专利名称：一种制备丙氨酸转氨酶的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程技术高效制备丙氨酸转氨酶的方法，产物可作为抗原物质进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为临床化学诊断所需校准品、标准物质和参考品的制备开发奠定基础。
背景技术：
丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase, ALT, EC2. 6.1. 2)是谷氨酸和丙酮酸之间的转氨酶，又名谷丙转氨酶，简称GPT、ALT。谷丙转氨酶升高在临床是很常见的现象。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是不是 正常，对人体来说是非常重要的。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。在常见的因素里，各类肝炎都可以引起GPT升高，这是由于肝脏受到破坏所造成的。一些药物如抗肿瘤药、抗结核药，都会引起肝脏功能损害。大量喝酒、食用某些食物也会引起肝功能短时间损害。GPT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。临床上有很多疾病可引起转氨酶异常1.病毒性肝炎这是引起转氨酶增高最常见的疾病，各类急、慢性病毒性肝炎均可导致转氨酶升高。2.中毒性肝炎多种药物和化学制剂都能引起转氨酶升高，但停药后，转氨酶可恢复正常。3.大量或长期饮酒者谷丙转氨酶也会升高。4.肝硬化与肝癌肝硬化活动时，转氨酶都高于正常水平，应该积极治疗。5.胆道疾病胆囊炎、胆石症急性发作时，常有发热、腹痛、恶心、呕吐、黄疸、血胆红素及转氨酶升高6.心脏疾病急性心肌梗塞、心肌炎、心力衰竭时，谷丙转氨酶和谷草转氨酶均升高，患者常有胸痛、心悸、气短、浮肿。心脏检查有阳性体征及心电图异常。7.其他某些感染性疾病，如肺炎、伤寒、结核病、传染性单核细胞增多症等，都有转氨酶升高的现象。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。谷丙转氨酶的正常参考值为O 40U/L。我国幅员辽阔，人口众多，临床诊断试剂市场巨大，前景广阔。就国内的现状来说，我国的诊断试剂行业仍处于成长初期，即产品研发与生产的投入初期，成长期还没有真正到来，而我国诊断试剂市场规模约为全球市场的1/14，有较大的成长空间。研制价廉物美的诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。目前国外的产品通常是把试剂、参考品(校准品、质控品)、仪器作为一个系统(封闭系统)推入市场，在检测重复性、准确性上有很大的优势，并且具有市场垄断性。国内主要的诊断试剂生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，市场上认可的国产产品寥寥无几。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、制备成本低廉，成功率高的制备丙氨酸转氨酶的方法。1.为实现上述目的，本发明一种制备丙氨酸转氨酶的方法，该方法包括I)改造并全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子;2)将步骤I)中改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；4)所得菌体破菌，离心分离，过N1-NTA柱纯化；其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为ATGGCTTCTT CTACTGGTGA TCGTTCTCAG GCTGTTCGTC ATGGTCTGCG TGCGAAAGTTCTGACCCTGG ACGGCATGAA CCCGCGTGTT CGTCGCGTCG AATACGCCGT GCGTGGCCCGATCGTTCAGC GTGCTCTGGA ACTGGAACAA GAACTGCGTC AGGGCGTTAA AAAGCCGTTCACCGAGGTTA TCCGCGCCAA CATCGGCGAT GCCCAGGCTA TGGGTCAGCG TCCTATCACCTTCCTGCGCC AGGTCCTGGC GCTGTGCGTA AACCCAGACC TGCTGAGCTC TCCGAACTTCCCGGACGACG CTAAGAAACG TGCGGAACGC ATCCTGCAGG CATGCGGTGG CCACAGCCTGGGCGCTTACA GCGTTTCCTC CGGTATCCAG CTGATTCGTG AAGATGTTGC CCGTTACATCGAGCGCCGTG ATGGCGGTAT CCCGGCGGAC CCTAACAACG TATTCCTGTC TACCGGTGCGTCCGATGCCA TTGTTACCGT TCTGAAGCTG CTGGTGGCTG GCGAGGGTCA CACCCGTACCGGTGTCCTGA TTCCGATTCC ACAGTATCCG CTGTATTCTG CTACTCTGGC TGAACTGGGTGCGGTGCAGG TAGACTATTA CCTGGATGAG GAGCGCGCTT GGGCGCTGGA CGTCGCAGAGCTGCACCGCG CACTGGGCCA GGCACGTGAC CACTGCCGTC CGCGTGCGCT GTGCGTGATTAACCCGGGCA ACCCGACGGG CCAAGTTCAG ACCCGTGAAT GCATCGAAGC TGTGATTCGTTTTGCTTTCG AAGAACGTCT GTTCCTGCTG GCGGACGAAG TTTATCAGGA CAACGTTTACGCAGCCGGTA GCCAGTTTCA TTCTTTCAAG AAAGTTCTGA TGGAAATGGG TCCGCCGTATGCGGGTCAGC AAGAACTGGC ATCCTTCCAC TCTACCTCCA AAGGTTATAT GGGTGAGTGTGGCTTCCGTG GTGGTTATGT TGAAGTAGTT AATATGGACG CGGCTGTGCA GCAGCAGATGCTGAAGCTGA TGTCTGTGCG CCTGTGCCCG CCTGTGCCGG GTCAAGCCCT GCTGGATCTGGTTGTGTCTC CGCCTGCTCC GACTGATCCG TCCTTCGCAC AATTCCAGGC TGAGAAACAGGCCGTTCTGG CGGAACTGGC AGCGAAAGCC AAACTGACGG AACAAGTGTT CAACGAAGCGCCGGGTATCT CCTGCAATCC GGTACAAGGC GCGATGTATA GCTTCCCGCG CGTTCAGCTGCCGCCACGCG CAGTAGAACG TGCACAGGAA CTGGGCCTGG CTCCGGACAT GTTCTTCTGTCTGCGCCTGC TGGAAGAAAC CGGTATTTGC GTTGTACCTG GCAGCGGCTT CGGTCAACGTGAAGGTACTT ACCACTTCCG TATGACCATC CTGCCTCCGC TGGAAAAACT GCGTCT GCTGCTGGAAAAGC TGTCCCGTTT TCACGCGAAA TTCACTCTGG AATATTCTTA G进一步,步骤2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。
进一步，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。进一步，所述BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因。进一步，λ噬菌体DE3区含有Τ7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上形成所述BL21(DE3)。进一步，步骤4)中所述破菌方法为高压破碎、超声或者溶菌酶酶解。一种如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法在校准品、标准物质和参考品制备中的应用。进一步，所述制备丙氨酸转氨酶的纯品添加入人源或动物源的血清，配制成指定浓度的标准品或校准品。
一种利用权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法制成的产物作为免疫用的抗原物质，来筛选相关抗体。本发明的有益效果在于本发明制备丙氨酸转氨酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，可作为抗原物质进行动物免疫，筛选相关抗体，为尽快建立国内临床化学诊断急需的校准品制备平台，研制诊断试剂标准物质和参考品奠定基础。
图1示出构建的6His-ALT pRSF用BamH I和EcoR I酶切，得到约1. 5kb的插入片段，表明目的基因已插入载体，构建成功。图2示出纯化的ALT成品的SDS-PAGE电泳图，产品纯度可达90 %以上。
具体实施例方式下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。本发明建立了操作简单、迅速、成本较低的一种制备丙氨酸转氨酶的方法。这种方法的原理主要在于将优化后的丙氨酸转氨酶编码基因插入构建好的表达载体，在大肠杆菌中诱导其高效表达，该方法具体为1.丙氨酸转氨酶表达载体的构建改造人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子，从北京invitrogen公司全基因合成改造后的ALT编码序列；利用 http://www.faculty.ucr.edu/-mmaduro/codonusage/usage.htm 网页分析，在原始ALT编码基因序列中，大肠杆菌中密码子使用频率在10%以内占14%;改造后的基因序列完全去除大肠杆菌稀有密码子，大肠杆菌密码子完全被激活。通过基因工程手段利用BamH I和EcoRI位点将其克隆至PRSF Duet载体内，并转化大肠杆菌TOPlO菌株，挑取数个转化克隆提取质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定目的基因是否插入载体(图1所示)，选取插入目的基因的质粒进行DNA序列测定，结果表明丙氨酸转氨酶基因成功克隆至pRSF Duet载体内，我们将其命名为6His-ALT pRSF。改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为
权利要求
1.一种制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，该方法包括 1)改造并全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子； 2)将步骤I)中改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达； 3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导； 4)所得菌体破菌，离心分离，过N1-NTA柱纯化； 其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为
2.如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。
3.如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。
4.如权利要求3所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，所述BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因。
5.如权利要求4所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，λ噬菌体DE3区含有Τ7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上形成所述BL21 (DE3)。
6.如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，步骤4)中所述破菌方法为高压破碎、超声或者溶菌酶酶解。
7.—种如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法在校准品、标准物质和参考品制备中的应用。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制备丙氨酸转氨酶的纯品添加入人源或动物源的血清，配制成指定浓度的标准品或校准品
9.一种利用权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法制成的产物作为免疫用的抗原物质，来筛选相关抗体。
全文摘要
本发明公开了一种制备丙氨酸转氨酶的方法，该方法包括改造全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；将改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化；本发明制备丙氨酸转氨酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，作为抗原物质可进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为尽快建立国内临床化学诊断急需的校准品制备平台，研制诊断试剂标准物质和参考品奠定基础。
文档编号G01N33/53GK103014033SQ20121056747
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者肖飞, 黄薇, 张传宝, 王大光 申请人:肖飞