吸收光谱扫描流动血细胞计数的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。该系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供用于照明流动流的区域的空间分布的、连续的颜色光谱激发光系统。穿过探测区域的粒子横穿激发光的全色散光谱，并且在粒子穿过探测区域时连续地测量来自粒子的荧光发射。所测量的在激发光的每个波长下的荧光发射提供了粒子的激发光谱，该激发光在粒子穿过探测区域时改变通过激发光的全光谱。
【专利说明】吸收光谱扫描流动血细胞计数
【技术领域】
[0001]本发明涉及流体流中的荧光粒子的光学分析的领域。
【背景技术】
[0002]流动式粒子分析仪(诸如流动血细胞计数器)是公知的分析工具，其能够基于诸如光散射和荧光的光学参数来表征粒子。在流动血细胞计数器中，例如，流体悬浮液中的粒子(诸如分子(molecule)、与分析物结合的珠子或个体细胞)通过探测区域，在该探测区域中，粒子暴露到通常来自于一个或多个激光器的激发光，并且粒子的光散射和荧光特性被测量。其粒子或成分通常由荧光染料标记，以有助于探测，并且可以通过使用光谱有区别的荧光染料来标记不同粒子或成分，以同时探测多种不同粒子或成分。通常，有多种光电探测器，每一个光电探测器用于被测量的每个散射参数，并且每一个光电探测器用于被探测的每个有区别的染料。所获得的数据包括对于光散射参数和荧光发射中每一个测量的信号。
[0003]血细胞计数器还包括用于记录所测量的数据和分析数据的装置。例如，通常，数据存储和分析是使用连接到探测电子装置的计算机来进行的。数据通常被以表格形式存储，其中每一行对应于每个粒子的数据，并且列对应于每个所测量的参数。用来存储来自于流动血细胞计数器的数据的标准文件格式(例如“FCS”文件格式)的使用有助于使用独立的程序和机器来分析数据。使用当前的分析方法，为了易于可视化，数据通常被显示为2维(2D)图表，但是其他方法可以被用来将多维数据可视化。
[0004]使用流动血细胞计数器测量的参数通常包括由粒子沿着几乎向前的方向散射的激发光(被称作为前向散射(FSC))，由粒子沿着几乎侧向散射的激发光(被称作为侧向散射(SSC))以及从荧光粒子以光谱的一个或多个通道(频率范围)发射的光(被称作为FL1、FL2等)或者由主要在该通道探测的荧光染料发射的光。不同的细胞类型可以由由于利用染料标记的抗体对各种细胞蛋白质标记而产生的散射参数以及荧光发射来识别。
[0005]流动血细胞计数器可以从例如BD Biosciences (San Jose, CA)买到。流动血细胞计数器在本领域中在各种文献中充分描述，例如包括:Landy等人合编，ClinicalFlow Cytometry, Annals of the New York Academy of Sciences Volume677 (1993)；Bauer 等人合 编，Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,ffilliams&ffilkins (1993) ;0rmerod编写，Flow Cytometry: A Practical Approach, OxfordUniv.Press(1997) ；Jaroszeski 等人合编，Flow Cytometry Protocols, Methods inMolecular Biology N0.91, Humana Press(1997)； 以 及 Shapiro, Practical FlowCytometry第四版,Wiley-Liss (2003);通过引用将它们全部结合在这里。通过由多颜色流动血细胞计数器进行的细胞(或其他粒子)的分析获得的数据是多维度的，其中每个细胞对应于由所测量的参数限定的多维空间中的点。细胞或粒子的布居(population)被识别为数据空间中的点的簇。因此，布居和簇的识别可以通过绕显示在数据的一个或多个2维图(被称作为“散射图”或“点图”)绘出门限(gate )来手动地进行。可选择地，簇可以被识别，并且限定布局的限制的门限可以被自动地确定。用于自动化门限的大量方法已经在文献中描述了。例如参见美国专利号 4，845，653,5, 627，040,5, 739，000,5, 795，727,5, 962，238、6，014，904,6, 944，338，通过引用将他们全部结合在这里。
[0006]在典型的基于激光器的流动血细胞计数器中，可用的激发波长受到合适的激光器的可用性的限制。波长可选择的单波长激发源已经被描述为用于流动血细胞计数器。例如，美国专利N0.4，609，286 (Sage)描述了流动血细胞计数器，其使用色散棱镜来从用作激发源的光谱丰富光源选择波长。光源由棱镜色散，使得波长可以使用狭缝来选择，以允许基本单波长的光通过，并阻挡全部其他波长。期望的波长可以通过将狭缝物理地移动到光谱中的期望波长来选择。
[0007]Telford等人在2009年于Cytometry A75 (5):450-459描述了使用超连续谱白色激光作为流动血细胞计数器的激发源。超连续谱白色激光器在从近紫外到红外的宽波段范围内连续地发射，由此对于人眼看起来是白色的。Telford等人描述了将声光滤波器或有涂层的带通滤波器插入到光束的前方，以隔离具体波长范围，从而允许用户从超连续谱选择感兴趣的带宽。所得到的激发源可以被用来通过使用具有期望颜色透射要求的滤波器选择任何单激发波长和带宽。
[0008]在典型流动血细胞计数器中，荧光发射被在多个探测通道(每个探测通道被限定为光谱内的频率范围)中测量，其中，每个通道中的发射被使用单个光电探测器测量。因此，每个探测器提供频率的范围的单个测量结果。典型地，探测器通道被选择为使得每个通道被优化，以从不同染料之一探测发射。可选地，发射光可以使用探测通道的阵列来测量，使得每个染料发射被在一个以上通道中测量。
[0009]Robinson 等人在由 Tuan Vo-Dinh 等人编辑的 Advanced Biomedical andClinical Diagnostic Systems III, Proc.0f SPIE Vol.5692(SPIE, Bellingham, WA, 2005):3579-365中描述了一种流动血细胞计数器探测系统，其中发射的光由衍射光栅色散到32通道PMT探测器上。因此，荧光发射可以在32个窄的、相邻的探测通道中测量，这些探测通道一同跨越光谱区域。代替对于每个染料的单个荧光强度值，使用该系统获得的数据对于每个染料包括对于多个相邻探测通道的强度值。从多个光谱相邻的探测通道获得的测量结果的集合取决于染料的发射光谱。
【发明内容】
[0010]本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。
[0011]本发明的系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供空间分布的、连续的颜色光谱激发系统，其被用于照明流动流的区域。激发光的光谱沿着流动流的长度展开，使得光谱展开到比待检测的粒子的直径大得多的区域。流动通过探测区域的粒子将会在任何一点仅由小的波长范围激发，但是在其横穿整个探测区域时将会暴露到激发光的全部光谱。随着荧光粒子行进通过激发束并且由此通过连续地改变激发光的波长而受到激发，探测器测量来自于粒子的荧光发射，该荧光发射按照在每个波长的激发效率来改变强度。其结果是扫描粒子的激发光谱。
[0012]激发光谱的空间扩展(展开)是通过使光穿过诸如棱镜或衍射光栅的颜色分离光学器件(例如色散元件)来实现的。颜色分离光学器件被确定方向，使得光谱沿着流动路径展开，从而覆盖纵向探测区域。在流中流动的粒子将会随着其穿过探测区域而暴露到连续地改变波长的光。
[0013]一般来说，光谱可以沿着流动路径展开，使得移动粒子将会从短波长到长波长或者从长波长到短波长扫描(sweep)激发光谱。优选地，光谱沿着流动路径展开，使得移动粒子将会从短波长到长波长扫描激发光谱。
[0014]在一个实施例中，单个宽波段探测器被用于测量来自于在粒子穿过探测区域时由连续光谱激发束激发的粒子的发射。因此，粒子发射可以在粒子由激发光的全光谱顺序地激发时被连续地测量。由单探测器探测的波长的范围优选地被选择为在荧光粒子发射的范围内，但是在激发光谱之外。优选地，探测器被构造为使用合适的长通滤波器测量比最长激发波长更长的全部波长。
[0015]在另一个实施例中，激发光源引起连续可变的、波长可选择的带通滤波器(可调谐滤波器)，其定位在白光激光器激发光源和颜色分离光学器件之间。滤光器允许从由白光激光器提供的颜色的范围选择任何基本单颜色(波长的窄波段)的激发束。该基本单颜色的激发束将会照明探测区域内的单个点。因为光谱由颜色分离光学器件展开到探测区域并且色散的角度取决于光的颜色，所以由滤波器选择的激发光的颜色的改变也导致探测区域内的照明点的位置的改变。
[0016]连续可变的、可选择波长的带通滤波器被构造为将激发光的波长从光谱的一端连续地改变到另一端，这也导致照明点从探测区域的一端扫到另一端。滤波器的改变速率也被计时，使得照明点以与粒子在流动流中的速率相同的速率穿过探测区域。通过在粒子进入探测区域时开始光谱扫描，粒子将会在其穿过探测区域的同时保持被照射，然而是被以激发光谱的连续改变的颜色照射。
[0017]连续改变的光谱扫描被与粒子流动对准，并且使得能够使用粒子运动扫描通过光谱，但是将激发光限制到粒子，并且可能限制到受限的围绕区域。这将可能导致探测通道中的信号噪声的杂散激发光的量最小化。
[0018]在另一个实施例中，多个宽波段探测器被用来测量在粒子穿过探测区域时从由连续光谱激发束激发的粒子的发射。每个探测通道(由探测器测量的频率范围)被选择为使得每个通道在激发光谱的至少一部分之外，使得连续的探测通道交错，每个通道以更长的波长开始并且激发光的光谱有少许重叠。
[0019]使用交错探测通道的实施例优选地与经可调谐地过滤的激发光一起使得能够在于激发光的光谱的一部分重叠的波长中探测粒子发射。随着粒子移动通过探测区域并且由逐渐更长的波长照射，测量波长比激发光的波长更长的测量光的探测通道可以被用来探测粒子发射。当激发光波长在扫描期间变长，使得其余探测通道重叠时，由于由激发光引起的干涉，探测通道对于测量发射不再有用。此时，由一个或多个剩余探测通道探测发射。类似地，当激发光波长在扫描期间变长，使得其与第二探测通道重叠时，由于由激发光引起的干涉，该探测通道对于测量发射不再有用，并且发射由一个或多个剩余探测通道探测。最终探测通道优选地使用长通滤波器测量比最长激发波长更长的全部波长。
[0020]在另一个实施例中，多个带通滤波器被用来测量来自于在粒子穿过探测区域时由连续光谱激发束激发的粒子的发射。每个探测通道(由探测器测量的频率范围)被选择为使得探测通道不重叠。优选地，每个探测通道将会大致对应于被用于标记粒子的荧光染料的激发光谱极值，使得每个探测通道主要测量来自于一个染料的发射。这使得能够相对独立地测量用于标记多个被标记粒子的每种染料的激发光谱。
[0021]在另一个方面，本发明提供了使用本发明的仪器分析荧光粒子的方法。
[0022]本发明和仪器可以被用来分析由一个或多个染料标记的粒子。对于被单染料染色的粒子，例如通过将所测量的激发光谱与在先测量的来自于用于试验的染料的激发光谱匹配，可以从激发光谱模式识别染料。对于被多种染料染色的粒子，例如通过将所测量的激发光谱与在先测量的激发光谱的组合匹配，可以从激发光谱模式识别染料。各种已知的“拟合优度”算法适合于将所测量的光谱与已知光谱的组合匹配。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1A、图1B和图1C描绘了本发明的流动式粒子分析仪的实施例的光学系统的元件的示意性表示。
[0024]图2A、图2B和图2C描绘了荧光粒子穿过流动通道以及照明粒子的激发光。
[0025]图3A、图3B和图3C描绘了本发明的流动式粒子分析仪的另一个实施例的光学系统的元件的示意性表示。
[0026]图4A、图4B、图4C和图4D描绘了荧光粒子穿过流动通道以及照明粒子的激发光。
[0027]图5描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的探测通道之间的关系。
[0028]图6描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的两个重叠(交错)的探测通道之间的关系。
[0029]图7描绘了荧光粒子的激发和发射光谱、用于激发粒子的激发光源的光谱以及用于探测粒子发射的两个不重叠的探测通道之间的关系，其中每个探测通道被选择来近似地对应于不同染料的激发极值(maxima)。
【具体实施方式】
[0030]为了清楚提供以下的定义。除非特殊指明，全部的术语按照本领域中常用的那样使用。这里上文和下文引用的全部相关文件通过引用结合到这里。
[0031]“流动式粒子分析仪”被用在这里指示通过将粒子穿过一个或多个光学探测器来分析悬浮在流动流体流中的粒子的任何仪器，并且例如包括分析或分类流动血细胞计数器、血液学分析仪和细胞计数器。包括粒子的流体流(流动流)通常穿过光学小管(cuvette)中的通道，在其中执行光学分析，但是光学分析可以对于从喷嘴喷射的空气中的流体流进行。小管和通道的至少一部分(优选地全部)是光学透明的，以使得能够进行流体流内的粒子的光学探测。例如，在典型流动血细胞计数器中，光学探测是通过使用来自小管外侧的激发光激发荧光地标记的粒子来进行的，并且来自粒子的荧光发射是使用定位在小管外侧的光电探测器检测的。小管的光学透明的部分可以由任何合适的材料制成，包括熔融硅、石英、光学玻璃或光学梯度塑料。
[0032]如这里所使用的，“系统”和“仪器”意图包括硬件(例如，机械和电子器件)和相关软件(例如，计算机程序)组件。
[0033]如这里所使用的，光电探测器广义地表示光电探测器本身以及任何相关的光学和/或电子器件。例如，信号放大(光电探测器增益)可以由光电探测器单独提供或者由放大光电探测器的输出的分离信号放大器提供。由光电探测器测量的光可以通过使用滤波器、反射镜、透镜或其他光学器件来限制。由于这个原因，“光电探测器”被用在这里单独指示光电探测器或者指示伴随一个或多个信号放大器和光学器件的光电探测器，如果存在的话。
[0034]“探测器通道”、“探测通道”或“通道”指的是由特定光电探测器检测的波长的范围。所探测的波长的范围通常使用频率相关滤波器和/或分光反射镜来确定，如本领域中已知的。为了清楚，术语“通道”在这里的使用与流动血细胞计数器领域中的次级使用不同，以表示可以由单个探测器探测的强度值的范围的离散细分。
[0035]在一些实施例中，使用单个探测器通道，其中，探测器通道由带通滤波器或由长通滤波器限定，其中带通滤波器传输两个阈值波长之间的波长的光，并且长通滤波器仅传输比某阈值波长更长的波长的光。
[0036]在其他实施例中，由长通滤波器限定的多个探测器通道被使用，其中每个长通滤波器传输比不同阈值波长更长的波长的光，使得探测器通道部分重叠。
[0037]在其他实施例中，由带通滤波器限定的多个不重叠探测器通道被使用，以有助于多个光谱不同的荧光染料的独立测量。染料和探测器通道被选择，使得每个染料的发射极值尽可能地在不同的探测器通道内，即，使得每个染料与被优化来探测来自该染料的光的探测器通道匹配。然而，由于其发射光谱的宽度，来自于给定染料的光可能在一个或多个其他探测器通道中发射。在除了最接近地匹配染料的发射极值的探测器通道之外的探测器通道内由染料发射的光在这里被称作为“溢出(spillover)”。最接近地匹配染料的发射极值的探测器通道在这里参照给定染料被称作为染料探测通道或主要通道。全部的其他探测器通道参照给定染料被称作为溢出通道或次级通道。染料及其染料探测通道将会被称作为“相应的”或“匹配的”。参照探测通道，对应于探测通道的染料被称作为主要染料；向探测通道内发射溢出的其他燃料被称作为次级染料。
[0038]如这里所使用的，术语“粒子”指的是合成粒子(诸如微粒子或珠子)以及从生物源得到的粒子(诸如真核细胞、细菌、病毒或高分子)二者。如这里所使用的，粒子的“布居”指的是相对于待测量的参数表现出基本相同的光学特性的粒子的组，诸如相同类型的细胞(细胞布居)或者在实际制造公差内具有相同尺寸、形状和成分的合成珠子。
[0039]荧光粒子在这里被用于表现出可检测的荧光的任何粒子。粒子可以是固有的荧光的，或者可以包括一个或多个荧光染料。例如，细胞通常使用结合到细胞子部分的染料-抗体结合物(conjugate)由一个或多个荧光染料标记，以能够进行检测和分析，并且被标记的细胞是突光粒子的示例。
[0040]这里使用的术语“MFI”表示荧光粒子的布局的平均或中值荧光强度。将会理解可以使用布居荧光的其他统计测量结果，诸如截断的平均荧光或截断的中值荧光。
[0041]光谱指的是在白光(或宽光谱光源)的光束诸如通过穿过棱镜而被散射时形成的颜色的连续波，因此其成分波长按照顺序排列。参照这里使用的宽光谱或白光激发源，诸如该光激光器，光谱指的是由激发源发射的波长(颜色)的连续光谱。如这里使用的“激发源”指的是发光组件(诸如激光器)以及任何相关光束成形或滤波组件(如果存在的话)。由激发源发射的波长的范围整体可以被相对于由发光组件单独发射的波长的范围调整或限制。例如，由白光激光器发射的光谱可以被以未经调整的形式使用，或者该光谱可以由适当的滤波来限制，以提供在期望波长范围的光谱。[0042]以下提供了在可见光谱内波长和颜色的大致对应关系的表格。
[0043]颜色/波长的表格
[0044]
【权利要求】
1.一种用于测量流体流中的荧光粒子的激发光谱的流动式粒子分析仪，包括: a)发射准直的宽光谱激发光束的激发光源， b)将激发光束聚焦并引导到所述流体流中的探测区域上的激发光学器件，其中所述激发光学器件包括使激发光束的光谱色散的色散元件，并且其中所述色散元件被确定朝向以使得光谱色散在小管通道的探测区域上，使得穿过所述小管通道的粒子将会横穿激发光束的色散光谱；以及 c)测量从探测区域中的粒子发射的光的探测光学器件。
2.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，还包括光学小管，其具有延伸通过所述小管的小管通道，其中所述流体流穿过所述小管通道，并且其中流体流中的所述探测区域在所述小管通道中。
3.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源包括白光激光器。
4.根据权利要求3所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源还包括限制由白光激光器发射的波长的范围的滤波元件。
5.根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括光电探测器，其构造为测量比被引导到探测区域上的激发光的光谱中的波长更长的波长的范围。
6.一种用于测量流体流中的荧光粒子的激发光谱的流动式粒子分析仪，所述分析仪包括: a)发射准直的宽光 谱激发光束的激发光源， b)将激发光束聚焦并引导到所述流体流中的探测区域的激发光学器件，其中所述激发光学器件包括使激发光束的光谱色散的色散元件，并且其中所述色散元件被确定朝向以使得光谱色散在小管通道的探测区域上，使得穿过所述小管通道的粒子将会横穿激发光束的色散光谱； c)测量从探测区域中的粒子发射的光的探测光学器件； d)发射在探测区域的上游与流动流交叉的第二束的第二激发源； e)测量从所述束和所述流动流的交叉部发射的光的第二探测光学器件，其被构造为基于所发射的光来探测粒子并且在探测到粒子时提供触发信号； f)定位在激发光源与色散元件之间的激发光束中的可调谐滤波器，其被构造为允许选择穿过该滤波器的波长的窄带，其中该选择是在控制信号的控制下进行的； g)控制器，其被构造为接收所述触发信号并且将控制信号提供给所述可调谐滤波器，使得在粒子穿过所述探测区域时所选择的穿过该滤波器的波长的窄带在激发光源的光谱之中改变。
7.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中所述激发光源包括白光激光器。
8.根据权利要求7所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源还包括限制由白光激光器发射的波长的范围的滤波元件。
9.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括滤波器，其排除波长与在被引导到探测区域上的激发光的光谱中提供的波长的范围重叠的光。
10.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括多个光电探测器，每个光电探测器都包括滤波器，所述滤波器排除波长与在被引导到探测区域上的激发光的光谱中提供的波长的范围重叠的光。
11.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括多个光电探测器，每个光电探测器被构造为测量比被引导到探测区域上的激发光的光谱中的波长的至少一部分更长的波长的范围。
12.根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括多个光电探测器，每个光电探测器被构造为测量由带通滤波器限定的波长的范围，其中由所述多个光电探测器测量 的波长的范围不重叠。
【文档编号】G01N15/00GK103608664SQ201280031089
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年6月24日
【发明者】P·O·诺顿, 陈永琴 申请人:贝克顿·迪金森公司