专利名称：检测α-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人体内酶含量的检测试剂，尤其涉及一种检测a-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂及其制备方法，属于a -L-岩藻糖苷酶的检测领域。
背景技术：
a -L-岩藻糖苷酶(a -L-Fucosidase, AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，分类名为a-L-岩藻糖苷岩藻糖水解酶(EC3. 2. 1.51)。它主要存在于人体内的各种组织、细胞及体液中，如肝、胰、脑、肺、肾纤维细胞等的溶酶体内，以肝肾含量最高。在血清、尿液、唾液、泪液和垂体液中均含此酶。基本生理功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代谢。岩藻糖苷贮积症患者的脑、肝、肾、肺、尿内都有该酶的缺乏，导致在这些器官内出现异常的沉积物。在脑、肝等组织的沉积物是一种含有岩藻糖的糖脂，主要以岩藻糖为终末部分的四己糖基及五己糖基神经酰胺为主，特别是脑内此特征最为明显。因此可能这是岩藻糖苷贮积症的发病机制。本病分幼儿型和成人型，他们有共同的特征如全身肌张力低下、出汗过多、体态短小、进行性智力和运动发育迟缓等。幼儿型一般在一岁左右出现明显临床症状，多死于10岁以内。a -L-岩藻糖苷酶升高多见于肝脏受损患者、妊娠与卵巢肿瘤等情况。早在1977年，Bauer等就在动物实验中观察到鼠肝癌组织中AFU活力较正常肝脏高7倍，提示AFU可作为一项肝癌非特异性标志物；1980年Deugnier等首先在人肝癌患者血清中发现AFU活性明显高于正常人，正式为诊断原发性肝癌(PHC)提供了新的指标。肝癌患者血清AFU升高的原因目前暂不清楚，可能机制是①肝癌细胞合成酶增加并大量释放入血。②血清AFU破坏减少，正常时肝枯否细胞从血清中清除AFU，推测肝癌患者由于细胞免疫功能低下或其他原因使枯否细胞清除AFU的能力下降，而表现为酶活性升高。③含岩藻糖的糖蛋白和糖脂的代谢紊乱。目前临床诊断早期肝癌的主要生化指标是甲胎蛋白(AlphaFetal Protein,AFP)，它是胚胎时期肝细胞合成的一种特殊糖蛋白，可促进胚胎肝组织迅速增殖，故胎血中含量高，在胎儿出生后约I 4周基本消失，成人血中含量非常少。当肝癌组织只有O. I O. 2厘米的癌块时，患者血液中就能检测到AFP的升高，而此时用B超、CT、磁共振等的影像学检查还难以发现。诊断早期肝癌，AFP比影像学检查要早数月至I年左右，这能为患者赢得宝贵的治疗时间。原发性肝细胞癌中，70 90%的患者AFP呈阳性。临床上对AFP的检测均使用免疫的方法，不可避免会有假阳性和假阴性的结果。而作为对早期原发性肝癌诊断的有力补充，AFU具有较大的优势。国内对24例肝细胞癌患者进行血清AFU和AFP相关研究，发现AFU诊断敏感为87%，特异性为78%，而AFP则分别为65%和89% (诊断界限为，20ug/L)。提示AFU诊断的敏感性好，而特异性较AFP低。血清AFU的检测方法有两大类荧光法与比色法。荧光法利用AFU水解4_甲基伞型酮a-L-岩藻吡喃糖苷释放4-甲基伞型酮产生荧光来进行检测，灵敏度较高，但该法对仪器条件要求高，常规应用有较大困难。比色法中，早期以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷(PNPF)为底物，经AFU水解后释放4-硝基苯酚(4-NP)，反应一定时间后用碱性缓冲液终止反应并使4-NP呈黄色，在规定波长下读取吸光度A，利用标准曲线或4-NP的摩尔吸光度可以计算出AFU活性。后来以PNPF为底物还发展了速率法的检测方法，使灵敏度、抗干扰性都有所提高，适用于各种半/全自动分析仪器。但因底物溶解性的问题，需要调节反应PH值为6. 1，在这个PH下AFU活性只能达到60% 70%，因此PNPF底物的速率法测值偏低。另外一种以氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷(CNPF)作底物，灵敏度和精密度较PNP法都有了很大的改善。但大多为干粉试剂，且易受样本中溶血、黄疸及脂血的干扰。公开号为CN 1428435Α的中国发明专利申请公开了一种使用CNPF为底物的检测试剂，但该法检测过程中易产生肝素的干扰现象。公开号为CN 1464066Α的中国发明专利申请公开了一种单试剂的检测试剂，能够有效节约自动生化仪上试剂位，但依然存在易受样本肝素干扰的现象。公开号为CN 1731146Α公开了一种思路新颖的检测方法，在试剂中引入烟酰胺辅酶I (NADH)氧化还原系统，大大提高了试剂的灵敏度，但NADH的保存条件与AFU的反应条件具有不可调和的矛盾，因此该法只能是双试剂的剂型，而且引入了岩藻糖苷酶脱氢酶使试剂成本大大提高。公开号为CN 101571537Α的中国发明专利申请公开了一种 能够抗肝素干扰的检测试剂，以CNPF为底物，能有效抵抗样品中肝素的干扰，但此试剂为双试剂。总之，现有的检测a -L-岩藻糖苷酶的试剂大多不同程度的存在以下几种问题I)在以氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷(CNPF)作底物时，往往会有稳定性较差的问题，因此大多以干粉试剂的形式保存，使用户操作起来不方便；2)在检测肝素抗凝血浆时，大多都存在受肝素干扰的导致测值偏低的问题。3)大部分a -L-岩藻糖苷酶测定试剂为液体双试剂，增加了自动生化仪上试剂位的负担。因此实践中亟待开发一种稳定性好、能够有效抗肝素干扰的a -L-岩藻糖苷酶检测单试剂。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有的检测a-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂所存在的稳定性差、不能有效抗肝素干扰的缺陷，提供一种新的检测a -L-岩藻糖苷酶的液体单试剂，该液体单试剂具有优异的稳定性且能够抵抗样品中肝素的干扰。本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种检测a-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂，包括缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、表面活性剂、稳定剂和氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷(CNPF)。为了达到更好的检测效果，每I升液体单试剂中各组分的用量优选为缓冲液O. 01-0. 5摩尔质量，乙二胺四乙酸O. Ol-lOg，NaCl O. 1-lOOg，表面活性剂O. 1-10 g，稳定剂O. 1-10 g，氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷O. 05-20 g，余量为水。更优选的，每I升液体单试剂中各组分的用量优选为缓冲液O. 02-0. 2摩尔质量，乙二胺四乙酸O. 05-lg，NaCl l_50g，表面活性剂O. Ι-lg，稳定剂O. Ι-lg，氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷O. 1-5 g，余量为水。
本发明通过实验发现，当缓冲液的pH值为3. 0-5. O时，相比于其它的pH值比较有利于底物CNPF的稳定以及AFU酶活性的充分发挥，由此，本发明试剂中缓冲液的pH值优选为3. 0-5. O ;本发明中所述的缓冲液可选自甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液中的任意一种或多种。本发明液体单试剂中的表面活性剂有利于样本中各种物质的溶解，减少样本脂浊对测定结果的影响。本发明中所述的表面活性剂优选为非离子型表面活性剂，例如可选自Tween20> Tween80> Triton X_100、Brij 35等非离子型表面活性剂中的任意一种或多种。本发明液体单试剂中所加入的稳定剂可以为醇类有机溶剂，例如可以为甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、丙三醇、聚乙二醇等醇类有机溶剂的任意一种或多种。本发明通过实验发现，通过加入稳定剂不仅能够有效提高液体单试剂在2-8存储或者37°C加速过程中保持稳定性，出乎意料的是，稳定剂能够和表面活性剂相协同从而有效的消除样品肝素的干扰， 最终提高检测的准确度和灵敏性。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备所述检测a -L-岩藻糖苷酶液体单试剂的制备方法。本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备检测a -L-岩藻糖苷酶液体单试剂的制备方法，包括( I)按所述用量取各成分；(2)将各成分溶解于蒸馏水中，定容，即得。应用本发明的AFU测定试剂，采用的测定方法为速率法，温度为37°C，样本R为25:225，测定主/副波长为410/520nm，试剂中加入样本或校准后在测定稳定孵育180秒后，记录吸光度值Al，然后继续孵育180秒后记录吸光度值A2。计算方法如下
Δ A/minX Vt X 1000
AFU (U/L) =---------------------------= Δ A/minXF*
e X Vs Xd
Δ A/mi η----每分e------摩尔消光
钟吸光度变化率系数
Vt-----反应液总Vs-----标本体积
体积(ml)(ml)
1000-----变化因d------I 比
数色杯光径(cm)
F*--------理论因
数(1250)稳定性试验结果表明，本发明检测a -L-岩藻糖苷酶的液体单试剂分别在42°C保存3天，37°C保存14天和2-8°C保存18个月后，各项性能均保持稳定，表明本发明液体单试剂稳定性良好且能够抵抗样本中至少100KU/L的肝素干扰。
图I本发明液体单试剂检测肝素抗凝样本反应曲线图。图2对照液体单试剂检测肝素抗凝样本反应曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例I本发明液体单试剂的制备将pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂TWeen20，稳定剂甲醇以及氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液O. 02摩尔质量，乙二胺四乙酸O. Olg，NaCl 5g，表面活性剂TWeen20 O. lg，稳定剂甲醇O. I g，氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷O. 5g，余量为水。实施例2本发明液体单试剂的制备将pH值为5. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂Triton X-100，稳定剂乙二醇以及氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为5. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液O. 05摩尔质量，乙二胺四乙酸O. 5g，NaCl 10g，表面活性剂Triton X-100 10 g，稳定剂乙二醇10 g，氯化对硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷2g，余量为水。实施例3本发明液体单试剂的制备将pH值为4. O的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂Brij35，稳定剂异丙醇以及氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.02摩尔质量，乙二胺四乙酸0.058，恥(1 Ig，表面活性剂Brij 35 O. I g，稳定剂异丙醇O. Ig,氯化对硝基苯a-L-岩藻批喃糖苷O. Ig,余量为水。实施例4本发明液体单试剂的制备将pH值为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂TWeen80，稳定剂乙二醇以及氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液O. 2摩尔质量，乙二胺四乙酸lg，NaCl 5g，表面活性剂TWeen80 I g，稳定剂聚乙二醇lg，氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷O. 5g，余量为水。对比实施例I液体单试剂的制备将pH值为3. O的甘氨酸-盐酸缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂TWeen20以及氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液O. I摩尔质量，乙二胺四乙酸O. Olg , NaCl O. Ig，表面活性剂Tween20 O. Ig,氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷O. 05g,余量为水。对比实施例2液体单试剂的制备将pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂Triton X-100以及氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为5. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液O. 5摩尔质量，乙二胺四乙酸IOg，NaCl IOg，表面活性剂Triton X-100 10 g,氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷O. 2 g,余量为水。对比实施例3 液体单试剂的制备将pH值为4. O的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂Brij 35以及氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液O. 02摩尔质量，乙二胺四乙酸O. 05g，NaCl lg，表面活性剂Brij 35 O. I g，氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷O. lg，余量为水。对比实施例4 液体单试剂的制备将pH值为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液，乙二胺四乙酸，NaCl，表面活性剂TweenSO以及氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷加入到蒸馏水中混合均匀并充分溶解于水中，即得液体单试剂；其中，每I升液体单试剂中各成分的用量控制为，pH值为5. O的乙酸-乙酸钠缓冲液O. 2摩尔质量，乙二胺四乙酸lg，NaCl 5g，表面活性剂TWeen80 I g，氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷O. 5g，余量为水。试验例I检测Ci-L-岩藻糖苷酶液体单试剂的稳定性试验一、试验材料I、供试试剂实施例1-4所制备的液体单试剂；2、对照试剂对比实施例1-4所制备的液体单试剂。二、试验方法测定方法为速率法，温度为37°C，样本试剂为25:225，测定主/副波长为410/520nm,供试试剂或对照试剂加入样本或校准后在测定稳定孵育180秒后，记录吸光度值Al，然后继续孵育180秒后记录吸光度值A2。计算方法如下
Δ A/minX Vt X 1000
AFU (U L) =---------------------------= Δ A/minXF*
e X Vs Xd
权利要求
1.一种检测a-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂，其特征在于，包括缓冲液、乙二胺四乙酸、NaCl、表面活性剂、稳定剂和氯化对硝基苯a -L-岩藻吡喃糖苷。
2.按照权利要求I所述的液体单试剂，其特征在于，每I升液体单试剂中各组分的用量为缓冲液O. 01-0. 5摩尔质量，乙二胺四乙酸O. Ol-IOg ,NaCl O. I-IOOg，表面活性剂O.1-10 g,稳定剂O. 1-10 g,氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷O. 05-20 g，余量为水。
3.按照权利要求2所述的液体单试剂，其特征在于，各组分的用量为缓冲液O.02-0. 2摩尔质量，乙二胺四乙酸0.05-lg，NaCl l_50g，表面活性剂O. l_lg，稳定剂O. Ι-lg，氯化对硝基苯a-L-岩藻吡喃糖苷O. 1-5 g。
4.按照权利要求I所述的液体单试剂，其特征在于所述缓冲液的PH值为3.0-5. O。
5.按照权利要求1-4任何一项所述的液体单试剂，其特征在于所述的缓冲液选自甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液中的任意一种或多种。
6.按照权利要求1-4任何一项所述的液体单试剂，其特征在于所述的表面活性剂是非离子型表面活性剂。
7.按照权利要求6所述的液体单试剂，其特征在于所述的非离子型表面活性剂是Tween20> Tween80> Triton X-100 或 Brij 35 中的任意一种或多种。
8.按照权利要求1-4任何一项所述的液体单试剂，其特征在于所述的稳定剂为醇类有机溶剂。
9.按照权利要求8所述的液体单试剂，其特征在于所述的醇类有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、丙三醇或聚乙二醇中的任意一种或多种。
10.一种制备权利要求1-4任意一项所述液体单试剂的制备方法，其特征在于，包括 (1)按所述用量取各成分； (2)将各成分溶解于蒸馏水中，定容，即得。
全文摘要
本发明公开了检测α-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂及其制备方法。所述液体单试剂包括缓冲液、乙二胺四乙酸、NaCl、表面活性剂、稳定剂和氯化对硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷。本发明液体试剂中的稳定剂不仅能够有效提高液体单试剂的稳定性,还能够和表面活性剂相协同有效消除样品肝素的干扰，从而提高检测的准确度和灵敏性。稳定性试验结果表明，本发明检测α-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂分别在42℃保存3天，37℃保存14天和2-8℃保存18个月后，各项性能均保持稳定，表明本发明液体单试剂稳定性良好且能够抵抗样本中至少100KU/L的肝素干扰。
文档编号G01N21/31GK102967571SQ20121056879
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司