监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断和治疗用途
【专利摘要】提供一种测量细胞的代谢活性（MA）的方法。该方法包括独立地测量细胞的细胞外环境中由于以下的分泌导致的时间相关的酸化分布：（i）非挥发性可溶代谢产物；（ii）非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及（iii）挥发性可溶代谢产物；其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性。还提供利用该试验的临床方法。
【专利说明】监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断和治疗用途
[0001]发明的领域和背景
[0002]本发明在其一些实施方案中涉及监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断或治疗用途，或具体地涉及通过血液样品的代谢活性监测作出癌症诊断。
[0003]疾病治疗中的主要问题在于早期检测和分期。早期检测使得能够从疾病的发作治疗性处理，在许多情况下导致成功的治疗。疾病的分期可以表明对于最佳治疗可能是决定性的药物疗法的适当方案。例如现今，数百万人患有癌症或已患过癌症。在美国，癌症是第二种最常见的死亡原因，其仅次于心脏病。在美国，每四例死亡中癌症几乎占I例。癌症得到诊断和治疗的越快，存活机会就越好。
[0004]用于检测癌症的所有已知的方法集中在主要鉴定恶性组织和/或分泌进入循环的其病理癌症生物标志物。然而，遗憾地是，这些诊断方法仅在疾病的相对晚期阶段有效。
[0005]瓦博格效应是下面的观察结果:大部分癌细胞主要通过高的糖酵解速率和之后的细胞溶质中的乳酸生产η产生能量，而不是通过与大部分正常细胞一样的比较低的糖酵解速率和之后的在线粒体中的丙酮酸的氧化来产生能量[Kim Jff, DangCV(2006)." Cancer' s molecular sweet tooth and the Warburg effect".CancerRes.66(18):8927 - 30]。其次，在20世纪20年代，Otto Warburg发现与正常的分化细胞不同，癌细胞19’2°主要依赖于有氧糖酵解而不是依赖于线粒体氧化磷酸化来产生ATP作为细胞过程所需的能量的燃料。这个历史上的现象被称为“瓦博格效应”21。Otto Warburg假设代谢中的这种变化是癌症的根本原因[Warburg 0(1956)." On the origin ofcancer cells".Science 123 (3191): 309 - 14],现在这个陈述被称作瓦博格假说。大约50年之后，也在体外的活化淋巴细胞中观察到瓦博格效应，参见例如，Maclver等人2008J.Leukocyte Biology 84:1-9 ;以及 DeBerardinis Cell Metabolism 7:11-20。还在免疫系统中发现瓦博格效应，在免疫系统中，活化T细胞22’23快速地超诱导糖酵解，例如通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)的过表达24。
[0006]瓦博格效应具有重要的医学应用，如临床上利用恶性肿瘤的高有氧糖酵解以通过使用正电子发射断层显像(PET)对2-18F-2-脱氧葡萄糖(FDG)(放射性的且修饰的己糖激酶底物)的吸收进行成像来诊断和监测癌症的治疗反应。还参见W02007/102146。然而，这些方法由于需要高科技设施或原位组织活检而是繁琐且昂贵的。
[0007]因此，需要用于早期和简单诊断的非侵入性方法。
[0008]发明概述
[0009]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种测量细胞的代谢活性(MA)的方法，该方法包括独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布(acidification profile):
[0010](i)非挥发性可溶代谢产物；
[0011](ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；
[0012](iii)挥发性可溶代谢产物；
[0013]其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性。[0014]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中诊断与改变的代谢活性相关的疾病的方法，该方法包括:
[0015](a)提供包括细胞的受试者的生物样品；
[0016](b)独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布:
[0017]( i )非挥发性可溶代谢产物；
[0018](ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及
[0019](iii)挥发性可溶代谢产物；
[0020]其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中与在相同条件下检测的正常的未受影响的细胞样品的代谢活性相比，所述代谢活性的转变指示与改变的代谢活性相关的疾病。
[0021]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种单独地优化疾病治疗的方法，该方法包括:
[0022](a)使包括细胞的受试者的生物样品与至少一种药剂接触；
[0023](b)独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布:
[0024]( i )非挥发性可溶代谢产物；
[0025](ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及
[0026](iii)挥发性可溶代谢产物；
[0027]其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示用于疾病的有效药剂。
[0028]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在受试者中监测疾病治疗的方法，该方法包括:
[0029](a)对受试者施用至少一种针对所述疾病的药剂；
[0030](b)在施用之后，取回包括受试者的细胞的生物样品；
[0031](C)独立地测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布:
[0032]( i )非挥发性可溶代谢产物；
[0033](ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及
[0034](iii)挥发性可溶代谢产物；
[0035]其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性，并且其中细胞的代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示疾病的有效治疗。
[0036]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种在有此需要的受试者中的疾病治疗的方法，该方法包括:
[0037](a)根据权利要求2所述的方法诊断受试者中的疾病的存在；
[0038](b)根据诊断对受试者进行治疗。
[0039]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了一种鉴定能够改变细胞的代谢活性的试剂的方法，该方法包括:
[0040](a)使细胞经受试剂；
[0041](b)根据权利要求1所述的方法在(a)之后并任选地在(a)之前测量细胞的代谢活性，其中酸化分布的转变指示能够改变细胞的代谢活性的试剂。
[0042]根据本发明的一些实施方案，细胞外环境包括具有校准的缓冲能力的限定的溶液。
[0043]根据本发明的一些实施方案，缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水。
[0044]根据本发明的一些实施方案，细胞包括白细胞。
[0045]根据本发明的一些实施方案，细胞包括癌细胞。
[0046]根据本发明的一些实施方案，细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
[0047]根据本发明的一些实施方案,疾病包括癌症。
[0048]根据本发明的一些实施方案，生物样品包括血液样品。
[0049]根据本发明的一些实施方案，疾病选自由以下组成的组:癌症、病原感染和自身免疫疾病。
[0050]根据本发明的一些实施方案，测量使用选自由以下组成的组的无毒膜不透性探针来实现:pH探针、CO2探针和NH3探针以及乳酸盐探针。
[0051]根据本发明的一些实施方案,pH探针包括测比pH探针(ratiometric pH probe)。
[0052]根据本发明的一些实施方案，pH探针包括HPTS。
[0053]根据本发明的一些实施方案，非挥发性代谢物包括乳酸盐。
[0054]根据本发明的一些实施方案，挥发性代谢物包括NH3和CO2。
[0055]根据本发明的一些实施方案，测量(i )的酸化分布在暴露于空气的腔室中实现。
[0056]根据本发明的一些实施方案，测量(ii)的酸化分布在气密性的腔室中实现。
[0057]根据本发明的一些实施方案，测量酸化分布在恒温下实现。
[0058]根据本发明的一些实施方案，恒温包括37 °C。
[0059]根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在测量酸化分布之前或者与之同时使细胞经受刺激物或抑制物。
[0060]根据本发明的一些实施方案，刺激物或抑制物包括细胞。
[0061 ] 根据本发明的一些实施方案，刺激物或抑制物包括无细胞抗原。
[0062]根据本发明的一些实施方案，刺激性细胞包括淋巴细胞且细胞包括关于淋巴细胞的非同系淋巴细胞。
[0063]根据本发明的一些实施方案，测量酸化分布在商业荧光多孔板扫描仪中实现。
[0064]根据本发明的一些实施方案，MA测试背景测量值的信噪过滤通过k_均值聚类分析来进行。
[0065]根据本发明的一些实施方案，对代谢活性的诊断决策进行至少两个决策树模型(decision tree model)。
[0066]根据本发明的一些实施方案，决策树模型选自以下的组:C5、C&R Tree和CHAID。
[0067]根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括将细胞与细胞外环境分离。
[0068]根据本发明的一些实施方案，在离心作用下通过ficoll分离完成分离。
[0069]除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属的领域的普通人员所通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的内容类似或等同的方法和材料可以被用于本发明的实施方案的实施或测试中，但是下文描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而非旨在必然进行限制。
[0070]附图简要说明
[0071]在此仅以实例的方式参照附图描述本发明的一些实施方案。现在具体详细参照附图，要强调的是所示的具体内容是通过实例的方式且目的用于本发明的实施方案的示例性讨论。在这方面，结合附图的说明使得本领域的技术人员明了可以如何实施本发明的实施方案。
[0072]在附图中:
[0073]图1是氧化磷酸化、无氧糖酵解和有氧糖酵解(又称作“瓦博格效应”)之间的差异的示意图。
[0074]图2是示出了 8-羟基芘-1,3，6-三磺酸(HPTS)的pH相关的吸收光谱的图。
[0075]图3A-D是示出了在2mM和IOmM磷酸盐缓冲盐水和在I μ M HPTS下的工作溶液的PH和酸度校准的图。打开:在37°C不密封下监测酸化步骤。关闭:在37°C下在多孔板被密封之后监测酸化步骤。
[0076]X轴:比率:(在Ex.403nm处的荧光强度)/ (在Ex.455nm处的荧光强度)。
[0077]右侧Y轴(三角形):如通过连续添加IN HCl获得的HCl的累积量(μ mol/ml)。
[0078]左侧Y轴(圆形):如通过pH玻璃电极测得的合适的pH值。图3A-B——具有2mM磷酸盐缓冲盐水的工作溶液。图3C-D——具有IOmM磷酸盐缓冲盐水的工作溶液。
[0079]图4A-B是示出了在IOmM磷酸盐缓冲盐水下，在I μ M和10 μ M的HPTS浓度下的校准曲线的图。
[0080]X轴:比率:(在Ex.403nm处的荧光强度)/ (在Ex.455nm处的荧光强度)。
[0081]右侧Y轴(三角形):如通过连续添加IN HCl获得的HCl的累积量(μ mol/ml)。
[0082]左侧Y轴(圆形):如通过pH玻璃电极测得的合适的pH值。(图4A)HPTS的最终浓度为I μ M。(图4Β) HPTS的最终浓度为10 μ Μ。
[0083]图5A-D示出了 HPTS参考速率值的k_均值聚类分析。图5A_C——x轴指从“打开”获取的探针的标准值，以及I轴指从“关闭”测量获取的探针的标准值。图5A——在聚类分析之前，来自所有测试供体(N=730个观察值)的所有值的检测。图5B——探针数据的k-均值聚类分析指示在用不同的颜色表示的26个聚类上。五个聚类被发现较小(观察值< 6)，并因此被丢弃(异常值)。图5C-D——来自730个观察值的34个观察值(4.66%)被排除(红色)。剩余的696个观察值(95.34%)(蓝色)展示于图5B中的21个单独的聚类中。然后，对于每个供体重新计算“打开”状态的平均值和“关闭”状态的平均值。
[0084]图6A-C是对于递增葡萄糖浓度，对典型的健康供体和癌症供体获得的MA分布，X轴:葡萄糖浓度(mM)，y轴:图6B-C的y轴是单位为皮摩尔H+/μ I/小时/2500PBMC的hPBMC的代谢活性速率，以及图6C的j轴是单位为皮摩尔H+/ μ I/小时的hPBMC的代谢活性速率。在37°C温育I小时期间测量酸化动力学。在30分钟期间的多孔板的“打开”状态循环。在这种状态下存在CO2和NH3的气体通风，从而使得只有乳酸生产(包括其他非挥发性有机酸)有助于每个孔内的等价酸性累积。在30分钟期间的相同多孔板的“关闭”状态循环。在这种气密地封闭状态下，CO2和NH3在平衡时与水反应形成碳酸和铵离子。酸度水平由乳酸和碳酸阴离子在PH为7.3左右产生。此处评估NH4+碱性阳离子以滴定酸度水平。“关闭“打开”=C02+ (-NH3))。(图6A)MA测试的对照记录包括探针HPTS和葡萄糖，但不带有细胞。(图6B)代表典型的健康供体的45岁女性的MA分布(类似于针对不同年龄和性别所获得的分布)。(图6C)患有2期乳腺idc癌的37岁女性和治疗之前的MA分布。注意至IJ，在健康样品和患病样品之间的所诱导的MA变化可能已经在基础状态(没有刺激物的对照样品)下被检测到。
[0085]图7A-D是示出了对于递增葡萄糖，患有乳腺癌的65岁女性与69岁的健康男性相比所获得的MA分布的随访病例研究的图。黑色关闭”;红色打开”;蓝色-“C-0”= “关闭“打开”。图7A——69岁的健康男性的外周血单核细胞(PBMC)的MA分布。图7B-D示出了患有乳腺idc癌的65岁女性的外周血单核细胞(PBMC)的三个随访MA分布。X轴:葡萄糖浓度(mM)。Y轴:单位为皮摩尔/ μ I/小时/2500 PBMC的PBMC的代谢活性速率。(图7Β)随访患者的第一 MA测试，通过测试结果已经疑为患有癌症(时间=0)。(图7C)时间=+10.5个月一刚好在常规的乳房X线照相术由医生诊断患有3期乳腺idc癌之后的第二MA测试。(图7D)时间=+14.5个月——在外科手术切除左乳中2.2x2.4cm的肿瘤之后并在两个月的三次化疗治疗之后进行第六MA测试。
[0086]图8A-D是示出了对于递增PSA浓度，典型的健康供体、乳腺癌患者和乳腺癌恢复的供体所获得的MA分布的图。
[0087]图8A——包括探针HPTS和PSA的MA测试的对照记录，但不带有细胞。(图8B-D)三个不同供体的外周血单核细胞(PBMC)的MA分布。X轴:PSA浓度(μ g/ml)。Y轴:图9B-D的Y轴是单位为皮摩尔H+/ μ I/小时/2500 PBMC的PBMC的代谢活性速率以及图8Α的Y轴是单位为皮摩尔H+/μ I/小时的PBMC的代谢活性速率。在37°C温育I小时期间测量酸化动力学。黑色-“关闭”;红色-“打开”;蓝色-“C-0”= “关闭“打开”。(图8A)表示典型的健康供体的59岁女性的MA分布。(图8B)患有2期乳腺idc癌的37岁女性和任何治疗之前的MA分布。(图8C)在MA测试之前的18年从乳腺癌恢复的50岁女性的MA分布。
[0088]图9A-D示出了用于MA测试结果的模型构建和分类评估。
[0089]图9A-B——年龄在40岁以上(n=42)的第一组供体。图9C-D——年龄在22至81岁之间的第二组供体。图9A、C——两个表呈现了具有最佳分类的最佳切割点的最佳模型。“O”指的是“打开”状态，“C”指的是“关闭”状态以及“C-0”指的是“关闭-打开”状态。TP指的是真阳性，FN指的是假阴性，TN指的是真阴性以及FP指的是假阳性。图9B、D——通过累积增益图表评估和比较模型性能的两幅图。y轴示出了通过患有癌症的模型进行分类的供体的百分比。这是全部供体(健康供体和癌症患者)的百分比。X轴示出了分类为患有癌症的患者的百分比，其是用于第一组的42个全部供体以及用于第二组的67个全部供体的比例。呈现的是能够以高精确度对健康供体和癌症患者进行分类的四个最佳模型。第四个模型是来自回归模型族的逻辑回归模型。黑线指的是随机响应率(如果随机分类X%供体，那么获得X%癌症患者)。天蓝色线指的是理论最佳模型。红线指的是CHAID模型，绿线指的是C5算法，黄线指的是C&R tree模型以及蓝线指的是逻辑模型。
[0090]图10A-D呈现了使用30%的供体的验证集的MA测试的评估模型结果。图10A-B——年龄在40岁以上(n=42)的第一组供体。图10C-D——年龄在22至81岁之间的第二组供体。(a，c)使用Clementine软件V13.0将图9中所述的数据划分成“训练”和“测试”两组。图1OA—包括用于第一组的70%的供体的验证集。图1OC—包括用于第二组的70%的供体的验证集。图10A、C——在随机数据划分之后通过累积增益图表制成的评估和比较模型性能的两幅图。y轴示出了通过患有癌症的模型进行分类的供体的百分比。这是全部供体(健康供体和癌症患者)的百分比。X轴示出了分类为患有癌症的患者的百分t匕。“训练”组用于在70%的供体上构建数据挖掘模型。剩余的30%供体在之后被用于使用在训练组中产生的模型(CHAID、Logistic、C5、C&R tree)评估在“测试”组上的分类结果。如图9中所描述的，天蓝色线指的是理论最佳模型，红线指的是CHAID模型，绿线指的是C5算法，黄线指的是C&R tree模型，蓝线指的是逻辑模型以及黑线指的是随机模型。图10B、D——两个表呈现了在随机数据划分之后的具有最佳分类的最佳切割点的最佳模型。“O”指的是“打开”状态，“C”指的是“关闭”状态以及“c-ο”指的是“关闭-打开”状态。TP指的是真阳性，FN指的是假阴性，TN指的是真阴性以及FP指的是假阳性。在“测试”组中，两组供体C5的性能最佳，而在“训练”组中，C&R tree的性能最佳。
[0091]图11描述了工作假设:类似肿瘤发展的镜像的hPBMC的代谢活性分布。癌症发展被认为与可能反映在hPBMC的不同的代谢活性(MA)分布中的免疫系统的生理功能的变化相关。Y轴呈现代谢途径的两个臂，即氧化磷酸化对有氧糖酵解。X轴呈现肿瘤发展从健康到转移癌症的阶段。静止细胞(Q)具有氧化磷酸化的主要基本速率。在肿瘤发展的初始阶段下，存在Q的相关组织特异性子群(Qi) “克隆扩增”成抗肿瘤效应子杀伤细胞(Eki)，其在后续阶段可能转变成促肿瘤效应子喂养细胞(Efi)。伴随地，免疫耐受和无反应性屈服于转移阶段，其中组织特异性效应子子群可以被耗竭，包括其各自的静止子群(Qi )。本结果揭示了从健康供体的hPBMC优先的主要氧化磷酸化到在局部肿瘤发展阶段(1-3期)的各个癌症患者的hPBMC优先的主要有氧糖酵解(“瓦博格效应”)的代谢转变。朝向有氧糖酵解的转变可能与主要的Efi子群相关以及也可能与Eki子群相关。癌症的组织特异性早期检测(O期)的能力将通过随访的方案进行检验。预期将揭示与健康供体所获得的代谢活化进行比较，在组织特异性抗原的刺激下增强的/降低的代谢活化。在早期的转移癌症(4期)中，朝向主要氧化磷酸化的逐渐向后转变是所期望的，产生用于适当治疗的诊断工具。特征性的代谢活性分布的以上示意性描述由条纹的橙色线呈现，其与MA测试的差异“关闭-打开”结果相关，这表明hPBMC的瓦博格效应转变。
[0092]图12是MA测试方案和分析框架的流程图。MA测试框架的顺序阶段A-E符合以下的实施例部分的实施例1中所详细描述的。
[0093]图13A-1是对于递增葡萄糖浓度，对典型的健康、癌症和自身免疫性狼疮供体所获得的MA分布。X轴:葡萄糖浓度(禮)。Y轴:单位为皮摩尔H+/ul/小时/2500细胞的PBMC的代谢活性速率。在37°C温育I小时期间测量酸化动力学。
[0094]图13A、D、G——“关闭”；图 13B、E、H——“打开”；图 13C、F、I——“C-0”= “关闭打开”。图13A-C—典型的健康供体的代表性MA分布。图13D-F——典型的癌症患者的代表性MA分布。图13G-1——患有系统性狼疮(自身免疫疾病)的患者的MA分布。
[0095]发明的具体实施方案的说明
[0096]本发明在其一些实施方案中涉及监测和分析代谢活性分布的方法及其诊断或治疗用途，或具体地涉及通过血液样品的代谢活性监测作出癌症诊断。
[0097]在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是本发明在其应用中并不必需限于以下说明中阐述的细节或实施例所示例的细节。本发明能够具有其它实施方案或能够以各种方式实施或进行。[0098]如今，迫切需要高通量方法用于各种疾病的早期检测和分期。例如，癌症被发现和治疗的越快，存活机会就越好。此外，鉴定疾病的阶段确保适当的治疗。
[0099]本发明人已经认识到，与分析与疾病相关的各种原位参数或相关的循环标志物允许在相对晚期阶段的疾病检测的用于疾病检测的标准方法不同，免疫系统可能在疾病发作时已经反映疾病状态。由于免疫系统天然负责对抗已经在早期阶段的疾病发展，鉴定相关的免疫反应的特性分布将会是有益的。免疫系统的代谢活性的这种分布连同疾病发展的变化可能也对疾病分期有用。例如，在体内稳态中，免疫系统活性应该得到很好控制；活动过度与自身免疫疾病相关，而癌症发展可能与免疫系统的活动过少相关。这些相反的路径可以由响应于各种营养物和刺激物的一般的和更专门的MA分布来指示。
[0100]因此，本发明人设计了一种用于定量测量相关细胞群的代谢活性的独创的、面向临床的方法，作为疾病的指示剂。通过使用PH敏感的不透性荧光探针监测细胞外酸化，该试验测量微升细胞样品的代谢活性的速率。
[0101]正如以下实施例部分所阐明的，使用代谢活性(MA)分析，本发明人揭示了在从癌症患者和健康供体获得的PBMC上监测到的不同的代谢途径之间的显著转变。可以采用该转变作为诊断工具，用于通过监测PBMC的代谢活性的特征性变化来明确区分健康和癌症患者(图6-10、13)。这些显著的初步发现是通过比较“打开”对“关闭”(气密性的)孔中的MA测试结果而获得的。两种记录使得能够测量可溶性对挥发性代谢产物(乳酸对于CO2和NH3)的累积，从而区别开三种代谢途径一氧化磷酸化、无氧糖酵解以及有氧糖酵解，如以下所解释的。
[0102]非活化T细胞(原初T细胞)，像大多数正常分化细胞一样，主要依赖于线粒体氧化磷酸化来有效地产生用于细胞过程所需的能量的ATP，以及挥发性的CO2产物。在氧气不存在时，它们必须依赖于ATP生产的更加低效的代谢途径，其与称为无氧糖酵解的乳酸生产相关。相反，大部分癌症细胞18被发现依赖于有氧糖酵解，这类似于无氧糖酵解，尽管氧气存在。Otto Warburg最初发现这一现象与癌细胞相关，并称为“瓦博格效应”。本发明人揭示“瓦博格效应”在癌症患者的新鲜PBMC中的存在。不限于理论，“瓦博格效应”的免疫代谢合理性，即癌症患者的新鲜PBMC中的原初淋巴细胞和活化淋巴细胞之间的转变，可能与肿瘤细胞附近的活化T细胞的积极而有效的生理机能的需要相关，其中在血管生成之前的早期阶段可能缺氧。这种想法与以下事实一致:肿瘤细胞通过“瓦博格效应”最初适于缺氧。
[0103]按照上述代谢途径，终产物即CO2和乳酸直接导致MA测试检查到的酸化。
[0104]此外，被认为在MA测试中扮演重要角色的另一种终产物是氨(NH3)。细胞能量的主要来源之一是蛋白质分解代谢，其是将蛋白质分解为氨基酸的过程。氨基被从氨基酸上去除并被转化为氨。细胞的NH3生产的另一来源是通过构成两组含氮碱基的嘌呤和嘧啶的代谢途径。在本测量系统中，如在体内，活细胞必须通过代谢酸性和碱性产物如乳酸、碳酸和铵碱的分泌将细胞质保持在约为7.2-7.4的恒定pH。
[0105]这些发现已经确保，通过与免疫系统进行通信，面向生理的MA分析对于开发新的途径来检测、诊断和治疗癌症以及其他疾病可以具有重要的意义。
[0106]因此，根据本发明的一方面，提供了一种测量细胞的代谢活性(MA)的方法。该方法包括独立地(即，单独地)测量细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布:[0107](i)非挥发性可溶代谢产物；
[0108](ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；
[0109](iii)挥发性可溶代谢产物；
[0110]其中，时间相关的酸化分布中的至少一个指示细胞的代谢活性途径。
[0111]如本文所使用的“代谢活性途径”是指线粒体氧化磷酸化、无氧糖酵解、有氧糖酵解以及NH3+生产对能量生产的相对贡献。
[0112]该分布可以具有尖峰构形或单调的饱和性态。
[0113]尖峰分布通常反映代谢活性的受体介导的刺激，其被预期与浓度相关的营养反应相比更具体。后一反应通常是单调的饱和分布。
[0114]如本文所使用的“细胞”是指可以测量上述代谢活性的原核或真核细胞。细胞可以是细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。根据具体的实施方案，细胞是人类细胞。将意识到的是，细胞可以指单个细胞，但也可以指多个细胞。细胞可以是分离的细胞(没有组织结构)或在组织或组织碎片中的细胞。根据具体的实施方案，当细胞是PBMC时，对IO3-1Oki个细胞完成试验。根据具体的实施方案，细胞的数量是106_107。
[0115]细胞可以是分化细胞、未分化细胞(例如，干细胞)或去分化细胞。
[0116]根据具体的实施方案，细胞是免疫系统的细胞，即是白血细胞(B卩，白血球)。实例包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞(T细胞或B细胞)、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。
[0117]根据另一个实施方案，细胞是任何组织的病原或病变细胞如癌细胞。下面提供了根据本教导可被检测到的其他疾病和医学病症。
[0118]可以根据本教导进行分析的其他细胞包括但不限于胚胎细胞(如用于IVF鉴定)、红血细胞、血小板、受细菌感染的细胞、受真菌感染的细胞以及受病毒感染的细胞。
[0119]因此，细胞可以指分离的细胞群，该分离的细胞群包括高度纯化的特定细胞亚群，即，同质的细胞群(例如，>80%纯度)，例如，T细胞，或非同质细胞群，该非同质细胞群包括各种类型的免疫细胞，如外周血白细胞(PBL)或单核细胞。
[0120]细胞可以是未培养的、培养的原代细胞或克隆细胞(例如，细胞系)。
[0121]细胞可以是贴壁细胞或悬浮的细胞。
[0122]根据另一个实施方案，细胞可以是未遗传修饰的或遗传修饰的。
[0123]如本文所使用的“独立测量”是指条目(i )、(ii)以及可能(iii)的单独的测量。尽管将意识到的是，根据具体的实施方案，(iii)是从(ii)减去(i )的结果。这些单独的测量可以在相同的但单独的细胞样品上并行地、同时执行，或依次地在单个细胞样品上执行(如下面的实施例部分中所描述的)。
[0124]因此，通过校准的酸化曲线(表I)执行测量细胞外酸化分布。
[0125]通过计算“打开”和“关闭”状态下在细胞的细胞外环境(例如，pmol/ul/小时/2500细胞)中的与荧光测量的pH变化相关的累积酸化来执行代谢活性的测量。将意识到的是，根据具体的实施方案，只在细胞的细胞外环境而不是细胞内执行该测量。细胞外PH测量是有利的，因为在细胞外环境中存在持久性的酸性累积，而由于体内平衡的生理调节瞬态的细胞内反应中存在相对小的平均变化；细胞外探针对细胞内过程没有生理干扰；存在细胞外的测比荧光探针的比较高的信噪比；相对于细胞操作，荧光介质(校准的缓冲能力)制备的简单；与细胞内探针的严重泄漏相比，不存在背景荧光；不需要渗透化过程进行动力学测量，从而允许活细胞的实时分析；存在与猝灭和氧化作用相关的问题最少；并且，最后实现同时高通量动力学测量，而没有上述问题。
[0126]如本文所使用的细胞的“细胞外环境”是指自然环境，例如，血液或血浆，或者人工
环境如培养基。
[0127]根据具体的实施方案，MA测试在具有校准的缓冲能力的限定的溶液(所有组分是已知的)中实现。
[0128]将意识到的是，缓冲能力应该确保生理pH的较小变化。
[0129]根据具体的实施方案，缓冲液为磷酸盐缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水1-1OmM或IOmM磷酸盐缓冲液)。将意识到的是，在低细胞浓度下的酸化测量要求低缓冲液浓度。根据具体的实施方案，对2.5xl06细胞/ml使用IOmM磷酸盐缓冲盐水。
[0130]因此，在培养期间通过HPTS荧光校准的缓冲能力的较小酸化方法监测代谢活性的动力学。
[0131]图3A-D和4A-D分别描述了工作溶液校准和探针校准。
[0132]根据具体的实施方案，在恒定温度例如20_40°C下或具体地在最佳生长温度下如对于哺乳动物细胞为37°C，执行测量酸化分布。
[0133]如本文以上所述，细胞外酸化分布指示细胞分泌的各种代谢产物的身份。
[0134]如图1所示，肿瘤或增生性组织(例如，活化T细胞)优先地使用有氧糖酵解，其特征主要是乳酸盐分泌到介质中。相反，分别取决于氧气的可获得性，分化组织将采用氧化磷酸化或无氧糖酵解，并因此将分泌CO2或乳酸盐。
[0135]根据具体的实施方案，时间相关的酸化分布由于非挥发性可溶代谢产物主要为乳酸盐的分泌而在暴露于空气的腔室中执行。在这种状态(“打开”)下，存在CO2和NH3的气体通风，使得只有乳酸生产(包括其他非挥发性有机酸)有助于每个孔内的等效酸性累积。
[0136]根据具体的实施方案，时间相关的酸化分布由于非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物的分泌而在气密性腔室中实现。在气密地封闭状态(“关闭”)下，CO2和NH3在平衡时与水反应形成碳酸和碱性铵离子。然而，在这种状态下，NH4+碱性阳离子将乳酸和碳酸阴离子产生的酸度水平滴定为PH7左右。
[0137]根据具体的实施方案，在多孔板的空气“打开”和“关闭”状态的30分钟顺序内测
量酸化动力学。
[0138]通过酸化(+ )和碱性滴定(_)的适当速率(V)，在打开状态(Vopen)和关闭状态(Vclosed)下的酸化的总测量速率由耦合方程来描述:
[0139]Vopen=V (乳酸)。
[0140]Vclose=V (乳酸)+V (碳酸)-V (铵碱)。
[0141]使用这种配置，时间相关的酸化分布由于挥发性可溶代谢产物的分泌而通过
(ii)- (i)的分布的减法来计算。
[0142]使用无毒膜不透性探针执行测量细胞外酸化的动力学。实例包括但不限于测比pH探针、CO2探针、NH3探针、乳酸盐探针以及它们的组合。根据具体的实施方案，在pH缓冲条件下，高灵敏度要求测比技术。
[0143]根据本教导可以使用的具体探针的实例包括但不限于HPTS、CFDA和羧基荧光素。这些探针是商业上可获得的，如购自Molecular Probes。
[0144]根据具体的实施方案，使用测比pH探针8-羟基芘-1，3，6-三磺酸(HPTS)实现测
量酸化。
[0145]HPTS是在含水缓冲液中pKa为?7.3的低成本、无毒性、高水溶性不可透膜的pH指示剂。HPTS表现出pH相关的吸收转变，允许测比pH测量作为在455nm和403nm处的激发下随后测量的513nm处的荧光强度之间的比率的函数。该方法是pH为7左右的生理范围内的较小PH变化的本灵敏测量的关键。
[0146]根据具体的实施方案，荧光探针被附接到纳米颗粒如纳米传感器，以便扩大各种代谢产物的比例度量的特定光学监测:C02、NH3、乳酸等。细胞内的荧光测量在刺激的生理机制的基础研究中非常有用，例如，对于钙动员和膜去极化。然而，在体内稳态的细胞反应下，这些细胞内的刺激信号变得短暂。因此，它们被认为与记录在MA测试中的持续累积的细胞外酸化相比，较不适合PBL刺激的灵敏监测。这种细胞外监测可以通过将测比分子光学探针附接到纳米颗粒来更好地帮助。细胞外监测是生物相容的，将细胞内的探针测量共有的负面影响最小化，指向细胞外的方法的优点不仅用于基础研究，而且用于不同的细胞类型中的各种临床应用。
[0147]酸化分布由H2O-H+等价物的分泌速率来呈现，单位为皮摩尔/ μ I/小时/2500细胞(参见图6-8、13)。
[0148]以上酸化分布中的任一个可被用作细胞的代谢活性的指示剂。可替换地，所测量的分布中只有一个指示细胞的代谢活性。
[0149]如所提到的，可以在暴露于不同浓度的刺激物或抑制物的原初细胞或活化/效应子细胞中测量细胞的代谢活性。
[0150]如本文所使用的“刺激物”或“抑制物”是指增加、降低或改变响应于其的细胞的代谢途径的实体。
[0151]例如，如果细胞是淋巴细胞，那么刺激物是被TCR或BCR识别并导致克隆扩增或抗体产生的抗原。具体的刺激物或抑制物列于下表I中。
[0152]表I
[0153]
【权利要求】
1.一种测量细胞的代谢活性(MA)的方法，所述方法包括独立地测量所述细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布: (i)非挥发性可溶代谢产物； (ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及 (iii)挥发性可溶代谢产物； 其中，所述时间相关的酸化分布中的至少一个指示所述细胞的代谢活性。
2.一种在有此需要的受试者中诊断与改变的代谢活性相关的疾病的方法，所述方法包括: (a)提供包括细胞的所述受试者的生物样品； (b)独立地测量所述细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布: (i)非挥发性可溶代谢产物； (ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及 (iii)挥发性可溶代谢产物； 其中，所述时间相关的酸化分布中的至少一个指示所述细胞的代谢活性，并且其中与在相同条件下检测的正常的未受影响的细胞样品的代谢活性相比，所述代谢活性的转变指示与改变的代谢活性相关的疾病。`
3.一种优化疾病治疗的方法，所述方法包括: (a)使包括细胞的受试者的生物样品与至少一种药剂接触； (b)独立地测量所述细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布: (i)非挥发性可溶代谢产物； (ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及 (iii)挥发性可溶代谢产物； 其中，所述时间相关的酸化分布中的至少一个指示所述细胞的代谢活性，并且其中所述细胞的所述代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示用于所述疾病的有效药剂。
4.一种在受试者中监测疾病治疗的方法，所述方法包括: Ca)对所述受试者施用至少一种针对所述疾病的药剂； (b)在所述施用之后，取回包括所述受试者的细胞的生物样品； (C)独立地测量所述细胞的细胞外环境中由以下的分泌导致的时间相关的酸化分布: (i)非挥发性可溶代谢产物； (ii)非挥发性可溶代谢产物和挥发性可溶代谢产物；以及 (iii)挥发性可溶代谢产物； 其中，所述时间相关的酸化分布中的至少一个指示所述细胞的代谢活性，并且其中所述细胞的所述代谢活性朝向在相同条件下检测的正常的健康的细胞样品的代谢活性的转变指示所述疾病的有效治疗。
5.一种在有此需要的受试者中的疾病治疗的方法，所述方法包括: Ca)根据权利要求2所述的方法诊断所述受试者中的所述疾病的存在； (b)根据所述诊断对所述受试者进行治疗。
6.一种鉴定能够改变细胞的代谢活性的试剂的方法，所述方法包括:(a)使细胞经受试剂； (b)根据权利要求1所述的方法在(a)之后并任选地在(a)之前测量所述细胞的代谢活性，其中所述酸化分布的转变指示能够改变细胞的代谢活性的试剂。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述测量(i)的酸化分布在暴露于空气的腔室中实现。
8.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述测量(ii)的酸化分布在气密性的腔室中实现。
9.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述细胞外环境包括具有校准的缓冲能力的限定的溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水。
11.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述细胞包括白细胞。
12.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述细胞包括癌细胞。
13.根据权利要求2-5所述的方法，其中，所述疾病包括癌症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述生物样品包括血液样品。
15.根据权利要求2-5所述的方法，其中，所述疾病选自由以下组成的组:癌症、病原感染和自身免疫疾病。
16.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述测量使用选自由以下组成的组的无毒膜不透性探针来实现:pH探针、CO2`探针和NH3探针以及乳酸盐探针。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述pH探针包括测比pH探针。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述pH探针包括HPTS。
19.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述非挥发性代谢物包括乳酸盐。
20.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述挥发性代谢物包括NH3和C02。
21.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述测量酸化分布在恒温下实现。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述恒温包括37°C。
23.根据权利要求1-6所述的方法，还包括在测量所述酸化分布之前或者同时使所述细胞经受刺激物或抑制物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述刺激物或抑制物包括细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述刺激物或抑制物包括无细胞抗原。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述刺激性细胞包括淋巴细胞且所述细胞包括关于所述淋巴细胞的非同系淋巴细胞。
27.根据权利要求1-26所述的方法，其中，所述测量酸化分布在商业荧光多孔板扫描仪中实现。
28.根据权利要求1-27所述的方法，其中，对所述代谢活性的代谢活性测量值进行至少两个决策树模型。
29.根据权利要求1-27所述的方法，其中，所述代谢活性的代谢活性测量值、MA测试背景测量值的信噪过滤通过k-均值聚类分析来进行。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述决策树模型选自以下的组:C5、C&RTree和 CHAID。
31.根据权利要求1-27所述的方法，还包括将所述细胞与所述细胞外环境分离。
32.根据权利要求30所述的方`法，其中，所述分离是在离心作用下通过ficoll分离。
【文档编号】G01N33/50GK103518133SQ201280022396
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年4月4日 优先权日:2011年4月6日
【发明者】鲁文·蒂洛希, 费尔南多·帕托尔斯基, 哈吉特·佩雷茨-索罗卡 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司