专利名称：检测三甲氧苄氨嘧啶的胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测三甲氧苄氨嘧啶的胶体金试纸条，特别是检测牛奶中三甲氧苄氨嘧啶的试纸条，属于免疫学范畴。
背景技术：
三甲氧苄氨嘧啶别名磺胺增效剂，抗菌增效剂，甲氧苄胺嘧啶，三甲氧苄二氨嘧唳，英文名Trimethoprim(Synaprim, TMP)。化学名称为5_[ (3，4，5-三甲氧基苯基)-甲基]-2, 4- U密P定二胺[5- (3, 4, 5-trimetoxybenzene)methy-2, 4-pyrimidine diamine]，属于二氨嘧啶类(亦即苄氨嘧啶类)化合物。本品由Hitclings *G *H等于1959年合成，国内于1972年开始生产，主要由关键中间体3，4，5-三甲氧基苯甲醛(TMB)经缩合、环合反应而得，目前国内已有许多药厂生产。·磺胺增效剂为白色或类白色结晶性粉末，无臭、味苦。在氯仿中略溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中几乎不溶，在冰醋酸中易溶。本品的熔点为199 203°C。磺胺增效剂属抑菌剂，亲脂性弱碱，临床上其注射剂为微黄色或者无色。它是一种抗菌增效剂，磺胺类药物单独使用，会使细菌很易产生耐药性，与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。用于治疗尿路感染、呼吸道感染、菌莉和肠炎等一般用作磺胺类药物的增效剂，广泛用于各类磺胺制剂中，最近的研究表明，磺胺增效剂对青霉素类、氨基糖苷类等其它抗生素和合成抗生素均有一定的增效作用，故又称为广谱抗菌增效剂。因其水溶性差，现一般仅与磺胺类药联用作为口服制剂应用于临床，也因而大大限制了其在临床的应用范围和其它给药途径。磺胺增效剂可发生瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量(LD5tl)为2500毫克/千克体重。大剂量使用时,可影响叶酸代谢和作用,可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。为了保护人类健康，各国对动物源性食品中甲氧苄氨嘧啶残留量的检测很重视，均制定了严格的限量要求。例如欧盟、香港政府规定牛、猪和家禽组织中残留限量为
0.05mg/kg。我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY 5070-2002)中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100 u g/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50 u g/kg。目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但大多采用国外产的净化小柱处理样品，增加了测定成本。目前尚无关于磺胺类药物增效剂的系统检测方法，该方法的建立为监控动物源性食品中磺胺类药物增效剂残留提供了技术支持。
实用新型内容本实用新型的目的提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测三甲氧苄氨嘧啶的试纸条。本实用新型的试纸条，包括冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和检测试纸，检测试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，均呈与检测试纸的长切面相垂直的条带状。检测线位于距离样品吸收垫一侧5 8mm，所述质控线位于距离检测线r7mm，试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线，微孔试剂条的反应孔上具有胶塞。为了便于运输和使用，试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。 本实用新型试纸条中试纸条底板可为PVC底板；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。本实用新型试纸条具有如下有益效果I.灵敏度高。三甲氧苄氨嘧啶检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对三甲氧苄氨嘧啶检测灵敏度为50iig/L。2.操作简便快速。使用试纸条检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。检测是试纸条以显示红线色“ I ”及“ I I ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中三甲氧苄氨嘧啶的含量高于等于试纸条对三甲氧苄氨嘧啶药物的最低检测限，两条红线“ I I ”印迹表示在被检测样本中三甲氧苄氨嘧啶含量低于试纸条对三甲氧苄氨嘧啶药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4.成本低，投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5.易于大范围推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
[0018]图I为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图图4为本实用新型试纸检测结果判定图。图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图； 图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、三甲氧苄氨嘧啶检测试纸的组装制备I)试纸样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸两端黏贴有保护膜，保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂条微孔试剂条8具有胶塞9，板孔中冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸条和2)微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试纸条盒体12内的固定用具11中。二、试纸条的使用待检牛奶样品溶液滴加200 U I到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂后计时，5min内观察结果。三、检测结果分析三甲氧苄氨嘧啶在样本中的含量高于等于试纸条对其的最低检测限时，三甲氧苄氨喃唳单克隆-胶体金标记物与三甲氧节氨喃唳结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红线色“ I ”，判为阳性，如图4. a图所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，且检测线(T)颜色接近或浅于质控线(C)时，试纸条以显示红线色为“ I I ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条判为无效，如图4. c、4. d所示。[0039]四、检测试纸条中用到的材料制备方法如下I、三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物的合成与鉴定三甲氧苄氨嘧啶是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。I)三甲氧苄氨嘧啶半抗原的制备取0. 58 g三甲氧苄氨嘧啶、0. 40 g马来酸酐和I mL吡啶溶解于10 mL 二甲基亚砜(DMSO)中，在40°C下搅拌反应12小时，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺，即为式(I)所示化合物。2)包被原的制备-三甲氧苄氨嘧啶与卵清蛋白偶联物合成
··[0045]取8. 5mg三甲氧节氨卩密唳半抗原,溶解于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中；取15mg碳化二亚胺(EDC)用0. 2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取卵清蛋白30mg，使之充分溶解在2. 8mL PH为7. 2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h ;用0. OlmoI/LPBS在4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。3)免疫原的制备-三甲氧苄氨嘧啶与牛血清白蛋白偶联物合成取8. 5mg三甲氧节氨卩密唳半抗原,溶解于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中；取15mg碳化二亚胺(EDC)用0. 2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取牛血清白蛋白40mg，使之充分溶解在2. 8mL PH为7. 2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h ;用0. OlmoI/LPBS在4°C透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。4)三甲氧苄氨嘧啶-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、三甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200 800rim范围内扫描，得到载体蛋白、三甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明三甲氧苄氨嘧啶与载体蛋白偶联成功。2、三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体的制备A.动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150)^/只，使其产生
抗血清。B.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按数量配比9 1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体的三甲氧苄氨嘧啶单克隆杂交瘤细胞株。C.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。D.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将质量百分含量1%氯金酸稀释成0.01%，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保 存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用0. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 0,按5(Tl00li g抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述三甲氧节氨喃唳单克隆抗体，继续搅拌混勻30min,加入10%BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置30min。12000rpm,4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含酪蛋白、吐温-80的0. 02mol/L、pH7. 2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的体积百分含量终浓度为0. 05-0. 1%，吐温-80在复溶缓冲液中的质量百分含量终浓度为0. 05-0. 15%。5、将三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 U I三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70°C条件下，预冻4h后，再真空干燥14h，即可取出，得到冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于牛血清白蛋白体积百分含量终浓度为
0.5%、pH为7. 2、0. lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37。。烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将三甲氧节氨喃唳-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL,用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为I. Oii g/cm ;用0. 01M, pH
7.4 PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200ii g/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为l.Oyg/cm。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测三甲氧苄氨嘧啶的胶体金试纸条，其特征在于包括冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和检测试纸，检测试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
2.如权利要求I所 述的胶体金试纸条，其特征在于所述检测线与质控线平行，均呈与检测试纸的长切面相垂直的条带状。
3.如权利要求I或2所述的胶体金试纸条，其特征在于所述的检测线位于距离样品吸收 垫一侧5 8mm，所述质控线位于距离检测线r7mm。
4.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。
5.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述底板可为PVC底板，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
6.如权利要求I所述的胶体金试纸条，其特征在于所述微孔试剂条的反应孔上具有胶塞。
7.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸条盛装于具塞试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料，盒体为硬纸盒。
专利摘要本实用新型提供了一种检测三甲氧苄氨嘧啶的胶体金试纸条，包括冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和检测试纸，检测试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。本实用新型试纸条具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在三甲氧苄氨嘧啶残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK202794186SQ20122032020
公开日2013年3月13日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者万宇平, 付军权, 罗晓琴, 石洁, 韩京朋, 王娇, 杨昌松, 郝士元 申请人:北京勤邦生物技术有限公司