专利名称：检测碱性红g的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种检测碱性红G的试剂盒。
背景技术：
碱性红G，又名罗丹明6G或玫瑰红6G，属酞菁类着色剂，易溶于水和醇，色彩鲜艳，具有优良的匀染性和渗染性，用作工业染色剂。碱性红G为高毒类化学物质，我国、美国、力口拿大、日本、澳大利亚等多国都明确禁止食品和化妆品中使用碱性红G。因此，快速检测碱性红G在食品和化妆品中的含量是非常必要的。
发明内容基于此，本实用新型在于克服现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的检测碱性红G试剂盒。其技术方案如下检测碱性红G的试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为1-3 μ g/mL碱性红G特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3 μ g/mL碱性红G特异性抗体溶液的试剂瓶。下面对进一步技术方案进行说明在一些实施例中，所述试剂瓶还包括装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的试剂瓶、装有碱性红G标准品溶液的试剂瓶、两瓶装有显色剂的试剂瓶、装有终止液的试剂瓶、装有洗涤液的试剂瓶、装有浓缩样品稀释液的试剂瓶、装有封闭液的试剂瓶。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括有用于检测时密封酶标板的封口膜。本实用新型的检测碱性红G的试剂盒检测原理为将碱性红G特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或碱性红G的标准溶液及碱性红G特异性抗体工作液，待测样品中碱性红G和固相载体上包被的碱性红G特异性抗原竞争结合碱性红G特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中碱性红G的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出碱性红G浓度范围。下面对前述技术方案的优点进行说明本实用新型的检测碱性红G的酶联免疫试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测碱性红G，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确的检测大批量样品中的碱性红G。
图I是本实用新型实施例所述试剂盒结构示意图；[0013]图2是下凹瓶位设置示意图；图3是本实用新型实施例中酶标板结构示意图。附图标记说明1.盒体；2.下凹瓶位；3.塑料框架；4.酶标板；5.微孔。
具体实施方式
下面对本实用新型的实施例进行详细说明，但不对本实用新型的内容造成任何限制。实施例I本实施例所述的检测碱性红G试剂盒的主要组成成份如下如图I-图3所示，所述检测碱性红G试剂盒的盒体I内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14个下凹瓶位)，下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶；位于塑料框架3中的酶标板4，酶标板4中的微孔5内包被有碱性红G特异性抗原。具体组成如下I)碱性红G特异性抗原工作液；通过以下方法制得将O. 88g,即2. Ommol碱性红G分散于50mL的O. 01mol/L盐酸中，55°C搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将O. 82g，即2. Ommol的上述碱性红G羧酸衍生物、I. 2g,即5mmol N_(3_胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2. Ig,即4mmol六氟磷酸苯并三唑-I-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65°C搅拌lh，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流搅拌lh，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备得到碱性红G特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 μ g/mL。2)碱性红G特异性抗体工作液；通过以下方法制得将合成得到的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为O. 35mg/mL，剂量为IlOy g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的制备与纯化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为O. 5mL/只。将细胞浓度为I. 4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为O. 5mL/只。接种杂交瘤细胞疒10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4°C冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法每I份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液(浓度O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用浓度O. lmmol/L NaOH调整pH值至4. 5，在4°C下搅拌30min,期间缓慢加入辛酸,按稀释前腹水体积计算40 μ L/mL ;在4°C静止3h,离心(10140r/min, 30min)，取上清液，保持在4°C环境中，30min内加入(NH4)2S04使其终浓度为O. 277g/mL,静止lh,4°C离心(10140r/min, 30min),弃上清液,得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 μ g/mL。3)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；4)碱性红G标准品溶液6瓶；浓度分别为IX IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、0. 5 μ g/L ；5)酶标板；96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；6)底物显色剂；由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；7)洗涤液；为含有重量比为O. 05%-0. 5%吐温-20的O. OlM, pH为7. 4的磷酸盐缓冲液；8)终止液；为2mol/L的硫酸溶液；9)封闭液；为含5%脱脂奶粉的O. OlM, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；10)浓缩样品稀释液；为O. OlM, pH7. 4的磷酸盐缓冲液(即磷酸根浓度为O. 01M/L, pH7. 4的磷酸盐缓冲液)；11)自封袋；由商业公司提供。实施例2间接竞争ELISA方法的建立。采用间接竞争ELISA法检测碱性红G单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的碱性红G特异性抗原包被96孔酶标板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被过夜，用300 μ L/孔封闭液(即5%脱脂奶粉)封闭后用洗涤液洗涤，并拍干；2)加入碱性红G标准品溶液(浓度分别为:1 X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、0. 5 μ g/L)或样品溶液50 μ L，再加入浓度为2 μ g/mL的碱性红G特异性抗体工作液50 μ L，混合均匀，37°C温育Ih ；3)洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C温育Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L显色液B液、10 μ L显色液A液显色15min,加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处(优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定OD值。以抑制率1%为纵坐标，以碱性红G浓度的对数Ig [碱性红G (ng/mL)]为横坐标，绘制碱性红G竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中碱性红G的实际含量。抑制率计算公式如下
权利要求1.一种检测碱性红G的试剂盒，其特征在于，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为1-3 μ g/mL碱性红G特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3 μ g/mL碱性红G特异性抗体溶液的试剂瓶。
2.根据权利要求I所述的检测碱性红G的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶还包括装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗的试剂瓶、装有碱性红G标准品溶液的试剂瓶、两瓶装有显色剂的试剂瓶、装有终止液的试剂瓶、装有洗涤液的试剂瓶、装有浓缩样品稀释液的试剂瓶、装有封闭液的试剂瓶。
3.根据权利要求I所述的检测碱性红G的试剂盒，其特征在于，还包括有用于检测时密封酶标板的封口膜。
专利摘要本实用新型公开了一种检测碱性红G的试剂盒，属于添加剂检测技术领域。包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL碱性红G特异性抗原的酶标板；所述试剂瓶包括装有浓度为1-3μg/mL碱性红G特异性抗体溶液的试剂瓶。用该试剂盒对碱性红G进行检测，具有成本低廉、操作简便、灵敏性高的优点，适合用于快速而准确的检测大批量样品中的碱性红G中。
文档编号G01N33/543GK202757935SQ20122039257
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者郭新东, 罗海英, 冼燕萍, 蔡玮红, 吴玉銮, 柯振华, 陈意光, 罗东辉 申请人:广州市质量监督检测研究院