一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源检测的制作方法

一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源检测的制作方法
【专利摘要】本发明属于化工领域，提供了一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源的检测，包括：1)加十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)于烧杯，加HAuCl4及NaBH4，搅拌，2)往烧瓶中加生长液和阴离子表面活性剂，搅拌加HAuCl4和抗坏血酸，加1)制备的金种，水浴加热，冷却过滤析出的CTMAB，3)取2)制备的金纳米棒，加PBS溶液和探针DNA，放置冰箱中，4)取一定量3)制备的修饰后金纳米棒加靶标DNA，测定同步荧光，根据回归曲线计算过敏源含量。以阴离子表面活性剂为添加剂，减少CTMAB用量，制备的金纳米棒单分散好、生物毒性低。将金纳米棒用于过敏源的检测，方法检测限、灵敏度明显高于现有技术。
【专利说明】一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏

源检测【技术领域】
[0001]本发明属于化工领域，特别涉及一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源的检测。
【背景技术】
[0002]金纳米棒具有各向异性、可调的表面的离子体共振波长和极高的表面电场强度增强效应等具有不同于其他材料的优良性质(Jie Cao ；EwanK.Galbrainth ；Tong Sun,Sensors and Actuators B:Chemical, 2012,169:360-367),使其在生物医学及分析科学领域备受关注，并广泛用于纳米器件、生物标记、医学检测和表面增强拉曼等领域(SeunghyunLee ；Lindsey J.E.Anderson ；Courtney M.Payne ； Jason H.Hafner, Langmuir，2011，27，14748-14756)。最近，研究人员发现金纳米棒具有特殊的共振光散射(Ning Bi ；Ying Sun ；Hanqi Zhang, Colloids andSurfaces B:Biointerfaces, 2010,81:249-254.),基于金纳米棒的等离子共振光散射(PRLS)可以测定食品中过敏源含量。
[0003]目前，制备金纳米棒的方法有电化学方法、模板法以及金种介导生长法(BabakNikoobakht ；Mostafa A.El-Sayed, Chem.Mater, 2003,15,1957-1962)等。电化学法是在含有丙酮、环己烷、银离子及十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液中以金为阳极，钼为阴极使用电化学法制备金纳米棒 。但该法在合成过程中使用了有机溶剂，限制了其应用。模板法是利用多孔Al2O3膜或聚碳酸脂有机介孔膜为模板，通过控制电化学沉积时间制备金纳米棒。但该法操作过程比较复杂，并且只有单层的金纳米棒生成，产量低。最近，研究人员提出一种新的金种介导生长法制备金纳米棒。该方法需先用强还原剂(NaBH4)还原Au3+为Au°，合成2-3nm金纳米球种子液，然后用弱还原剂(抗坏血酸)将其他的Au3+还原到金纳米球种子上，阳离子表面活性剂(CTMAB)作为引导金种生长的“软模板”，使其定向生长为各向异性的金纳米棒。该方法具有操作简单、绿色等特点，但用该法制备的金纳米棒仍有很多其他针状、片状及颗粒状金纳米颗粒，无法得到单分散的金纳米棒，然而金纳米棒的等离子共振光散射特性与其形貌特征密切相关。因此制备单分散、低生物毒性的金纳米棒对于食品过敏源的检测势在必行。

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题就是针对现有的食品过敏原检测的方法测试测试方法复杂，费用昂贵，不利于普及推广，提供一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源的检测。方法显著地改善了过敏源检测的稳定性、灵敏度和精密度，操作方便、快速。
[0005]本发明人经过广泛的研究和反复的试验发现，以含苯环阴离子表面活性剂为添加剂，减少CTMAB用量，制备的金纳米棒具有良好的等离子共振光散射特性，且单分散好、生物毒性低。然后利用所制备的金纳米棒修饰探针DNA检测实现了食品过敏源的快速检测。本发明人进一步对金纳米棒的制备条件以及过敏源检测进行优化选择，终于实现了提高金纳米棒应用于食品过敏源检测的灵敏度和重现性的目的。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源检测，包括
[0007]I)金种的制备:加十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加HAuCl4溶液，注入NaBH4溶液，反应一段时间，
[0008]2)金纳米棒的制备:将新配制的生长液加入到三角烧瓶中，加阴离子表面活性剂，搅拌，加入HAuCl4和抗坏血酸溶液，然后加入I)所制备的金种溶液，混合，水浴加热反应一段时间，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀，
[0009]3)金纳米棒的修饰:移取一定量的2)所制备的金纳米棒于离心管中，加入PBS缓冲溶液和探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置一段时间，
[0010]4)过敏源的测定:在3)所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液中，加入靶标DNA，混合，室温下反应一段时间，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量。
[0011]步骤I)所述的较佳反应时间为2~lOmin。
[0012]步骤2)所述的生长液含0.013~0.14M CTMAB及0.04~0.1mM硝酸银。
[0013]步骤2)所述的阴离子表面活性剂为具有R3-R2-R1结构的一类化合物的钠或钾盐。其中，R1为磺酸基或羧基，R2为苯环，R3为碳原子数在4~20之间的直链烷烃。
[0014]步骤2)所述的阴离子表面活性剂较佳浓度为0.3~3mM。
[0015]步骤2)所述的水浴加热反应温度为25~30°C，反应时间为5~10h。
[0016]步骤3)所述的PBS缓冲溶液pH为7.0~7.5，浓度为10~20mM。
[0017]步骤3)所述的探针DNA为端位修饰巯基的过敏源DNA探针.[0018]步骤3)所述的冰箱中放置时间为12~24h。
[0019]步骤4)所述的反应时间为5~20min。
[0020]步骤4)所述的同步荧光测定使用的激发波长和发射波长的波长在200~lOOOnm。
[0021]本发明的一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源检测较佳实施例包括以下步骤:
[0022]I)金种的制备:加十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加HAuCl4溶液，注入(TC新配制NaBH4溶液，搅拌2~lOmin，
[0023]2)金纳米棒的制备:将新配制的含0.013~0.14M CTMAB及0.04~0.1mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加0.3~3mM十二烷基苯磺酸钠，搅拌，加入HAuCl4和抗坏血酸溶液，然后加入I)所制备的金种溶液，混合，在25~30°C水浴加热反应5~10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀，
[0024]3)金纳米棒的修饰:移取一定量的2)所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0~7.5的PBS缓冲溶液(10~20mM)和端位修饰巯基的过敏源DNA探针溶液，混合，在冰箱中放置12~24h，
[0025]4)过敏源的测定:在3)所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液中，加入靶标DNA，混合，室温下反应5~20min，然后在荧光光度计上使用激发波长和发射波长的波长在200~1000nm范围内，测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量。
[0026]该较佳实施例的工艺流程图见图1。在该较佳实施例中，以CTMAB为稳定剂，以十二烷基苯磺酸钠为添加剂，硝酸银为催化剂，抗坏血酸为还原剂，制备单分散、低生物毒性金纳米棒。将所得到的金纳米棒修饰探针DNA,通过检测金纳米棒的同步突光,计算过敏源的含量。研究表明，所得到的修饰探针金纳米棒对过敏源有非常灵敏的同步荧光响应，其检测限达0.56pM。
[0027]本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
[0028]本发明的各优选方案可互相组合使用。
[0029]相比于现有技术，本发明的有益效果如下:
[0030](I)采用阴离子表面活性剂为添加剂，由于刚性的苯环深入到CTMAB双层胶束间，刚性苯环将CTMAB的亲水头基彼此分开，从而避免了因亲水头基间强烈的相互排斥造成的胶束结构破坏。另外，含苯环阴离子表面活性剂的烷基链与CTMAB的憎水链相互缠绕，提高了反应体系的表面活性，也使CTMAB的双层结构更稳定，从而改善了金纳米棒的稳定性和单分散性。
[0031](2)与传统方法相比CTMAB使用量减少，所制备金纳米棒有很好的亲生物性，为金纳米棒在生物标记、医学检测等方面的广泛应用奠定了扎实基础。
[0032](3)金纳米棒与探针DNA通过巯基连接，然后与探针DNA与过敏源发生产生了迅速且特异性结合，使金纳米棒在一定程度上产生聚集，通过测定金纳米棒的共振吸收光谱，计算过敏源含量，因此过敏源的检测在分析时间、成本、灵敏度和选择性方面明显优于GC-MS及LC-MS法，可广泛应用于食品中过敏源的快速检测。
【具体实施方式】
[0033]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”、“常压”是指日常操作间的温度和气压，一般为25°C，一个大气压。
[0034]下述实施例中，所用的RF-5301型荧光分光光度计，狭缝宽度为2.5nm。
[0035]实施例1
[0036]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴力口 5mL 0.5mM HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL，反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.2M CTMAB及0.12mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加ImL 14mM十二烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL,混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的花生过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入花生过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.59pM。20次重复测定相对标准偏差为1.1 %。
[0037]实施例2[0038]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加5mL 0.5mM HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL,反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.2M CTMAB及0.1mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加0.8mL14mM十六烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL，混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的虾过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入虾过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.83pM。20次重复测定相对标准偏差为0.9%。
[0039]实施例3
[0040]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加5mL 0.5mM HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL,反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.16M CTMAB及0.14mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加0.8mL14mM十二烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL，混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的虾过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入虾过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.75pM。20次重复测定相对标准偏差为1.2%。
[0041]实施例4
[0042]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加5mL 0.5mM HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL,反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.16M CTMAB及0.12mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加0.8mL14mM十六烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL，混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的花生过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入花生过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.68pM。20次重复测定相对标准偏差为1.1%。
[0043]实施例5
[0044]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加5mL 0.5Mm HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL,反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.14M CTMAB及0.1mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加ImL14mM十八烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL，混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的虾过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入虾过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.65pM。20次重复测定相对标准偏差为1.3%。
[0045]实施例6
[0046]金种的制备:加5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加5mL 0.5mM HAuCl4溶液，注入0.0lM NaBH4溶液0.6mL,反应2min ;金纳米棒的制备:将新配制的含2mL 0.18M CTMAB及0.12mL 4mM硝酸银的生长液加入到三角烧瓶中，加ImL14mM十八烷基苯磺酸钠，搅拌，加入2mL ImM HAuCl4和0.18mL 0.0394M抗坏血酸溶液，然后加入上述所制备的金种溶液0.04mL，混合，水浴加热反应10h，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀；金纳米棒的修饰:移取2.5mL上述所制备的金纳米棒于离心管中，加入pH为7.0，IOnmol的PBS缓冲溶液和端位修饰巯基的花生过敏源探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置12h ;过敏源的测定:取上述所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液250 μ L，加入花生过敏源DNA，混合，室温下反应5min，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量，所得到过敏源的检测限为0.79pM。20次重复测定相对标准偏差为1.0%。
【专利附图】

【附图说明】
[0001]以下结合【专利附图】

【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0002]图1是本发明的工艺流程图。
【权利要求】
1.一种单分散、低生物毒性金纳米棒的制备方法及用于过敏源检测，包括 1)金种的制备:加十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)溶液于烧瓶中，搅拌，滴加HAuCl4溶液，注入NaBH4溶液，反应一段时间， 2)金纳米棒的制备:将新配制的生长液加入到三角烧瓶中，加阴离子表面活性剂，搅拌，加入HAuCl4和抗坏血酸溶液，然后加入I)所制备的金种溶液，混合，水浴加热反应一段时间，冷却，过滤除去析出的CTMAB沉淀， 3)金纳米棒的修饰:移取一定量的2)所制备的金纳米棒于离心管中，加入PBS缓冲溶液和探针DNA溶液，混合，在冰箱中放置一段时间， 4)过敏源的测定:在3)所制备的修饰探针DNA的金纳米棒溶液中，加入靶标DNA，混合，室温下反应一段时间，然后在荧光光度计上测定同步荧光，根据同步荧光光谱峰强度代于线性回归方程计算过敏源含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的较佳反应时间为2?lOmin。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的生长液含0.013?0.14MCTMAB及0.04?0.1mM硝酸银。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的阴离子表面活性剂为具有R3-R2-R1结构的一类化合物的钠或钾盐。其中，R1为磺酸基或羧基，R2为苯环，R3为碳原子数在4?20之间的直链烷烃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的阴离子表面活性剂较佳浓度为 0.3 ?3mM。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的水浴加热反应温度为25?30°C，反应时间为5?IOh0
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的PBS缓冲溶液pH为7.0?7.5，浓度为10?20mM。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的探针DNA为端位修饰巯基的过敏源DNA探针。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的冰箱中放置时间为12?24h。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的反应时间为5?20min。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的同步荧光测定使用的激发波长和发射波长的波长在200?lOOOnm。
【文档编号】G01N21/64GK103884693SQ201210554854
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】李在均, 黄颖娟 申请人:江南大学