专利名称：检测链霉素的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测牛奶和蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的试纸条。
背景技术：
链霉素(Sti^ptomycin)是一种重要的氨基糖苷类抗生素，被广泛应用于动物疾病的治疗，链霉素对鸡、羊、牛、猪的各类炎症，如鸡传染性鼻炎、猪急性支气管炎、猪白痢、奶牛子宫内膜炎等有很好的疗效，因此经常作为饲料添加剂使用。如果不正确使用，可造成链霉素残留超标。研究证明，链霉素可对肾脏和听神经造成不可逆转的损耗，长期使用还会使细菌产生耐药性。为了保障动物源性食品的安全，农业部第235号文件《动物性食品中兽 药最闻残留限量》中规定链霉素在牛奶中为200 μ g/L,在肌肉、脂肪、肝中为600 μ g/kg,在肾中为 1000 μ g/kg ο目前链霉素残留的检测主要有仪器分析和免疫学方法。其中仪器分析法主要用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)，这些方法具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不适合进行大规模现场检测等。胶体金免疫层析试纸条已广泛用于药物残留检测中，具有操作简便、快速、不需要任何设备等优点，目前已成为免疫学检测发展方向之一。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测链霉素和双氢链霉素的试纸条。本实用新型的试纸条，其包括冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有链霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，检测线和质控线平行，质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，检测线位于距离质控线5-6mm。试纸样品吸收垫为检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线，微孔试剂上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。本实用新型试纸条中试纸底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。本实用新型试纸条具有如下有益效果I.灵敏度高。链霉素检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的链霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对牛奶中链霉素、双氢链霉素检测限为80 μ g/L,对蜂蜜中链霉素、双氢链霉素检测限为20 μ g/L O2.显示检测结果形象、直观准确。检测时试纸以显示红色线“ I ”及“ I I ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中链霉素、双氢链霉素药物含量高于等于试纸条对链霉素、双氢链霉素药物的最低检测限，两条红线“ 11 ”印迹表示在被检测样本中链霉素、双氢链霉素含量低于试纸条对链霉素、双氢链霉素药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。 3.成本低，投资少。使用本实用新型试纸条，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。4.易于大范围推广应用。试纸条操作简单，能较好满足牛奶、蜂蜜检测的需求，具 有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、链霉素检测试纸条的组装制备I)试纸样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫为检测端粘贴有保护膜，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有链霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸和2)微孔试剂组装成试纸条，装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试纸条盒体12内的固定用具11中。二、试纸条的使用I、检测牛奶样品[0029]待检牛奶样品溶液滴加200 μ I到微孔中，混匀后，室温(20°C -25°C )孵育5min，将印有“MAX”线端朝下插入孵育后的微孔试剂后计时，室温孵育5min，观察结果。2、检测蜂蜜样品检测蜂蜜样品时需要先对蜂蜜样品进行前处理准确称取O. 5g蜂蜜 到4ml离心管中，加入I. 5ml O. 2mol/L磷酸盐缓冲液，涡动lmin，混匀待检。(注意1.对无结晶的蜂蜜需搅拌均匀后进行称量。2.如有结晶蜂蜜，置于不高于60°C水浴中温热，等蜂蜜全部融化后搅拌均匀，冷却至室温后进行称量。)吸取待检蜂蜜提取液100 μ I于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；将印有“MAX”线端朝下插入微孔中，使之充分浸入溶液中；室温孵育5 IOmin后，取出根据示意图判定结果。三、检测结果分析链霉素、双氢链霉素在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，链霉素单克隆-胶体金标记物与药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与链霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸以显示红色线“I”，判为阳性，如图4. a图所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸以显示红色线为“ 11 ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试纸条中用到的材料制备方法I、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(I)链霉素半抗原的制备O. 58g链霉素与O. 07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室温下反应5_10小时，蒸除溶剂，定量得到链霉素半抗原。(2)免疫原的制备取链霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I ;取3%的戊二醛O. 5ml逐滴加入到溶液I中，室温搅拌反应24h，得到溶液II ;取牛血清白蛋白(BSA) 50mg用4ml水溶解得溶液III ;将溶液II缓慢加入溶液III中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH430mg还原；用O. 02M的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得链霉素免疫原。(3)包被原的制备取卵清白蛋白(OVA) 50mg用4ml水溶解得到溶液I ;取碳化二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中，室温搅拌反应30min，得到溶液II ;取链霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III ;将溶液II缓慢加入到溶液III中，室温搅拌反应24h，得链霉素包被原。(4)链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成O.5mg/mL的溶液，以O. Olmol/L pH7. 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200_800nm范围内扫描，得到载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明链霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。2、链霉素单克隆抗体的制备(I)制备单抗a.动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产
生抗血清。b.细胞融合和克隆化·[0054]取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8 I (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成5X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为O. 2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将I %氯金酸稀释成O. 01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 2，按每毫升胶体金溶液中加入10 50 μ g抗体的标准向胶体金溶液中加入上述链霉素单克隆抗体，继续搅拌混匀lOmin，加入10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000rpm，4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白(BSA) O. I % O. 3 % (体积百分含量)、吐温-800. 05% O. 2% (质量百分含量)、ρΗ7· 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将链霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I链霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为O. 5%(体积百分含量))、pH为7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将链霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为l.Oyg/cm2;用O. 01mol/L、pH 7. 4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/mL，用Isoflow点膜仪 其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测链霉素的试纸条，其特征在于试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述反应膜上具有包被有链霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1、2或3所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫位于底板始端，所述吸水垫位于底板末端，所述质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，所述检测线位于距离质控线5_6mm。
5.如权利要求I所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述试纸样品吸收垫为检测端粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
8.如权利要求7所述的检测链霉素的试纸条，所述微孔试剂中冻干有链霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求I所述的检测链霉素的试纸条，其特征在于所述试纸条盛装于具塞试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具为硬质支撑材料，盒体为硬纸盒。
专利摘要本实用新型提供了一种检测链霉素的试纸条，试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，链霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，反应膜上具有包被有链霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。试纸条放置于具塞试剂桶中，12个具塞试剂桶放置于具有12个孔的固定用具的盒体中。本实用新型试纸条具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在链霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK202720232SQ20122018526
公开日2013年2月6日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者何方洋, 万宇平, 冯才伟, 孙震, 陶光灿, 吴鹏, 冯静, 田甜, 陈娟, 刘琳 申请人:北京勤邦生物技术有限公司