用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法、用于从一群分析物中选择分析物的方法 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于测定分析物与配体的固有结合参数例如KD、kd和ka的方法，所述分析物与配体例如药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原，其中最大结合应答Rmax或RL和至少一个结合参数在传感器载体上存在的至少两个不同配体表面密度下进行测定，并且将结合参数的值外推至特征在于Rmax=0或RL=0的配体密度=0，涉及选择分析物和/或配体的方法，以及所选择的配体、分析物和传感器。
【专利说明】用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法、用于从一群分析物中选择分析物的方法、所选择的配体或分析物及传感器
[0001]本发明涉及用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法、用于从一群分析物中选择分析物的方法、所选择的分析物或配体及用于这些方法的传感器。
[0002]在药物开发及其用于治疗和预防的用途中，了解分析物与配体的固有结合参数是重要的。在这方面，分析物和配体可以包含药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原。显而易见的是，依赖于预期用途，配体和分析物可以是可互换的，例如作为配体的抗体与作为分析物的抗原的结合。类似地，配体可以与传感器载体结合，并且配体存在于待与固定的分析物接触的溶液中。但通过定义，固定至载体(所述载体在这种情况下是传感器载体)的分子被称为配体，并且溶液中的分子被称为分析物并待与配体接触，以便结合且从而测定结合参数，例如亲和和解离常数、平衡解离常数(KD)、平衡结合常数(KA=1/KD)、解离速率常数(kd)和结合速率常数(ka)。[0003]结合参数例如此类相互作用对的亲和常数可以通过多种常规技术例如等温量热法、荧光各向异性等进行测定。目前优选的是无需标记配体或分析物而使用的测定技术。随后例如通过表面等离振子共振，在传感器载体的传感器表面上测量在配体和分析物两者之间的生物学相互作用。
[0004]分析物与配体的结合导致在生物传感器的响应中的可测量变化，其根据时间进行记录。这个记录导致所谓的传感图。
[0005]分析物转运至传感器表面用于与固定的配体结合包括与配体结合和从配体释放分析物的动力学。这个动力学结合和释放依赖于分析物在传感器表面上的流速，并且特别依赖于配体表面密度。此外,必须记住生物分子例如免疫球蛋白(Ig)包含分析物的两个或更多个结合侧面，从而使得在一方面配体和另一方面分析物两者之间不存在1:1相互作用。
[0006]结合参数例如关于特定配体的亲和常数通过给定表面密度可接受地测定，配体随后以所述给定表面密度暴露于两个或更多个分析物浓度。对所得到的传感图实施拟合程序，导致结合参数以及Rmax的测定，所述Rmax代表分析物与传感器表面上的所有可用配体的结合。
[0007]这种测定结合参数的方法具有若干缺点。一个缺点是再结合。当分析物与配体结合时，发现特定Rmax。分析物随后可以释放且其后可以与另一个配体分子再结合。然而，在这个结合、释放和再结合过程中，分析物不离开用于由生物传感器测量的消逝场(evanescentfield)或窗口。相应地，无法测量分析物的释放。这意味着解离速率将测量为太低，这可以导致与实际固有解离平衡常数(和解离速率)的差异。
[0008]另一个缺点是1:1相互作用(如上所示)不一定存在。如果分析物或配体包含两个结合侧面(具有相等或不同的结合强度)，则结果是所谓的双相表现。进一步地，将发生经由两个结合侧面的结合，并且随后当更多分析物分子被结合或捕获时，结合侧面之一(结合强度更小的侧面)将被释放，并且结合进一步的分析物分子。这个问题对于抗体和抗原是特别相关的。
[0009]另外，当分析物分子在所谓的停滞层中扩散时，发生称为大量转运限制的物理速率测定过程，这影响分析物与传感器表面上固定的配体的结合的结合速率常数。在层流条件下注入分析物的过程中，分析物在这个非搅拌的停滞层中扩散并且将由表面捕获。当分析物浓度相对低且传感器的容量很高时，动力学过程是有限的扩散或有限的大量转运。这导致起始线性结合过程(δ折射单位(RU)/秒)，其依赖于分析物的浓度、温度和决定停滞层厚度的流动条件。当配体密度更低时，大量转运(mass transport)限制效应更小。
[0010]相应地，在计算生物分子相互作用的速率和亲和常数中可能存在问题。众所周知如果在传感器载体的传感器芯片表面上发生固定/捕获分子的再结合效应、双相行为、大量转运限制和/或立体阻碍，则表观速率和亲和常数kd、ka和Kd将显著改变。
[0011]本发明的目的是避免这些问题，并且从而使得测定分析物与配体的固有结合参数可行。这意味着测定的结合参数不再依赖于目前使用的测定方法的缺陷，并且特别是不依赖于在其下执行测定的条件(例如配体密度、分析物浓度以及在配体和分析物两者之间的相互作用类型)。
[0012]本发明的方法应用多个配体表面密度的阵列，并且使分析物暴露于阵列，导致通过将关于待测量的结合参数的值例如表观kd和Kd值外推至Rmax=O或RfO的单一速率和亲和常数。理论上，这意味着单一配体分子与其单一分析物分子的亲和常数在极限为零的响应中测定。
[0013]根据本发明提供的是用于测定分析物与配体(例如药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原)的固有结合参数例如KD、kd和ka的方法，其中最大结合应答Rniax和至少一个结合参数以传感器载体上存在的至少两个不同配体表面密度进行测定，并且将结合参数的值外推至Rmax=O或Rl=O0
[0014]Rniax值反映与配体密度成比例的分析物结合容量。如果配体无法直接固定或是不纯的，则使抗配体配体偶联至传感器载体，并且通过抗配体捕获配体。随后应测量两步相互作用过程；首先捕获目的配体，随后为分析物与所捕获配体的结合。在这种情况下，配体密度被测量为称为&的捕获值，并且可以执行至配体密度接近于零的外推。&值还可以测定，如果配体的固定水平是由配体与传感器表面的结合程度得知的。换言之，生物分子相互作用速率和平衡参数可以通过外推至计算的Rmax=O或测量的R^O (以捕获或直接方式)或两者进行计算。
[0015]本发明基于下述了解:当测量分析物与以渐减表面密度存在于传感器载体的测量表面上的配体的结合时，与再结合、大量转运限制和/或双相行为有关的问题得到校正或避免，并且测定明显更接近在配体和分析物两者之间的1:1相互作用条件。
[0016]使用可接受的外推法，特征在于Rmax=O或RfO值的接近于零的配体密度可以由多个传感图测定，并且导致对于特定配体/分析物组合特有的固有结合参数。在极限为零的条件RfO或Rniax=O中的这个配体密度时，分析物与传感器载体的表面上的一个配体结合，并且基本上回避其他配体和/或分析物分子。相应地，本发明提供了用于用于测定分析物与配体(例如药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原)的固有结合参数例如KD、kd和ka的方法，其中最大结合应答Rmax和至少一个结合参数以至少两个不同的配体浓度进行测定，并且将结合参数的值外推至Rmax=O或R1=O。[0017]应当指出通过定义配体与传感器载体的测量表面结合，而分析物以不同浓度提供用于与固定配体结合。相应地，配体可以是抗体或抗原，并且依次地分析物则分别是抗原和抗体。这同样适用于配体是药物、蛋白质或受体。&是配体捕获的应答，并且对应于分析物结合位点数目/点。数据点用指数方程y=a ebx拟合。通过将R^X外推至0，可以测定接近于单一分析物分子与单一配体分子相互作用的速率常数kdK°、kaE0和解离平衡常数Kd'代替使用&值，由分析物应答计算的Rmax可以用于将kd和Kd值外推至零应答。Rmax值是当所有配体分子都由分析物分子饱和时的理论应答值。计算的Rmax和&的比值是恒定的，并且与分子量成比例:Mw^_/Mws#:=Rmax/RL。交叉检查可以通过比较对于将Rl或Rmax外推至零计算的R_和实验测定的&的比值进行。理论上，对于将&或Rmax外推至零的值应是相等的。
[0018]明显地，当对分析物实施超过两个不同的配体浓度或表面密度时，用于测定固有结合参数的方法更可靠。优选地，使用3-10和更实际的3-6个不同的配体浓度或表面密度。
[0019]当通过两个不同的配体表面密度或配体的系列表面稀释度来测定结合参数时，在Rl=O或Rmax=O时的结合参数可以通过外推进行测定。然而，已发现指数拟合是有利地优选的，因为指数拟合更好地考虑到较低&或Rmax值的影响。 [0020]如上文所示，优选结合参数使用1:1相互作用模型进行测定。这个模型不仅是相对直截了当的，而且在RfO或Rmax=O时的结合参数测定也基于在配体和分析物两者之间的1:1相互作用。
[0021]在许多情况下，如果配体无法直接固定或是不纯的，则使抗配体配体偶联至传感器载体，并且通过抗配体捕获配体。信号&可以用于外推。
[0022]抗配体的例子包括但不限于链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、抗IgG等。当配体是所谓的标签时，则抗配体是抗标签，例如针对标签的抗标签，包括但不限于his标签、FLAG标签、CBP标签、MBP标签、GST标签、HA标签、myc标签、isopep标签、BCCP、f丐调蛋白标签、nus标签、绿色灭光蛋白标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Sof标签、SBP标签、Ty标签、DNA标签等。
[0023]对于测定，使用标记和非标记分析物(例如生物素化和非生物素化)的混合物可以是有利的。不同类型的分析物可以顺次使用或作为混合物在结合实验中使用。
[0024]如果测定将在含水介质中执行和/或传感器载体具有非最适性质，则使中间层例如亲水层附着至传感器载体，并且使配体与传感器载体直接结合或者经由中间(亲水)层例如水凝胶基质或扁平单层(planair monolayer)或薄层与传感器载体间接结合可以是有利的。首先使抗配体与传感器载体或中间层例如水凝胶基质共价结合可以是优选的，所述抗配体随后可以在测定已执行前捕获配体。为了捕获配体密度系列，抗配体可以以抗配体密度系列稀释度固定。以另一种方式，抗配体可以作为均质捕获表面偶联，并且配体可以在梯度密度系列中捕获。通过例如链霉抗生物素蛋白或经由标签的此类亲和捕获是充分公认的用于使配体与固体载体结合的方法。
[0025]根据优选实施方案的是配体在具有此类厚度的表面层中分布，从而使得导致对于抗体优选在50-500RU范围中的5-3000RU (折射单位)的Rl值。对于具有~150kD的分子量的抗体，这分别对应于5pg/mm2-3ng/mm2和50_500pg/mm2的配体表面密度。因而形成其中配体均质或非均质分布的3维层。这将获得更大的结合容量/表面区域。[0026]根据优选实施方案，使分析物浓度同时暴露于不同的配体表面密度或浓度，并且对于每个配体表面密度或浓度生成传感图。相应地，能够使用多个分析物浓度的更少注入以更高速度和以更可靠方式执行测定。
[0027]不同配体表面密度可以通过各自具有不同配体表面密度的不同表面区域形成。然而，还能够提供具有两个或更多个表面区域的传感器载体，所述表面区域各自包含沿着表面区域的一个或两个方向延伸的配体表面密度中的逐渐和/或逐步变化。明显地，用经由抗配体或抗标签与传感器载体间接结合的配体也将获得相同结果。
[0028]如果使用至少两个不同类型的配体，并且使用在混合物中的两种不同分析物或顺次使用两种不同分析物，则能够同时执行更多配体与分析物的相互作用。在此类情况下，优选外推通过局部或总体拟合优选通过局部拟合来完成。局部拟合意味着由每个传感图测定速率和平衡值，而总体拟合意味着聚合来自若干次分析物注入的传感图并且测定所谓的动力学速率和亲和常数的“总体”值。换言之，当总体拟合使用多个分析物浓度执行时，则可以仅对于Rmax和结合参数计算一个值/配体表面密度或浓度。相应地，使用局部拟合是有利的，因为即使outcast (排斥)也可以容易地甚至自动地被拒绝。此外，为局部拟合提供相当大的测量点集合，这可以导致通过外推更可靠和更容易的Rmax=O测定。
[0029]与总体拟合有关，值得注意的是来自更高分析物浓度的传感器贡献对“总体”值相等贡献，而在外推过程中使用局部拟合参数，更低分析物浓度(更好地接近分析物与配体的单一分子结合)对“真正的”亲和常数贡献更多。
[0030]当生物传感器不仅包含两个不同的配体表面密度或浓度，而且测定也以至少两个分析物浓度执行时，提供了固有结合参数的极佳测定方法。
[0031]当需要测定超过一个固有结合参数例如平衡解离常数和/或解离和结合速率时，可以优选同时测定每个传感图的至少两个结合参数，随后为结合参数的值外推至&或R =0
iVmax w °
[0032]如前所示，任何无标记的相互作用分析技术可以用于根据本发明测定固有结合参数。此类技术包括石英晶体微量天平(QCM)表面声波、干涉量度法例如杨和马赫曾德尔干涉仪(Young and Mach Zehnder interferometer)、双层干涉仪,但优选表面等离振子共振(SPR)。
[0033]本发明的另一个方面涉及用于选择与配体结合的分析物或分析物群的方法，其包括步骤:
[0034]i)根据如权利要求1-9中任一项要求的方法测定分析物或分析物群的固有结合参数；和
[0035]ii)选择具有更佳固有结合参数的一种或多种分析物。
[0036]当已测定多种分析物对于相同配体或多种配体的固有结合参数时，则能够测定对于配体的最佳或最适分析物。这意味着配体或分析物对于抑制生理学状态、病理学状态或疾病将是最佳的。
[0037]本发明的另外一个方面涉及根据这种方法选择且随后对于治疗生理学状态、病理学状态或疾病是最适的分析物(或配体)。
[0038]本发明的最后一个方面涉及适合于在根据本发明用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法中使用的传感器。此类传感器特别预期用于在表面等离振子共振(SPR)中使用。表面等离振子共振适合于检测特定分析物与配体的实时和无标记生物分子相互作用，所述配体固定在具有微芯片形式的传感器上。例如，IBIS-1SPR仪器的成像特征允许同时检测例如数百个例如120个相互作用。
[0039]表面区域可以具有环形、矩形点、斑点等形式，具有10-1000 μ m、优选50-600 μ m、更优选100-300 μ m的尺度。
[0040]配体可以与传感器载体直接结合或者经由抗配体或抗标签与传感器载体结合。优选地，传感器载体包括包含金包衣(厚度10- 100A,例如30-70 如50 和/或钛
或铬包衣(厚度1-5人)的基底表面。这提供了在SPR测量中的最佳测试结果。配体与基
底表面直接结合或者经由抗配体或抗标签或者经由中间层例如具有所需厚度的亲水层与基底表面结合。
[0041]具有所需配体表面密度的表面区域或点可以使用点样仪例如阵列点样仪在阵列中定向。当表面包含以逐渐、逐步或随机次序的多个配体表面密度时，则表面区域可以具有更大的尺寸或非环形或延伸形式。例如，5-1000个点可以通过使用阵列点样仪在阵列中排列。优选地，使用可以点不同阵列的连续流微型点样仪，所述不同阵列例如48个点(6x8阵列)或96个点(8x12阵列)的阵列。
[0042]传感器载体还可以包含参考和空白表面区域或点。这些点可以用于校正、用于补偿非特异性结合。
[0043]根据本发明的方法所提及的及其他的特征和特点将参考下述实施例进一步举例说明和讨论，所述实施例仅给出用于信息目的并且不预期在任何方面限制本发明。在这方面，对附图作出参考，其中:
[0044]图1是其中通过将Kd和kd外推至其中Rmax=O计算的Kd和kd值/RoI针对具有渐减配体密度的Rniax进行标绘的图表；
[0045]图2是其中用Scrubber生成的局部拟合数据的Kd和kd值针对具有渐减配体密度的RoI的Rniax或&进行标绘的图表；
[0046]图3是用于测定和验证LGR5与RSP0-1结合的速率和亲和常数kd、ka和Kd的图表；和
[0047]图4-7示意了 SPR传感器载体的多个实施方案提供不同配体密度。
[0048]实施例1:使用Scrubber总体曲线拟合在Rmax=O时的Kd和kd外推
[0049]执行关于全长抗体赫赛汀的Fab片段的研究，并且通过应用低浓度的分析物和弱点分析在Fab片段和完全IgG分子之间有效存在亲和常数的恒定关系。当存在对于该抗体可用的丰富表位时，双相行为尤其在高配体密度时是显著的。
[0050]使用本发明的方法，测定Kd亲和常数。由于IgG结构包含两个结合臂/位点的性质，存在关于双相效应的潜在危险。危险随着阵列点上的配体密度降低而降低。可用的表位越少，IgG分子的第二个“臂”可以在第一个“臂”解离后结合变得越不可能。另外，当少数表位可用时，则解离分子立即扩散到传感器表面的消逝场外是更可能的。因此所谓的“再结合效应”也降到最低。使用IBIS MX96 (IBIS BV，Enschede，荷兰)允许测量与渐减配体密度/点的阵列的生物分子相互作用。每个点的双相行为和再结合效应将降低，并且每个点的有效亲和常数可以使用每个相互作用曲线的局部拟合分析进行测定。以这种方式，亲和力Kd可以外推至其中仅一个配体分子可用的理论情况，因此“理论上”完全取消双相效应和再结合效应。有效地，测定在最大应答O时的Kd值。
[0051]Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, UTAH, US 的 CFM 阵列打印机用于产生整个点阵列，其中相同配体以系列更低的配体密度。通过使点暴露于系列稀释的(2x)配体浓度生成阵列中至8个点的多个配体密度。通过首先测定在解离相的kd值，随后测定在结合相的ka和Rmax值，对于所有这些ROI计算的局部速率和亲和参数可以用于标绘计算的kd和Kd相对于计算的Rmax。在图1中，使用用于四个ROI的Ab数据集的例子用于将Kd和kd外推MR_0。对于这个外推，使用常规指数拟合算法，因为在更低的配体密度下，更多的统计权重必须给予数据点-这些值理论上更接近于“真正的”或固有结合参数Kd和kd。
[0052]通过将Rmax=X=O输入拟合方程y=aebx，e的指数变成0，因此基数e变成1，仅留下系数a作为在Rmax=O时的Kd和kd值。在这种情况下，在Rmax=O时的Kd可以计算为1.10E-10M，并且在Rmax=O时的kd可以计算为3.34E-05，还参见图1。直接由单个点计算结合参数可以从 KD=30pM 到 IlOpM 不等。
[0053]实施例2:使用Scrubber局部曲线拟合在Rmax=O或Rlj时的Kd和kd外推
[0054]Scrubber2.0[BioLogic Software, Campbell,澳大利亚]的局部拟合选项可以用于通过更多数据点生成曲线拟合，参见图2。使用在段落3.4.3下所述的方法，可以由用Scrubber2.0生成的局部拟合数据计算在Rmax=O时的Kd和kd。在这种情况下,在Rmax=O或Rl=O时的Kd可以计算为7.55E-11M，并且在Rmax=O或Rl=O时的kd可以计算为2.68E-05。
[0055]表1概括了使用不同分析方法对于赫赛汀数据集获得的亲和参数。用针对平均值具有最小残值的IBIS局部方法获得良好校正。
[0056]表3.用于测定赫赛汀数据集的亲和参数的分析方法概括。
[0057]
【权利要求】
1.用于测定分析物与配体的固有结合参数例如KD、kd和ka的方法，所述分析物与配体例如药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原，其中最大结合应答&或1?_和至少一个结合参数以传感器载体上存在的至少两个不同配体表面密度进行测定，并且将所述结合参数的值外推至特征在于R1=O或Rmax=O的配体密度=0。
2.如权利要求1中要求的方法，其中所述结合参数在所述配体的一系列不同配体表面密度下进行测定。
3.如权利要求1或2中要求的方法，其中所述配体分布在对所述分析物可渗透的表面层中。
4.如权利要求1-3中任一项中要求的方法，其中所述配体的抗配体偶联至所述传感器载体，并且所述配体通过所述抗配体捕获。
5.如权利要求1-4中任一项中要求的方法，其中使所述分析物暴露于在单个表面区域和/或不同表面区域上的所述传感器载体上的逐步或逐渐增加的配体表面密度。
6.如权利要求1-5中任一项中要求的方法，其中使分析物浓度同时暴露于所述不同配体表面密度,并且其中对于每个配体浓度生成传感图。
7.如权利要求1-6中任一项中要求的方法，其中使用至少两种配体，并且使用在混合物中的至少两种分析物或顺次使用至 少两种分析物。
8.如权利要求1-7中任一项中要求的方法，其中所述外推通过指数拟合、通过局部或总体拟合优选通过局部拟合完成。
9.如权利要求1-8中任一项中要求的方法，其中所述结合应答通过表面等离振子共振进行测量。
10.用于从一群分析物中选择与配体或配体群结合的分析物的方法，其包括步骤: i)根据如权利要求1-9中任一项要求的方法测定所述分析物或分析物群与所述配体或配体群的固有结合参数；和 ii)选择具有更佳固有结合参数的所述分析物。
11.如权利要求10中要求的方法，其中所述配体和/或分析物是药理学活性药物，优选地所述配体和/或分析物与生理学状态、病理学状态或疾病有关。
12.用于在医学中使用例如用于治疗生理学状态、病理学状态或疾病的，通过根据权利要求10或11的方法选择的配体和/或分析物。
13.包含任选经由抗配体与之附着的至少一种配体的传感器载体的传感器，优选表面等离子体共振传感器，其包含所述配体的一系列不同的配体表面密度，优选在单个表面区域和/或不同表面区域上的所述传感器载体上的逐步或逐渐增加的配体表面密度。
14.如权利要求13中要求的传感器，其中所述配体分布在对所述分析物可渗透的表面层中。
15.根据权利要求13或14的传感器，其中至少两种配体直接或间接附着至所述传感器载体或传感器表面层。
【文档编号】G01N33/543GK103748467SQ201280031506
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年5月11日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】R·B·M·沙斯福特, G·H·M·恩波斯 申请人:Ssens有限责任公司, Ibis技术有限责任公司