一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法

一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法。本发明通过将标准阳性血清的稀释方法固定，即固定血清抗体的量，将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，基于阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，成功建立了一种对口蹄疫病毒有效抗原定量的新技术，命名为反向液相阻断ELISA。该方法继承了液相阻断ELISA方法用于测定血清抗体时可分型、操作简单、重复性好、高敏感性、高特异性、可批量检测等优点，同时实现了对FMDV的有效抗原量的定量测定，为解决现今国内外急需解决的疫苗效力检验动物替代问题提供了技术手段。
【专利说明】—种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测FMDV有效抗原的新方法，特别涉及一种可用于分型、测定血清FMD抗体的液相阻断ELISA检测方法、一种可定量FMDV中146S抗原含量的蔗糖梯度离心方法以及标定血清抗体某一抗体效价下50%阻断有效抗原量的方法。本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒(Foot and Mouth DiseaseVirus, FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。目前已知口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:0、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O、A和亚洲I型进行疫苗免疫。
[0003]疫苗接种与扑杀相结合是发展中国家预防、控制乃至逐步消灭口蹄疫最为常用的手段。随着新技术的发展，出现了以表位疫苗、类病毒样颗粒、合成肽为代表的新型疫苗，但是传统的口蹄疫灭活疫苗仍然在我国口蹄疫控制中发挥着主要作用。现阶段疫苗生产中口蹄疫病毒的繁殖已经开始由传统的转瓶BHK21细胞单层培养法向BHK21细胞悬浮培养方法过渡，BHK21细胞悬浮培养方法由于其在病毒培养中的巨大优势引起了疫苗生产厂家的重视。口蹄疫病毒主要采用二乙烯亚胺(BEI)灭活，病毒灭活彻底，并且灭活前后抗原含量变化小,免疫佐剂以油佐剂为主。
[0004]FMD疫苗的效力试验主要采用本动物进行免疫攻毒试验，即Η)50测定法:用疫苗50%动物保护剂量(PD50)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3PD50，紧急接种疫苗需至少达到6PD50。目前，发达国家已经采用本动物替代方法检测FMD疫苗的效力，该检测方法也是我国FMD疫苗生产急需解决的关键技术之一。FMD疫苗效力检验替代方法主要有疫苗抗原定量方法和血清学测定口蹄疫抗体替代法。
[0005]FMD疫苗抗原定量主要有免疫扩散法、间接夹心ELISA146S抗原定量法、蔗糖密度梯度离心法。口蹄疫病毒抗原定量的方法目前常用的是蔗糖密度梯心纯化146S方法和间接夹心ELIA方法测定146S含量方法。蔗糖密度梯度离心纯化测定完整病毒粒子(146S)含量是最常用的的方法。根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子(146S)、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白(12S)。146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分，因此146S抗原颗粒也被认为与口蹄疫疫苗的效力具有平行关系。1971年，Fayet等首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原颗粒的方法；1974年,Barreling等在此基础上做了改进,使此方法更加精确敏感。Doel等进一步发展和标准化了这个方法，并于1982年向OIE正式推荐了这个方法。1990年，Junsuke等用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原颗粒纯化后，用软件CDS系统对146S抗原颗粒实现了电脑自动化定量。有研究者还开展了 146S抗原颗粒含量与疫苗的本动物效力(PD50)相关性的研究。试验证明，在一定的范围内，146S抗原颗粒的含量与疫苗效力有相关性。
[0006]由于蔗糖密度梯度离心测定146S抗原不能区分血清型，而ELISA方法在技术操作要求、FMDV定型、批量检测等方面具有优势，研究者一直探索用ELISA方法解决抗原定量问题。Van Maanen等1990年用针对VPl的单克隆抗体双抗夹心ELISA法定量FMD疫苗的146S含量；Crowther等1995年利用诊断VPl的单克隆抗体建立能区分146S和12S的双抗夹心法。单克隆抗体作为捕获抗体不能完全辨别抗原的所有功能区域，不能完全反映抗原的免疫原性和本动物接种疫苗后一系列复杂的免疫反应；基于多克隆抗体建立的双抗夹心ELISA，由于同型FMD毒株间存在许多亚型，要想定量准确，必须使捕获抗体和检测抗体与要检测的抗原以及标准对照抗原同源，在未知被检测的毒株来源的情况下，该方法也很不理想。
[0007]口蹄疫血清学效力检测替代方法是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力，主要包括病毒中和试验和液相阻断ELISA试验。1968年，Stellman等提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法；到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了猪、牛、羊等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使用，阴性动物的选择也存在困难。
[0008]口蹄疫灭活疫苗本动物效力检验替代方法的探索是国内外面临和亟待解决的一个问题，有效的替代方法应该具有很好的特异性、敏感性和重复性，而且要易于标准化。疫苗免疫效果主要是由疫苗中的有效抗原含量决定的，所以建立能科学准确测定疫苗中的有效抗原含量的方法是解决口蹄疫疫苗效力检验替代问题的关键。所谓有效抗原应为具有一定的免疫原性并且免疫产生的血清抗体具有一定的抗感染或攻毒保护的抗原。因此，有效抗原应包括完整病毒粒子(146S)、空衣壳(76S)和部分抗原肽。
[0009]本发明综合分析了液相阻断ELISA测定抗体、间接ELISA测定抗原量和病毒中和试验等方法。液相阻断ELISA方法测定抗体是在满足检测血清敏感性和特异性的条件下固定抗原的量，将待检血清系列稀释，从而测定血清抗体效价；经典的病毒中和试验提到可以固定抗原的量测定血清抗体的量，反之也可以通过固定血清的量测定抗原的滴度。我们从中得到启发，把标准阳性血清的稀释方法固定，将待检抗原作系列稀释与之作用，基于阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，本发明成功建立了一种对口蹄疫病毒有效抗原定量的新技术，本发明将这种ELISA方法命名为反向液相阻断ELISA。
[0010]作为FMDV抗原定量的反向液相阻断ELISA方法，它继承了液相阻断ELISA方法用于测定血清抗体时可分型、操作简单、重复性好、高敏感性、高特异性、可批量检测等方便的所有优点，实现了像测定血清抗体一样测定FMDV的有效抗原量。利用该项技术本发明已经初步建立起O、亚I和A型FMDV有效抗原定量的反向液相阻断ELISA方法。口蹄疫病毒抗原含量测定反向液相阻断ELISA方法的建立和应用可以解决现今国内外急需解决的疫苗效力检验动物替代问题。
[0011]反向液相阻断ELISA方法定量FMDV有效抗原量，在进一步试验的基础上可以解决一下几个问题:通过与蔗糖密度梯度离心方法平行比较，可以确定完整病毒粒子(146S)含量与利用液相阻断ELISA测定的有效抗原含量的关系；通过测定疫苗中有效抗原量与试验动物攻毒保护的关系，可以确定疫苗有效抗原含量与50%动物保护剂量(PD50)的关系；通过测定疫苗中有效抗原量与免疫动物抗体水平的关系(合格率、保护率)，可以根据免疫有效抗原含量掌握动物疫苗免疫后群体抗体水平。同时通过口蹄疫病毒生产流程中，对每一个环节抗原量的监测有利于持续改进提高优化生产工艺；可以实现按有效抗原量进行单价苗(或多组份苗)、双价及多价疫苗的配制；可以对疫苗储藏、流通、免疫接种前各个阶段进行有效抗原量监测，确保疫苗的质量和动物免疫的有效性；动物疫苗免疫可以实现按有效抗原量指导免疫。
[0012]因此反向液相阻断ELISA测定口蹄疫病毒有效抗原量的方法必将在测定疫苗抗原含量、疫苗效力检验替代、疫苗免疫群体抗体水平评估、疫苗质量控制、免疫指导等方面得到广泛应用。

【发明内容】

[0013]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够定量口蹄疫病毒有效抗原的新方法-一反向液相阻断ELISA方法，其基本原理是标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的。如果把标准阳性血清的稀释方法固定，加入不同比例稀释的待检抗原(标准抗原以已知的最佳稀释度稀释)与之作用，每个稀释度的抗原均设置不加血清的四孔抗原对照；同样稀释的阳性标准血清在其相同的抗体滴度下阻断50%时的被检抗原和标准对照抗原的有效抗原量是相同的。由于标准阳性血清抗体滴度的计算值是在一定范围内变化的，计算出的抗体滴度与对应抗原的有效抗原含量存在着反比例关系，被检抗原的有效抗原含量等于被检抗原对应的阳性标准血清的抗体滴度除以标准对照抗原对应的阳性标准血清的抗体滴度乘以(标准对照抗原的有效抗原含量/对应的稀释倍数)乘以待检抗原对应的稀释倍数。血清的具体抗体滴度按改进的reed-Meunch法计算。本发明将这种ELISA检测技术命名为反向液相阻断ELISA方法。与液相阻断ELISA测定血清抗体的区别在于:液相阻断ELISA方法测定抗体时是将满足标准阳性血清抗体测定敏感性和特异性要求的有效抗原通过稀释固定，去检测被检血清中的抗体滴度；反向液相阻断ELISA是将已知抗体效价的阳性标准血清的稀释方法固定，加入按不同稀释度稀释的被检抗原，对变量、固定量及已知量与被检测量的设置刚好是相反的。
[0014]本发明在国内外率先突破了对液相阻断ELISA方法的利用，克服了蔗糖密度梯度离心、间接夹心ELISA等方法定量146S抗原的不足。由于该方法操作简单、可分型、经济有效，能快速、便捷、准确地测定出FMDV的有效抗原含量，是抗原定量和疫苗效力检验替代的最理想方法，必将会被广泛应用。
[0015]为了达到该目的，本发明所采取的技术方案步骤如下:
[0016]1、FMDV阳性标准血清抗体效价的测定(液相阻断ELIS方法)；
[0017]2、FMDV146S抗原的纯化(蔗糖密度梯度离心法)；[0018]3、标准阳性血清阻断50%FMDV有效抗原量的测定(146S)或以一般FMDV抗原作为标准对照抗原其有效抗原量的标定；
[0019]经蔗糖密度离心纯化的146S抗原标定过的普通FMDV抗原，其有效抗原量既已确定就可以作为该方法的标准对照抗原。
[0020]5、血清抗体滴度的计算方法；
[0021]6、被检抗原有效抗原量的计算方法(改进的reed-Meunch法)；
[0022]此外还可包括:
[0023]7、取值范围的计算；
[0024]8、敏感性(准确检测最低极限)和特异性分析。
[0025]具体的，本发明为一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法，其特征在于通过将标准阳性血清的稀释方法固定以达到固定血清的量的目的，并将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，参考阳性标准血清在某一抗体效价下阻断50%标准对照抗原的有效抗原量的测定结果，基于标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，通过以下公式计算得到:
[0026]
【权利要求】
1.一种用于定量检测FMDV有效抗原的反向液相阻断ELISA方法，其特征在于通过将标准阳性血清的稀释方法固定以达到固定血清的量的目的，并将待检抗原作系列稀释与之作用，同时设置已知有效抗原含量的标准对照抗原，参考阳性标准血清在某一抗体效价下阻断50%标准对照抗原的有效抗原量的测定结果，基于标准阳性血清在某一恒定的抗体效价下其50%阻断有效抗原量是一定的这一抗原抗体反应原理，通过以下公式计算得到:
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为已知有效抗原含量的抗原，包括纯化的146S抗原,经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的标准对照抗原为经蔗糖密度梯度离心纯化得到的146S抗原。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的包括以下步骤: (1)标准阳性血清抗体滴度测定； (2)FMDV 146S抗原的纯化及含量测定； (3)标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%时146S有效抗原量的测定； (4)待检FMDV样品有效抗原量的标定 a、包被ELISA板 用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次； b、按每孔50μ I量在 抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，按每孔50 μ I量在血清稀释孔内加入按不同比例稀释的FMDV抗原以及作为标准对照抗原的146S抗原，不同浓度稀释的待检FMDV抗原和作为标准对照抗原的146S抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，100 μ I/孔，其中146S抗原量为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断时146S抗原含量； C、洗板和转移 将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时；洗板，将与兔抗血清同源的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST稀释至工作浓度，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时； d、酶促反应 洗板5次，加入用PBST稀释的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时；洗板5次，加入底物溶液，50 μ I/孔，37°C孵育15分钟，再每孔加入50 μ I量的1.25%H2S04终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值； (5)被检FMDV抗原有效抗原量计算:
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于将所述的标准对照抗原替换为经146S标定过的已知有效抗原含量的普通抗原，所述的普通抗原按照权利要求4中步骤(3)的方法标定。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，标准阳性血清阻断50%时146S有效抗原量的测定是按照以下步骤进行的: a、包被ELISA板 用pH值9.60.05M碳酸盐缓冲液将兔抗FMDV血清稀释并包被ELISA板，室温过夜，PBST洗板5次； b、抗原抗体反应 在抗原抗体反应板上用pH值7.4的PBST将阳性标准血清按比例作2倍连续稀释，一般使得血清抗体滴度处于4个稀释滴度的中间，按每孔50 μ I量在血清稀释孔内加入用PBST按不同比例稀释的146S抗原以及已知有效抗原含量的抗原作为对照抗原；不同浓度稀释的146S抗原和对照抗原均设4孔不加血清稀释液的抗原作为对照，对照抗原加入量为标准阳性血清在其抗体滴度下阻断50%对照抗原时的对照抗原的抗原含量，混匀后封板置4°C过夜； C、洗板和转移 将载体板上的抗原抗体混合物按次序平移至ELISA板上，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时；洗板，将与兔抗血清同源抗原的FMDV豚鼠抗血清用含10%正常牛血清和5%健康兔血清的PBST根据使用浓度进行稀释，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时； d、酶促反应 洗板5次，加入用PBST稀释 的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，50 μ I/孔，封板，37°C孵育I小时；洗板5次，加入底物溶液，50 μ I/孔，37°C孵育15分钟，再每孔加入50 μ I量的1.25%H2S04终止反应，酶标仪492nm波长下读取吸光值； 选取146S抗原对应抗体滴度与对照抗原对应的阳性标准血清抗体效价最为接近的浓度作为阳性标准血清在其抗体滴度下50%阻断146S的有效抗原量，作为本方法最根本的标准对照抗原。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于所述的FMDV抗原包括O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原以及A型FMDV抗原。
【文档编号】G01N33/569GK103884839SQ201210555104
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】周广青, 马军武, 林密, 冯霞, 郭建宏, 何继军, 杨亚民, 蒋韬 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所