专利名称：一种检测河豚毒素的胶体金免疫层析试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种生物检测方法，具体的是一种快速检测河豚毒素的胶体金免疫层析试纸。
背景技术：
河豚毒素(tetoodotoxin，TIX)是一种毒性较强的小分子非蛋白类神经毒素，其毒性是氰化钠的1250多倍，由于其可与神经细胞膜的钠离子通道受体高度特异性的结合，阻断钠离子通道，从而抑制神经冲动的传导。河豚鱼肉味鲜美、营养丰富，中国、日本等国民都有食用的习惯，而由于其含河豚毒素常导致误食中毒，而河豚毒素理化性质较稳定，通常 的烹饪方法很难将其破坏，河豚毒素中毒发病时间快，死亡率高，民间素有“拼死吃河豚”的说法。目前关于河豚毒素的检测方法主要分为生物检测法、理化检测法。生物检测有小鼠生物检测法和离体组织法。小鼠检测方法的优点是操作简单，但灵敏度较差，特异性也差，只能判断样品是否含有毒素，而不能定性是否就是河豚毒素。理化检测法有紫外荧检测法等，荧光法和紫外分光光度法过程简单、快速，但对样品纯度要求较高。GC/MS联机检测法、高效毛细管区带电泳法等仪器检测法比较灵敏，但样品处理比较麻烦，所用仪器昂贵，检测费高。免疫胶体金技术是通过抗体(或抗原)包被胶体金离子制成免疫胶体金，由免疫胶体金与其对应的抗原(或抗体)反应，根据能否使胶体金粒子聚集显示出胶体金粒子本身的红色，因此可肉眼直观判断检测结果，检测时间短。制成试纸条使用方便，操作简单无需特殊仪器，样品无需特殊处理，可随时携带随时检测。对于小分子抗原的检测，采用竞争抑制法能取得良好的效果。因小分子只有一个抗原位点，不能同时结合两个抗体，因此不能采用双抗体夹心法检测。其检测原理为胶体金颗粒标记单克隆抗体，而检测线包被小分子抗原，质控线包被抗鼠IgG。检测时，样本中的待检抗原首先与金标抗体结合，上行到达检测带时，如待检抗原把一定量的抗体完全饱和，则金标抗体将不能与检测带的抗原结合，不会出现肉眼可见的红色条带，为阳性结果。如标本中无待检抗原，则金标抗体与检测带的抗原结合，形成红色条带，为阴性结果。选用该方法应特别注意胶体金颗粒的抗体吸附量及包被抗原量。
发明内容本实用新型的目的是提供一种快速简便地检测河豚毒素的胶体金免疫层析试纸，该试纸能够基于少量样品和试纸，实现快速检测样品中是否含有河豚毒素。该试纸的工作原理是利用特异性的抗原-抗体结合。本实用新型所述的检测试纸，由载体板(I)、硝酸纤维膜(2)、胶体金垫(3)、加样垫(4)和吸收垫(5)组成。载体板(I)位于底层，硝酸纤维膜(2)、胶体金垫(3)、加样垫(4)、吸收垫(5)依次粘贴在载体板上表面，硝酸纤维膜(2)位于载体板中部，胶体金垫(3)设在硝酸纤维膜(2)的一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠，加样垫(4)设在胶体金垫(3)上并与胶体金垫(3)部分重叠，吸收垫(5)设在硝酸纤维膜(2)的另一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠。其中载体板(I)采用PVC板，胶体金垫(3)采用玻璃纤维膜，加样垫(4)采用玻璃纤维，吸收垫(5)采用滤纸。胶体金垫(3)上均匀涂布一层有胶体金标记的鼠抗河豚毒素单克隆抗体(一抗)。硝酸纤维膜(2)上设有检测线T和质控线C，检测线T包被有检测抗原(河豚毒素)，检测线T靠近加样垫一端；质控线C包被有质控抗体(抗鼠IgG，二抗)，质控线C靠近吸收垫一端。如果样品中含有河豚毒素，在虹吸作用下，河豚毒素将通过加样垫渗透到胶体金 垫上，并与胶体金垫上含有的胶体金标记抗体(抗河豚毒素单克隆抗体，一抗)，结合后，形成结合物1，即“胶体金-一抗-抗原”结合物；该结合物I继续在硝酸纤维膜上向吸水垫处迁移，在经过检测线T处时，将不和包埋在此的检测抗原(河豚毒素)发生结合，因此检测线T处不显色；结合物I继续向吸水垫处迁移，到达质控线C处时，和包埋在此的质控抗体(抗鼠IgG，二抗)形成结合物2，即“胶体金-一抗-抗原-二抗”结合物；结合物2因产生凝聚反应而在质控线C处显出胶体金的颜色。此种情况为阳性，即检测线T不显色，质控线C显色，表明样品中含有河豚毒素。如果样品中不含有河豚毒素，在虹吸作用下，不含河豚毒素的样品将通过加样垫渗透到胶体金垫上，胶体金垫上含有的胶体金标记抗体(抗河豚毒素单克隆抗体，一抗)，在没有结合到抗原(河豚毒素)的情况下，在硝酸纤维膜上向吸水垫处迁移，在经过检测线T处时，将和包埋在此的检测抗原(河豚毒素)发生结合，形成结合物1，即“胶体金-一抗-抗原”结合物，结合物I因产生凝聚反应而使检测线T处出现显色条带；结合物I继续向吸水垫处迁移，到达质控线C处时，和包埋在此的质控抗体(抗鼠IgG，二抗)形成结合物2，即“胶体金-一抗-抗原-二抗”结合物；结合物2因产生凝聚反应而在质控线C处显出胶体金的颜色。此种情况为阴性，即检测线T显色，质控线C显色，表明样品中不含河豚毒素。本实用新型涉及检测试纸的制备方法，该方法包括以下步骤胶体金垫的制备；硝酸纤维膜的点样包被；胶体金免疫层析试纸条的组装。I、胶体金垫的制备。取胶体金(PH7. 0-8. 5)以Iml/管分装于I. 5ml的离心管，每支管分别加入抗河豚毒素单克隆抗体15_20mg,轻摇混匀后放置5-10min,每管加入含10%小牛血清(BSA)封闭缓冲液100ml,轻摇混勻，放置5-10min,4°C、IOOOrpm离心30-60min,弃上清。每支管加入含1% BSA的磷酸缓冲液(PBS)lml，混匀后同上离心，弃上清，得到葡萄红色疏松沉淀，加入含1% BSA的PBS缓冲液500ml，混匀，均匀涂布于宽Icm的玻璃纤维膜上，37°C烘干，制备成胶体金垫。2、硝酸纤维膜的点样包被。以硝酸纤维膜中间线为基准，在距离其左端Icm处，设置检测线，在距离其右侧Icm处设置质控线。检测线上点样包被河豚毒素，质控线上点样包被羊抗鼠IgG(二抗)。抗体的包被浓度为l_4mg/ml，点样量为1ml，形成两条宽约1_的条带，干燥后用含1% BSA的PBS缓冲液封闭24h，再以PBS缓冲液(PH7. 0)洗2次，于37°C烘干。3、胶体金免疫层析试纸条的组装[0017]载体板位于底层，将硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫、吸收垫依次粘贴在载体板上表面，其结构如图I所示。粘贴结实后，裁剪成条状，得到河豚毒素胶体金免疫层析检测试纸条。本实用新型提供了一种可用于检测样品中河豚毒素的胶体金免疫层析试纸条，检测快速、便捷，操作简单无需特殊仪器，样品无需特殊处理，检测结果可肉眼直观判断。
图I为实用胶体金试纸结构组成的正侧面示意图。其中，I为载体板；2为硝酸纤维膜(T为检测线，C为质控线)；3.胶体金垫；4为加样垫；5为吸收垫。图2为胶体金试纸结构组成的俯侧面示意图。其中，I为载体板；2为硝酸纤维膜；3为胶体金垫；4为加样垫；5为吸收垫。图3为实验结果模式示意图。其中，A为加样前的示意图，B为无效试纸，C为阳性结果，D为阴性结果。T为检测线，C为质控线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但本实用新型的范围不仅限于此。实施例I。河豚毒素胶体金免疫层析试纸的制备。材料试纸条结构组成参见附图I ;载体板为PVC板；吸收垫为滤纸；样品垫采用玻璃纤维膜，胶体金垫采用玻璃纤维膜。胶体金(购自湖州英创生物科技有限公司);抗河豚毒素单克隆抗体(一抗，购自上海雅吉生物科技有限公司)，检测抗原为河豚毒素(购自美国Sigma公司)；质控抗体为羊抗鼠IgG (二抗,购自北京鼎国生物技术公司)。方法取pH 8. 0的胶体金以Iml/管分装于I. 5ml的离心管,每支管分别加入20mg抗河豚毒素单克隆抗体，轻摇混匀后放置5min，使抗体与金颗粒结合。每管加入10%的BSA溶液100ml,轻摇混勻，放置5min进行封闭。然后于4°C、离心30min (转速IOOOrpm),弃去上清。每支管加入1% BSA的PBS缓冲液1ml，混匀后离心，弃上清，得到葡萄红色疏松沉淀。加入1% BSA的PBS缓冲液500ml，混匀后均匀涂布于宽Icm的玻璃纤维膜上，37°C烘干，制备成胶体金垫。在硝酸纤维膜中段间隔Icm处，分别点样检测抗原和质控抗体，包被浓度为2mg/ml，点样量为1ml。形成两条宽约Imm的条带，干燥后用1%BSA的PBS缓冲液封闭24h，再以PBS缓冲液(pH7. 0)洗2次，于37°C烘干后备用。载体板位于底层，将硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫、吸收垫依次粘贴在载体板上表面，其结构如图I所示。粘贴结实后，裁剪成条状，得到河豚毒素胶体金免疫层析检测试纸条。实施例2。河豚毒素胶体金免疫层析试纸的使用。用移液器取含(或不含)河豚毒素的样品20_40ml，将其滴加于河豚毒素胶体金免疫层析试纸条的加样垫处，滴加IOOml生理盐水，静置15-20分钟观察试纸条颜色变化。只在质控线C处有葡萄红色条带，则结果为阳性，即含河豚毒素；在检测线T和质控线C均有葡萄红色条带，则结果阴阳性，即样品不含河豚毒素；加样后，质控线C如无葡萄
红色条带，结果无效。
权利要求1.一种检测河豚毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征是由载体板(I)、硝酸纤维膜(2)、胶体金垫(3)、加样垫(4)和吸收垫(5)组成；载体板(I)位于底层，硝酸纤维膜(2)、胶体金垫(3)、加样垫(4)、吸收垫(5)依次粘贴在载体板上表面,硝酸纤维膜(2)位于载体板中部，胶体金垫(3)设在硝酸纤维膜(2)的一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠，加样垫(4)设在胶体金垫(3)上并与胶体金垫(3)部分重叠，吸收垫(5)设在硝酸纤维膜(2)的另一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠。
2.根据权利要求I所述的胶体金免疫层析试纸，其特征是所述的胶体金垫(3)上均匀的涂布一层有胶体金标记的鼠抗河豚毒素单克隆抗体。
3.根据权利要求I所述的胶体金免疫层析试纸，其特征是所述的硝酸纤维膜(2)上靠近加样垫一端设有包被有检测抗原的检测线，靠近吸收垫一端设有包被有质控抗体的质控线。
专利摘要一种检测河豚毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征是由载体板、硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫和吸收垫组成；载体板位于底层，硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫、吸收垫依次粘贴在载体板上表面，硝酸纤维膜位于载体板中部，胶体金垫设在硝酸纤维膜的一侧并与硝酸纤维膜部分重叠，加样垫设在胶体金垫上并与胶体金垫部分重叠，吸收垫设在硝酸纤维膜的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠。胶体金垫上均匀的涂布一层有胶体金标记的鼠抗河豚毒素单克隆抗体。硝酸纤维膜上靠近加样垫一端设有包被有检测抗原的检测线，靠近吸收垫一端设有包被有质控抗体的质控线。本实用新型检测快速、便捷，操作简单，样品无需特殊处理，可肉眼直观判断。
文档编号G01N33/577GK202522562SQ20122007736
公开日2012年11月7日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者余勃, 陆豫, 马春燕 申请人:南昌大学