效，但在治疗的整个过程中要定期检测体内的病毒标志物(HBsAg、HBeAg、抗-HBe和HBV-DNA)的水平，以及时调整治疗方案。因此，乙肝有关的慢性疾病的诊断和监控是当前我国亟待解决的重大课题之一。
[0003]乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)外壳的一种结构成分,在病毒吸附至易感细胞受体中起重要作用。HBsAg存在于患者血清小球型颗粒、管型颗粒和Dane颗粒中，HBV感染后绝大多数感染者外周血中会出现HBsAg，其定性检测是判断乙型肝炎病毒感染状态的常规指示，对乙型肝炎临床早期诊断抗病毒治疗方案的选择及预后判断均具有重要意义；另外，HBsAg也是乙肝疫苗重要的免疫原之一。
[0004]早期HBsAg主要是从乙型肝炎病毒感染者血液中获得，该种血液存在着不良因素，可能混有其他病原体或其他型的肝炎病毒。近年来随着乙肝治疗水平的提高和计划免疫的推行，高效价血源HBsAg的获取越来越困难。因此，借助分子生物学和基因工程技术的迅速发展，目前国际上应用的免疫学检测技术和疫苗主要是酵母或CHO细胞表达的S蛋白，但大约有5%-10%的人群存在免疫逃避。尽管近年来许多科研工作者投身乙肝表面抗原的研究，中国预防兽医学院病毒研究所也成功研制CHO细胞中表达的含S和PreSl基因的乙肝表面抗原，但是细胞株的表达量低，导致产量低，成本居高不下，远远不能满足市场的需求。
[0005] HBsAg主要由S、前SI和前S2三个亚基组成。其中S由226个氨基酸组成，是乙肝预防性疫苗的组成成分。但含有前SI抗原的第3代预防性疫苗Hepacare,其抗体阳转率可以达到95%左右，免疫原性明显优于单纯的S蛋白。研究显示，前SI抗原的21-28位氨基酸是一个T细胞识别位点，第12-32和32-53位氨基酸是B细胞决定簇，第21-47位氨基酸是HBV结合肝细胞的主要区域，针对它的抗体可以封闭该位点并阻止HBV的再感染。因此我们将表达前SI的肝细胞结合位点aa21-47编码基因串联到HBsAg编码基因的碳端，使其与S蛋白以嵌合蛋白的形式在大肠杆菌中大量表达，以期可以得到成本低、特异性好、灵敏度高的乙肝表面抗原，为免疫学检测技术和高效廉价疫苗的开发提供生物原材料，有效降低检测成本和疫苗生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于制备特异性强、灵敏度高的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提供的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的氨基酸组成如SEQ ID N0.9所示；或所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白氨基酸组成与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。
[0008]本发明的目的之二在于提供一种操作简单成本低的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法。
[0009]为达到以上目的，本发明提供以下技术方案:
[0010]一种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤:
[0011]a.重组质粒pET-28a-S的构建:将碱基组成如SEQ ID N0.2的序列经过限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET_28a中，获得重组质粒pET_28a_S ；
[0012]b.重组质粒pET-28a-S_Sl的构建:将碱基组成如SEQ ID N0.6的序列采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET_28a_S中，获得重组质粒 pET-28a-S-Sl ；`
[0013]c.乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的表达和纯化:将步骤b所得重组质粒pET-28a-S-Sl转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5Μ脲的Tris-HCl溶液溶解后离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，即得到乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
[0014]进一步，步骤a是:以SEQ ID N0.1为模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4为引物，进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-S。
[0015]进一步，步骤b是:以SEQ ID N0.5为模板，以SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8为引物，进行PCR扩增，扩增产物经采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET-28a-S中，获得重组质粒pET-28a-S-Sl。
[0016]进一步，步骤c为:将步骤b所得的重组质粒pET-28a-S_Sl转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用终浓度为lmmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于温度30-37°C，诱导表达4-6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl (pH 7.8)溶液溶解后，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，得到所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
[0017]本发明的目的之三在于该乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在生物医药领域的应用，特别是乙肝检测试剂产品中的应用，从而为疾病的临床检测技术的开发提供优质的生物原材料。
[0018]为达到上述目的本发明提供以下技术方案:[0019]乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在HBV快速检测免疫层析技术及HBV重组嵌合疫苗中的应用。
[0020]本发明的效果在于①该嵌合蛋白SSl包括乙肝表面抗原sAg的主要抗原表位和两个亲水区(P35-52、P99-156);②该嵌合蛋白SSl包括在病毒及亚病毒颗粒的装配中起主要成分，可以刺激机体产生中和性抗体或称为保护性抗体；并且包含免疫原性更强的前SI的肝细胞结合位点。③本发明的SSl重组嵌合蛋白为病毒样颗粒，其大小与天然病毒相近，在体内容易被树突细胞捕获，进而传递给T细胞，激活CTL反应，而且SSl在体内大部分被树突和巨噬细胞捕获，对体细胞的影响很小，不存在免疫耐受和免疫反毒问题。④本发明的SSl重组嵌合蛋白含有SI的肝细胞结合位点aa21-47，研究表明SI具有比S更强的免疫原性，可以增加蛋白的反应原性和免疫原性，解决当前乙肝表面抗原的免疫逃避问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明了、便于理解，下面将结合附图对本发明的相关内容作进一步详细阐述，其中:
[0022]图1为S编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA (DL2000)分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物；
[0023]图2为SI编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA (DL2000)分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物；
[0024]图3为SSl重组 嵌合蛋白编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中第一泳道是DNA (DL 2000)分子量标准，第二泳道为PCR扩增产物； [0025]图4为重组载体pET-28a-S_Sl的PCR鉴定及酶切鉴定图，其中第一泳道为重组载体酶切产物，第二泳道为空载体pET-28a，第3泳道为酶切的阴性空白对照，第4泳道为DNA(DL 5000)分子量标准；
[0026]图5为乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的SDS-PAGE电泳图,其中第一泳道是蛋白分子量标准图，第二泳道为阳性克隆菌株诱导后的样品；
[0027]图6为乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的Western Blot检测结果。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例是对本发明具体操作进行详尽描述，凡在实施例中未注明实验条件的均采用常规分子生物学实验条件，或按照相关产品的使用说明书操作。
[0029]实施例1重组嵌合蛋白HBsAg的设计
[0030]首先根据国内外已报道的乙肝表面抗原的序列及抗原表位信息，选择合成乙肝表面抗原S和PreSl的编码基因。
[0031]S
[0032]ATGGAGAACATCGCCAGTGGCCTGTTAGGTCCTTTACTGGTGCTGCAGGCC
[0033]GGCTTTTTCCTGCTGACCAAGATCCTGACCATCCCGCAGAGCCTGGACAGC
[0034]TGGTGGACCAGCCTGAACTTCTTAGGCGGCACCCCTGTTTGTCTGGGCCA
[0035]GAACAGCCAGAGCCAGATCAGCAGCCACAGTCCGACCTGTTGCCCTCCGA
[0036]TTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGCCTGCGCCGCTTCATCATCTTCCTGTG
【权利要求】
1.氨基酸组成如SEQID N0.9所示的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白或与SEQ IDN0:9所示的氨基酸序列具有90%同源性的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
2.—种乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的制备方法，其特征是，包括以下步骤: a.重组质粒pET-28a-S的构建:将碱基组成如SEQID N0.2的序列经过限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET_28a中，获得重组质粒pET_28a_S ； b.重组质粒pET-28a-S-Sl的构建:将碱基组成如SEQIDN0.6的序列采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET_28a_S中，获得重组质粒 pET-28a-S-Sl ； c.乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白的表达和纯化:将步骤b所得重组质粒pET-28a-S-Sl转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5Μ脲的Tris-HCl溶液溶解后离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，即得到乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤a是:以SEQID N0.1为模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4为引物，进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET-28a中，获得重组质粒pET_28a_S。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤b是:以SEQID N0.5为模板，以SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8为引物，进行PCR扩增，扩增产物经采用限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET_28a_S中，获得重组质粒pET-28a-S-Sl。
5.根据权利要求2-4`任一项所述的制备方法，其特征是，所述步骤c为:将步骤b所得的重组质粒pET-28a-S-Sl转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用终浓度为0.5-1.0mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷于温度30-37°C，诱导表达4-6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl (pH 7.8)溶液溶解后，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，得到所述乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白。
6.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗体检测中的应用。
7.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗体胶体金检测试纸条中的应用。
8.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重组嵌合蛋白在HBV重组嵌合疫苗中的应用。
【文档编号】G01N33/558GK103864903SQ201210537143
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2012年12月12日
【发明者】才蕾, 任艳娜, 唐时幸, 王继华 申请人:广州万孚生物技术股份有限公司