石棉检测方法

石棉检测方法
【专利摘要】为了提供一种不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准、且与相差显微镜-电子显微镜法相比可以更有效率地、简便且高精度地检测石棉的方法，使带有荧光标记的石棉结合蛋白与受检物接触，之后将相差显微镜和荧光显微镜组合使用，从而检测受检物中所含的石棉。
【专利说明】石棉检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种石棉检测方法。
【背景技术】
[0002]最近，石棉(纤维状硅酸盐、也称作“石绵”)给人体带来的不良影响正成为问题。即，由企业公布了过去从事石棉的制造或使用业务的人常发生肺癌、间皮瘤等健康损害，据报道，通过吸入石棉粉尘，主要有可能发生石棉肺、肺癌、恶性间皮瘤等健康障碍。
[0003]石棉肺是肺发生纤维化的肺纤维症(尘肺)的疾病之一。引起肺纤维化的原因有其他矿物性粉尘等多种原因，但因暴露于石棉而发生的肺纤维症特别作为石棉肺来区别。石棉纤维导致的肺癌是由摄入到肺泡内的石棉纤维主要通过物理刺激而发生的。致癌性的强度根据石棉的种类而不同，此外还与石棉的粗度、长度有关。恶性间皮瘤是在包围肺的胸膜、或包围肝脏或胃等脏器的腹膜等中发生的恶性肿瘤。
[0004]石棉包括温石棉(白石棉，chrysotile)、青石棉(青石棉，crocidolite)、铁石棉(茶石棉，amosite)、直闪石(anthophyllite)、透闪石(tremolite)、阳起石(actinolite)等。作为石棉的用途，90%以上用于建材，剩下的10%用于化学工厂设备用的密封材料、摩擦材料等工业制品等。需要说明的是，自平成16 (2004)年10月I日起，以石棉为原料的建材、摩擦材料、粘合剂的制造等已被禁止，但由于过去存在着大量使用石棉的原委，因此现实状况是许多建筑物中都留有石棉。
[0005]作为石棉的检测方法，例如，检查大气中的石棉时，用泵吸入大气时将石棉捕集到滤器中，使用丙酮等将该滤器无色化(透明化)，之后使用相差显微镜进行观察，计测大气中的总纤维浓度。总纤维浓度为I根/L以上时，使用电子显微镜判定通过相差显微镜观察到的纤维实际上是否是石棉(参照非专利文献I)。
[0006]但是，使用相差显微镜进行观察时需要熟练的技能，还需要相当的时间，因此难以同时进行多个处理。另外，电子显微镜是非常昂贵的器械，所以并非谁都可以简便地实施。而且，利用电子显微镜进行的判定，不但需要进行样品的繁杂的预处理等，而且还要通过能量分散型X射线分析装置分析由相差显微镜观察到的纤维，是非常需要时间和耐性的作业。
[0007]因此，在现有的使用相差显微镜和电子显微镜的方法(以下，称作“相差显微镜-电子显微镜法”)中，无法快速检测石棉。因此，无法应对需要快速检测的解体现场的石棉风险。在解体现场，快的情况下用2?3天完成解体，因此检查结果出来时，往往是在石棉已经扩散到周围之后。这样，与其说日本的石棉发生源是工场，不如说已经向地点在短期内变动的解体现场转移，因此开发可以快速检测石棉的方法是当务之急。
[0008]然而，本发明人等独立发现了与石棉特异性结合的蛋白(称作“石棉结合蛋白”)，并提倡利用所述蛋白的石棉的生物测定系统(称作“生物荧光法”)(例如参照专利文献I)。生物荧光法是指，通过用荧光物质修饰石棉结合蛋白，制成生物探针，使用所述生物探针在荧光显微镜下检测石棉的方法。在生物荧光法中，就连用相差显微镜非常难以看到的更微细的石棉纤维，也可以高灵敏度地检测出来。具体而言，在生物荧光法中，已知就连宽(直径)30纳米的微细的温石棉单纤维也可以检测出来。而且，在生物荧光法中，可以确认石棉纤维的理化性质和形状这两者。因此，生物荧光法作为有效率、简便且精度高的石棉检测方法而受到关注。
[0009]另外，本发明人等报道了:来自大肠杆菌(Escherichia coli)的DksA蛋白即使在石棉中也特别与温石棉(白石棉)强力结合(非专利文献2)。
[0010]而且，本发明人等还就石棉结合蛋白的筛选方法、以及使用通过该筛选方法得到的石棉结合蛋白并利用生物荧光法检测各种试样中所含的石棉的方法进行了公开(专利文献2)。
[0011]现有技术文献
[0012]专利文献
[0013]专利文献1:国际公开第2007/055243号小册子(国际
【公开日】:2007年5月18日)
[0014]专利文献2:日本国公开专利公报“日本特开2010-32271号(2010年2月12日公开)，，
[0015]非专利文献
[0016]非专利文献I 石棉监测手册(7 η卜? 二夕丨J >夕'' 二二 7卟)(第4.0版)”环境省水.大气环境局大气环境课、平成22年6月
[0017]非专利文献2 !“Detection of Chrysotile Asbestos by Using aChrysotiIe-Binding Protein，，，Biotechnology and Bioengineering,第 99卷，N0.2，FebruaryI, 2008，第 285-289 页.
【发明内容】

[0018]发明所要解决的课题
[0019]如上所述，生物荧光法还可以检测用相差显微镜无法检测的微细的石棉纤维。即，通过生物荧光法检测到的石棉的总数有可能多于通过相差显微镜检测到的总数。因此，在现有技术的计测者中，存在着“是不是与通过现有的相差显微镜-电子显微镜法取得的过去的数据没有了延续性”、“是不是改变了石棉的检测标准”的悬念。因此，在生物荧光法中，存在着如何以不改变现有的相差显微镜-电子显微镜法的标准的方式计测石棉的技术课题。
[0020]这里，根据非专利文献1，现有方法的标准是指，首先，使用相差显微镜计测长5 μ m以上、宽(直径)不足3 μ m、且长与宽的比例(长径比)为3:1以上的纤维状物质，算出总纤维数。再通过任一种方法判定该总纤维数中有百分之多少是石棉。作为该石棉的判定(鉴定)方法，例如，使用电子显微镜(分析扫描电子显微镜或分析透射电子显微镜)的方法是相差显微镜-电子显微镜法。在该方法中，对于使用相差显微镜计测到的纤维，根据电子显微镜下的X射线光谱进行判定，判定石棉。
[0021]另一方面，如上所述，相差显微镜-电子显微镜法存在着无法简便且快速地检测石棉的课题。
[0022]本发明是鉴于上述问题而提出的，其目的在于提供:不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，与相差显微镜-电子显微镜法相比，能够更有效率地、简便且高精度地检测石棉的方法。
[0023]解决课题的方法
[0024]本发明人等为了达到上述目的反复进行了深入研究，结果发现:按照常规标准在相差显微镜下缩小检测对象物后，通过生物荧光法确认该检测对象物的理化性质，从而不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，与相差显微镜-电子显微镜法相比，能够更有效率地、简便且高精度地检测石棉，从而完成了本发明。
[0025]按照相差显微镜-电子显微镜法的检测标准在相差显微镜下缩小检测对象物，之后通过生物荧光法确定该检测对象物的理化性质(即是否是石棉)，从而检测石棉，这种设想本身前所未有，是本发明人等首次在此公开的。
[0026]即，本发明所涉及的石棉检测方法，其特征在于，包括下述步骤:接触步骤，使带有荧光标记的石棉结合蛋白与受检物接触；第I检测步骤，在经过上述接触步骤后，使用相差显微镜检测上述受检物中所含的纤维状物质；以及第2检测步骤，使用荧光显微镜检测与在上述第I检测步骤中检测的上述纤维状物质结合的上述石棉结合蛋白，其中，上述第I检测步骤和上述第2检测步骤在同一视野中进行。
[0027]在本发明的石棉检测方法中，首先，在第I检测步骤中，在相差显微镜下从受检物中检测纤维状物质，对于第I检测步骤中检测到的各纤维状物质，在接下来的采用生物荧光法的第2检测步骤中，判定其是否是石棉。当然在第2检测步骤中会观察到用相差显微镜无法检测的微细的石棉纤维，但这样的微细的石棉纤维在第I检测步骤中被排除在外。即，通过本发明的石棉检测方法最终检测到的石棉总数不可能多于通过相差显微镜检测同一样品时检测到的石棉总数。因此，不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，即可检测石棉。这样，在本 发明的石棉检测方法中，其特征在于:为了检测石棉，将相差显微镜和荧光显微镜组合使用。
[0028]另外，在第2检测步骤中，通过生物荧光法确定第I检测步骤中在相差显微镜下缩小的检测对象物的理化性质(即是否是石棉)，即，根据荧光的有无判定带有荧光标记的石棉结合蛋白是否与上述检测对象物结合，因此可以非常简便且高精度地检测石棉。
[0029]而且，与利用现有的电子显微镜法确定理化性质相比，能够用极短的时间简便地确定检测对象物的理化性质。具体而言，在电子显微镜法中，若还包括样品的预处理，则到确定检测对象物的理化性质为止，花费大约15小时(例如参照山田真里等人，“环境中的石棉粉尘浓度测定中的分析方法的研究(環境中O石綿粉C ^濃度測定1: ^ ^分析方法O検討)”，枥木县保险环境中心年报，第12号(2006年版)，记载页62~68)，相比之下，在本发明的石棉检测方法中，大约I小时即可完成接触步骤~第2检测步骤。
[0030]另外，在相差显微镜-电子显微镜法中，虽然通过电子显微镜可以确认受检物中含有石棉，但由于在两种显微镜间移动载物台，所以观察同一视野是非常困难的。即，对于在相差显微镜下检测到的各个纤维，几乎不可能逐一判别哪个纤维是石棉，因此用电子显微镜判定统计学上显著的数，用该比例乘以通过相差显微镜得到的总纤维数，从而推定石棉数。
[0031]相比之下，在本发明的石棉检测方法中，通过使用具备相差显微镜用电容器和落射荧光装置的显微镜(称作“相差/荧光显微镜”)或具备两者的偏光显微镜作为显微镜，从而只需将光路从相差观察用的透射光切换到落射荧光，即可不改变视野而进行第I检测步骤和第2检测步骤。因此，在第I检测步骤中，在相差显微镜下缩小检测对象物后，只需在此状态下直接将显微镜的光路由相差模式切换成荧光模式，即可在同一视野中进行第2检测步骤。由此，对于第I检测步骤中检测的纤维状物质，可以立即判别每一个纤维状物质是否是石棉。
[0032]因此，根据本发明的石棉检测方法，可以在不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准的情况下，与相差显微镜-电子显微镜法相比，更有效率地、简便且高精度地检测石棉。
[0033]需要说明的是，在上述非专利文献2中，仅仅是根据接触了 GFP标记的DksA蛋白的温石棉(白石棉)的相差显微镜像和荧光显微镜像，确认了在温石棉(白石棉)的纤维上观察到由上述GFP发出的荧光。即，仅仅是为了确认DksA蛋白确实与温石棉(白石棉)结合，而进行相差显微镜观察和荧光显微镜像的观察。
[0034]同样，在上述专利文献2中，也记载着进行相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两者，但在该专利文献中，也不过是记载着进行这两种观察。
[0035]这样，在非专利文献2和专利文献2记载的方法中，虽然对受检物进行相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两种观察，但石棉的检测标准与现有的生物荧光法相同。即，在非专利文献2和专利文献2记载的方法中，判断为观察到荧光的物质均为石棉，因此采用现有的检测标准，无法正确地检测石棉。
[0036]另外，专利文献2中记载着:在滤器上观察荧光标记的石棉结合蛋白与石棉的结合体时，将滤器无色化(透明化)，但这只是为了能够进行相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两种观察，根据上述理由，仅凭将滤器透明化，还无法采用现有的检测标准来正确地检测石棉。
[0037]具体而言，在专利文献2的实施例(例如实施例3)中，根据相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两种观察，识别与石棉结合的石棉结合蛋白。但是，在上述技术中，在进行相差显微镜观察时，没有选择出应该关注的纤维(具体而言，具有规定的大小的纤维)，因此将通过荧光显微镜观察到的所有荧光信号(从大信号到小信号的所有荧光信号)均计数为石棉。其结果，通过上述技术得到的判定结果大大偏离了基于现有的石棉检测标准的判定结果O
[0038]另外，在专利文献2的实施例(例如实施例4、5、7、8、9、10)中，在分散于液体中的状态下使石棉与石棉结合蛋白结合，同时在分散于液体中的状态下检测与石棉结合蛋白连接的标记的酶活性。即，上述的技术并不是根据相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两种观察来识别石棉的技术。
[0039]另外，在专利文献2的实施例(例如实施例6)中，将石棉捕捉到薄膜滤器中，使石棉结合蛋白与该石棉结合，之后对薄膜滤器施行透明化处理(例如参照专利文献2的实施例6)。而且，之后根据相差显微镜观察和荧光显微镜观察这两种观察来识别石棉。但是，该技术也和上述的实施例3 —样，在进行相差显微镜观察时没有选择出应该关注的纤维(具体是指具有规定的大小的纤维)，因此将通过荧光显微镜观察到的所有荧光信号(从大信号到小信号的所有荧光信号)计数为石棉。其结果，通过上述技术得到的判定结果大大偏离了基于现有的石棉检测标准的判定结果。
[0040]如上所述，通过专利文献2的实施例等中记载的技术得到的判定结果，大大偏离了基于现有的石棉检测标准的判定结果。以下对这一点进行更详细的说明。
[0041 ] 在荧光显微镜中，还可以检测非常细的纤维(例如直径为30nm的温石棉纤维)。即，在荧光显微镜中，以暗视野为背景，看到观察对象发亮，因此还可以观察非常细的纤维。荧光显微镜到底也是光学显微镜的一种，因此光的分辨率有限(250nm~300nm)。但是，在荧光显微镜中，例如即使是30nm的纤维，看起来也较实际大小大，粗达300nm左右，观察起来模糊不清。
[0042]即，在荧光显微镜中，还能看到光的分辨率的界限以下的纤维，因此与相差显微镜相比数出更多纤维的风险高。另外，光的分辨率的界限附近的测定值存在着包含该测定值以下的值的风险，缺乏可靠性。
[0043]本发明的石棉检测方法提供确实解决上述问题的方法。[0044]具体而言，在本发明中，先使用相差显微镜检测满足现有的石棉的尺寸条件的纤维，再根据荧光图像只判定处于该条件的纤维是否是石棉，从而可以解决上述问题。
[0045]发明效果
[0046]根据本发明的石棉检测方法，可以在不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准的情况下，与相差显微镜-电子显微镜法相比，发挥可以更有效率地、简便且高精度地检测石棉的效果。
【专利附图】

【附图说明】
[0047]图1是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。
[0048]图2是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。
[0049]图3是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。
【具体实施方式】
[0050]以下，对本发明的实施方式进行详细说明。但本发明并不限于此，可以以在记述范围内加入各种变形的方式实施。另外，本说明书中记载的学术文献和专利文献均作为参考而引用到本说明书中。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，则表示数值范围的“A~B”是指“A以上、B以下”。
[0051]本发明的石棉检测方法的构成如下，即包括下述步骤:接触步骤，使带有荧光标记的石棉结合蛋白与受检物接触；
[0052]第I检测步骤，在经过上述接触步骤后，使用相差显微镜检测上述受检物中所含的纤维状物质；以及
[0053]第2检测步骤，使用荧光显微镜检测与上述第I检测步骤中检测的上述纤维状物质结合的上述石棉结合蛋白，其中
[0054]上述第I检测步骤和上述第2检测步骤在同一视野中进行。
[0055]上述“受检物”是指有待检测是否包含石棉的对象物。作为受检物，可以列举砂浆、岩棉等建材、蛇纹石等矿石、采集想要检测石棉的环境中的空气而得到的物质等。
[0056]空气(大气)中的受检物可以通过用滤器过滤待测环境中的空气来捕集。将受检物捕集到滤器中的方法没有特别限定，只要可以用滤器过滤待测环境中的空气来捕集受检物即可。例如，可以按照“石棉监测手册(卜? 二夕U >夕'' 7 二二 (第4.0版)”(非专利文献I)中记载的方法进行受检物的捕集。作为上述“滤器”，没有特别限定，但通常使用纤维素酯制薄膜滤器或聚碳酸酯滤器等。
[0057]这样，上述受检物可以是被捕集到滤器中的物质。此时，优选进一步包含将经过接触步骤后的上述滤器透明化的透明化步骤，并且在经过上述透明化步骤后进行第I检测步骤。
[0058]即，对捕集到滤器中的受检物进行石棉检测时，本发明的石棉检测方法可以是如下的构成，即包括下述步骤:接触步骤，使带有荧光标记的石棉结合蛋白与捕集到滤器中的受检物接触；
[0059]透明化步骤，将经过上述接触步骤后的上述滤器透明化；
[0060]第I检测步骤，在经过上述透明化步骤后，使用相差显微镜检测上述受检物中所含的纤维状物质；以及
[0061]第2检测步骤，使用荧光显微镜检测与上述第I检测步骤中检测的上述纤维状物质结合的上述石棉结合蛋白，其中
[0062]上述第I检测步骤和上述第2检测步骤在同一视野中进行。
[0063]需要说明的是，本说明书中使用的“石棉”与“石绵”同义。
[0064]本发明人等将该新的石棉检测方法命名为“相差荧光法”。
[0065]〔1.接触步骤〕
[0066]“接触步骤”是使带有荧光标记的石棉结合蛋白与受检物(或捕集到滤器中的受检物)接触的步骤。
[0067]上述“带有荧光标记的石棉结合蛋白”可以是用荧光物质修饰的石棉结合蛋白，也可以是荧光蛋白与石棉结合蛋白的融合蛋白。需要说明的是，在本说明书中，有时将上述“带有荧光标记的石棉结合蛋白”仅称作“石棉结合蛋白”。关于“荧光标记”和“石棉结合蛋白”，将在后面进行阐述。
[0068]对使石棉结合蛋白与受检物接触的方法没有特别限定，从可以使两者高效率地进行接触的角度考虑，优选使石棉结合蛋白和受检物在液体中接触。例如，可以在包含石棉结合蛋白的溶液中添加受检物，将其充分混和；反之，可以在包含受检物的悬浮液中添加石棉结合蛋白，将其充分混和。另外，还可以混合包含石棉结合蛋白的溶液和包含受检物的悬浮液，将其充分混和。受检物被捕集到滤器中时，可以通过在滤器的捕集有受检物的面(捕捉面)上滴加包含石棉结合蛋白的溶液，使受检物和石棉结合蛋白在液体中接触。需要说明的是，关于使石棉结合蛋白与受检物接触的条件(例如温度、时间等)，只要是两者可以充分接触的条件即可，没有特别限定，在适当研究后，采用优选的条件即可。
[0069]对与受检物接触的石棉结合蛋白的量没有特别限定，但若相对于受检物的量石棉结合蛋白的量过少，则有可能无法充分检测受检物中所含的石棉。另一方面，若相对于受检物的量石棉结合蛋白的量过剩，则有可能发生石棉以外的物质与石棉结合蛋白的非特异性结合，精度降低。因此，优选使难以与石棉以外的物质发生非特异性结合、且能够与受检物充分接触的量的石棉结合蛋白与受检物接触。例如，在滤器的捕集面上滴加包含石棉结合蛋白的溶液时，优选在滤器的捕集面上滴加含有0.5nM?5 μ Μ、优选5ηΜ?500ηΜ的浓度的石棉结合蛋白的溶液，使其达到33?98 μ 1/cm2、优选33?49 μ 1/cm2。
[0070]作为上述“液体”，只要不是抑制或降低石棉结合蛋白与受检物的结合、或者降低石棉结合蛋白与受检物的结合特异性的液体即可，没有特别限定。作为这样的液体，例如可以列举磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液等。
[0071]另外，在接触步骤中，使石棉结合蛋白与受检物在液体中接触时，为了避免非特异性的结合，该液体中可以含有表面活性剂(Tween20 (注册商标)、Triton X-100等)。在后述的实施例中，使用0.3M的磷酸缓冲液(pH8.0),0.3M的NaCU0.5%的Tween80 (注册商标)的组成的缓冲液作为液体，进行接触步骤。
[0072]在本发明的石棉检测方法中，在接触步骤中，可以使作为石棉结合蛋白的两种以上的不同的石棉结合蛋白与受检物接触。此时，上述两种以上的不同的石棉结合蛋白优选为与互不相同的种类的石棉特异性结合的蛋白、并且带有发出互不相同的波长的荧光的荧光标记。当为所述构成时，在接下来的第2检测步骤中，根据荧光颜色的不同，可以容易地判别不同种类的石棉。
[0073]具体说明如下:作为石棉结合蛋白，例如将与温石棉特异性结合的蛋白(例如DksA蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC73256))和与角闪石系石棉特异性结合的蛋白(例如H-NS6chxi蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC74319))组合使用，并且使各石棉结合蛋白带有发生互不相同的波长的荧光的荧光标记(例如，其中一种石棉结合蛋白用Cy3进行标记，另一种石棉结合蛋白用DyLight488进行标记),从而在接下来的第2检测步骤中，根据荧光颜色的不同，可以分别检测温石棉和角闪石系石棉。需要说明的是，两种以上不同的石棉结合蛋白的组合、以及发出互不相同的波长的荧光的荧光标记的组合并不限于上述组合，根据想要检测的石棉的种类等，可以从所有的石棉结合蛋白和荧光标记中选择适当的组合。
[0074]例如，其中一种石棉结合蛋白用绿色荧光色素进行标记、另一种石棉结合蛋白用红色荧光色素进行标记时，根据荧光颜色的不同，可以分别检测温石棉和角闪石系石棉。作为上述“绿色荧光色素”，例如可以列举荧光素、DyLight488、Alexa488、ATT0488、CF488A等。另外，作为上述“红色荧光色素”，例如可以列举Cy3、DyLight550、CF555等。可以从这些“绿色荧光色素”和“红色荧光色素”中各选择一种进行组合。
[0075]这里，以下对“石棉结合蛋白”和“荧光标记”进行具体说明。
[0076](1-1.石棉结合蛋白)
[0077]在本说明书中，“石棉结合蛋白”是指具有与石棉特异性结合的性质的蛋白。关于蛋白是否与石棉特异性结合，这可以通过在至少包含0.1M以上的氯化钠的溶液中探讨研究对象的蛋白与石棉是否结合来判断。即，在包含0.1M以上的氯化钠的溶液中混合蛋白和石棉，洗脱与石棉结合的蛋白，之后利用SDS-PAGE等方法检测蛋白。如果检测到蛋白，则可以说该蛋白是与石棉特异性结合的蛋白(石棉结合蛋白)(具体参照专利文献I)。需要说明的是，当蛋白在至少包含0.1M以上的氯化钠的溶液中与石棉结合时，可以说该蛋白是与石棉特异性结合的蛋白，但在包含0.3M以上的氯化钠的溶液中，蛋白难以与石棉结合，因此优选在包含0.1M?0.3M、优选0.2M?0.3M的氯化钠的溶液中探讨研究对象的蛋白与石棉是否结合。当然，也可以在包含0.3M以上的氯化钠(例如0.3M?0.5M、0.3M?1M、0.5M?1M、或IM以上)的溶液中探讨研究对象的蛋白与石棉是否结合。氯化钠的浓度越高，可以说蛋白与石棉的结合特异性越高。
[0078]作为这样的石棉结合蛋白，例如可以列举H-NS蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC74319)、DksA蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC73256)、GatZ蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC75156)、DnaK 蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC73125)、HlpA蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC73289)、YgiW蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC76060)、CspA蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAN68075)、Cgl0974蛋白(数据库名:GenBank、检索号:BAB98367)、0mpC 蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC75275)、0mpA 蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC74043)、SI蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC73997)、S4蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC76321)、LI蛋白(数据库名=GenBank、检索号:AAC76958)、L5蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC76333)、L7蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC76960)、TTC0984蛋白(数据库名:NCB1、检索号:YP — 004953)等，但本发明并不限于这些蛋白。这些石棉结合蛋白可以单独使用I种，也可以将多种组合使用。
[0079]上述“H-NS蛋白”的第I位~第57位的氨基酸区(SEQ ID NO: 7)即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。另外，第60位~第90位的氨基酸区(SEQ ID Ν0:8)即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直闪石、透闪石、阳起石特异性
结合?
[0080]上述“DksA蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0081]上述“GatZ蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直闪石、透闪石、阳起石特异性结合。
[0082]上述“DnaK蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0083]上述“HlpA蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0084]上述“YgiW蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0085]上述“CspA蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0086]上述“Cgl0974蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)特异性结合。
[0087]上述“S4蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性
结合 ?
[0088]上述“LI蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性
结合 ?
[0089]上述“L5蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性
结合 ?
[0090]上述“L7蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性
结合?
[0091]上述“OmpC蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)、铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性结合。
[0092]上述“OmpA蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)、铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性结合。
[0093]上述“SI蛋白”即使在石棉中也能够与温石棉(白石棉)、铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特异性结合。
[0094]上述“TTC0984蛋白”即使在石棉中也能够与铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)结合。
[0095]对捕集到滤器中的受检物进行石棉检测时，需要将滤器透明化，因此此时使用的石棉结合蛋白优选为经过后述的透明化步骤后维持与石棉的结合的蛋白。由于该石棉结合蛋白具有这样的性质，因此即使在经过透明化步骤后也可以检测石棉。这里，上述“经过透明化步骤后维持与石棉的结合”可以通过研究透明化步骤前后的石棉结合蛋白在石棉上的结合量的变化来进行判断。例如，以与石棉结合的荧光标记蛋白(带有荧光标记的石棉结合蛋白)的荧光的强度(荧光强度)为基准，以透明化步骤前的荧光强度为100%时，经过透明化步骤后的荧光强度维持在优选20%以上、更优选50%以上、进一步优选80%以上时，可以说经过透明化步骤后维持着与石棉的结合。关于荧光强度，可以使用荧光显微镜等，按照公知的方法进行测定。
[0096]需要说明的是，如下所述，根据荧光标记的种类，有时通过经过透明化步骤而使荧光强度受到影响，因此用于研究石棉结合蛋白与石棉的结合量的荧光标记只要使用在经过透明化步骤后通过荧光显微镜可以检测荧光的荧光标记即可。然后，研究通过经过透明化步骤荧光标记的荧光强度受到何种程度的影响，最终可以判断石棉结合蛋白与石棉的结合量。
[0097]作为经过透明化步骤后维持与石棉的结合的石棉结合蛋白，例如可以列举H-NS蛋白(数据库名:GenBank>检索号:AAC74319)、DksA蛋白(数据库名:GenBank>检索号:AAC73256)、GatZ蛋白(数据库名:GenBank、检索号:AAC75156)等，但本发明并不限于这些蛋白。这些石棉结合蛋白可以单独使用I种，也可以将多种组合使用。
[0098]对石棉结合蛋白的来源没有特别限定，可以是来自细菌、酵母、植物、动物等任一种生物的蛋白。
[0099]需要说明的是，在本说明书中，“蛋白” 一词可以和“多肽”或“肽”交换使用。“蛋白”包括蛋白的部分片段(片段)。另外，“蛋白”包括融合蛋白。“融合蛋白”是指两种以上的异种蛋白的一部分(片段)或全部结合得到的蛋白。
[0100]另外，作为本发明中使用的石棉结合蛋白，还可以使用由在上述例示的蛋白的氨基酸序列中有I个或多个氨基酸被缺失、取代和/或添加的氨基酸序列构成、且能够与石棉结合的蛋白。
[0101]这里，上述“I个或多个氨基酸被缺失、取代和/或添加”是指，利用位点特异性诱变法等公知的突变肽制作法，使可以缺失、取代和/或添加的程度的数(例如，总氨基酸数的5%以下)的氨基酸被缺失、取代和/或添加。I个或多个氨基酸被缺失、取代和/或添加的数为总氨基酸数的5%以下，并且氨基酸被缺失、取代和/或添加后的蛋白只要具有与石棉结合的活性即可，可以是几种蛋白。
[0102]关于有I个或多个氨基酸被缺失、取代和/或添加的位点，只要氨基酸被缺失、取代和/或添加后的蛋白具有与石棉结合的活性即可，可以是该氨基酸序列中的任何位点。
[0103]这样的突变多肽并不限于具有利用公知的突变多肽制作法人为导入的突变的多肽，可以是将天然存在的同样的突变多肽分离纯化而得到的多肽。
[0104]蛋白的氨基酸序列中的若干个氨基酸在不显著影响该蛋白的结构或功能的情况下可以容易地被修饰，这在该领域众所周知。而且，不仅是人为的修饰，在天然蛋白中还存在着不使该蛋白的结构或功能发生显著变化的突变体，这也是众所周知的。
[0105]优选的突变体具有保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。优选为沉默取代、添加和缺失，特别优选为保守性取代。这些取代不会改变本发明的多肽活性。[0106]被看作是代表性的保守性取代的取代有:脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的I个氨基酸取代成其他氨基酸、羟基残基Ser和Thr的交换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln间的取代、碱性残基Lys和Arg的交换、以及芳族残基Phe、Tyr间的取代。
[0107]另外，本发明中使用的石棉结合蛋白可以是包含加成的肽的蛋白。作为加成的肽，例如可以列举聚精氨酸标记(Arg-tag)或聚组氨酸标记(His-tag)或Myc、Flag等的表位标记肽。
[0108]作为本发明中使用的石棉结合蛋白，只要是能够与石棉特异性结合的蛋白即可，因此即使是上述例示的以外的蛋白，本领域技术人员通过确认其是否能够与石棉特异性结合，即可容易地理解该蛋白是否是本发明中使用的蛋白。
[0109]同样，关于经过透明化步骤后维持与石棉的结合的蛋白，即使是上述例示的以外的蛋白，本领域技术人员通过确认在经过透明化步骤后是否能够维持与石棉的结合，即可容易地理解其是否是经过该透明化步骤后维持与石棉的结合的蛋白。
[0110]本发明中使用的石棉结合蛋白，可以是石棉结合蛋白的氨基酸序列全长中包含有助于与石棉的结合的部分的氨基酸序列的部分肽。例如，在后述的实施例中，使用H-NS蛋白的第60位?第90位的氨基酸区的部分肽。通过使用这样的部分肽，可以提高石棉结合蛋白与石棉(特别是铁石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直闪石、透闪石、阳起石)的结合特异性。
[0111]另外，本发明中使用的石棉结合蛋白，从使石棉与石棉结合蛋白的结合变得更强的观点考虑，优选为多聚化的蛋白。即，本发明中使用的石棉结合蛋白可以优选是多聚蛋白。
[0112]这里，上述“多聚蛋白”是指，2个以上的蛋白(多肽)通过二硫键等共价键、或非共价键结合的蛋白。蛋白是二聚体以上的多聚体，由此可以经由多个蛋白与石棉结合，因此与经由I个蛋白与石棉结合时相比，石棉结合蛋白与石棉间的结合力变高。
[0113]对多聚蛋白的制作方法没有特别限定，可以采用公知的方法。例如，在后述的实施例中，制作H-NS蛋白的第60位?第90位的氨基酸区的部分肽与链霉亲和素(streptavidin)的融合蛋白，利用链霉亲和素形成四聚体的性质,将这些融合蛋白四聚体化。
[0114]本发明中使用的石棉结合蛋白，可以通过培养作为其供给源的细胞，并进行分离、纯化来生产。另外，还可以利用公知的基因工程学方法构建重组表达载体，将其导入适当的宿主细胞中，使其以重组蛋白的形式进行表达，从而生产石棉结合蛋白。另外，还可以使用氨基酸合成仪等进行化学合成。
[0115](1-2.荧光标记)
[0116]在本说明书中，“荧光标记”是指，在使用石棉结合蛋白检测石棉时，以荧光为指标，用于检测与石棉结合的蛋白的物质。荧光标记由于其存在而显示出荧光，因此通过在荧光显微镜下观察，可以简单地判定是否存在石棉结合蛋白。因此，可以简单地检测石棉。
[0117]上述“荧光标记”只要是通过荧光显微镜可以检测荧光的标记即可，没有特别限定，可以从现有的荧光物质、荧光蛋白等中适当选择。
[0118]在本说明书中，上述“荧光物质”特别是指非蛋白的低分子荧光化合物。只要是通过荧光显微镜可以检测荧光的物质即可，对荧光物质的种类没有特别限定，例如可以列举 Cy3、DyLight488、荧光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555 等。除此以夕卜，还可以列举绿色荧光色素(例如Cy2、罗丹明绿色)、红色荧光色素(例如罗丹明、Cy5、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、CF568、CF594、DY547)等，但本发明并不限于这些。这些荧光物质可以单独使用I种，也可以将多种组合使用。
[0119]另外，作为上述“荧光蛋白”，可以列举绿色荧光蛋白(GFP)等。需要说明的是，对上述“荧光蛋白”的来源没有特别限定。
[0120]对捕集到滤器中的受检物进行石棉检测时，需要将滤器透明化，因此此时使用的“荧光标记”只要是经过后述的透明化步骤后通过荧光显微镜可以检测荧光的标记即可，没有特别限定。从提高石棉的检测灵敏度的观点考虑，以透明化步骤前的荧光标记发出的荧光的强度(荧光强度)为100%时，优选使用经过透明化步骤后的荧光标记发出的荧光强度维持在优选20%以上、更优选50%以上、进一步优选80%以上的荧光标记。
[0121]荧光标记的荧光强度可以利用公知的方法进行测定。例如，通过测定亮度，可以评价荧光强度。具体而言，使用图像分析软件VH Analyzer (KEYENCE)测定亮度，可以算出荧光强度的维持率。通过使用具有所述荧光强度的荧光标记，即使在经过透明化步骤后，也可以高精度地检测石棉。
[0122]经过透明化步骤后通过荧光显微镜可以检测荧光的荧光标记，可以从现有的荧光物质、突光蛋白等中适当选择。例如，可以列举Cy3、DyLight488、突光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555等，但本发明并不限于这些。这些荧光物质可以单独使用I种，也可以将多种组合使用。
[0123]即使是上述例示的以外的荧光标记，本领域技术人员通过确认经过透明化步骤后能否通过荧光显微镜来检测荧光，可以容易地理解该荧光标记是否是经过透明化步骤后通过突光显微镜可以检测突光的突光标记。
[0124]上述荧光标记只要通过符合该物质的标记方法与石棉结合蛋白结合即可。例如，可以使用用于标记蛋白的市售试剂盒等来标记石棉结合蛋白。
[0125]用荧光物质标记石棉结合蛋白时，可以利用化学键在石棉结合蛋白上标记荧光物质。
[0126]用荧光蛋白标记石棉结合蛋白时，通过利用公知的基因工程学方法，可以使荧光蛋白与石棉结合蛋白的融合蛋白以重组蛋白的形式表达。此时，可以采用下述方法:制作将编码石棉结合蛋白的基因和编码荧光蛋白的基因进行人工连接而得到的融合基因，将该融合基因插入表达载体的启动子的下游,再导入大肠杆菌等宿主细胞中使其表达。
[0127]由于石棉结合蛋白，有时荧光标记的石棉结合蛋白呈不溶性。认为分子量变得过大也许是其原因之一。此时，使用分子量较小的荧光物质作为荧光标记是有效的。
[0128]为了进一步提高石棉的检测感度，作为荧光标记，优选荧光强度强、稳定性高的物质。通过使用这样的荧光标记，可以通过石棉的检测感度，因此即使在受检物中所含的石棉量少的情况下，也可以进行石棉的检测。
[0129]〔2.检测步骤〕
[0130]在本发明的石棉检测方法中，检测步骤的构成如下:
[0131](i)第I检测步骤，在经过接触步骤后(根据情况，在经过透明化步骤后)，使用相差显微镜检测受检物中所含的纤维状物质；以及
[0132](?)第2检测步骤，使用荧光显微镜检测与第I检测步骤中检测的纤维状物质结合的石棉结合蛋白。
[0133]在本说明书中，将上述的第I检测步骤和第2检测步骤统称为“检测步骤”。本发明的石棉检测方法，根据需要可以无数次地切换相差显微镜和荧光显微镜以确认检测对象。因此，在本发明的石棉检测方法中，可以至少重复进行I次第I检测步骤和第2检测步骤。即，可以在第I检测步骤后进行第2检测步骤，并再次进行第I检测步骤。
[0134]具体而言，例如，在第2检测步骤后，再一次进行第I检测步骤，可以通过荧光显微镜再次确认检测到石棉结合蛋白的结合的纤维状物质的形状(长、宽、以及长与宽的比例)。这样，通过至少重复进行I次第I检测步骤和第2检测步骤，可以更准确地检测石棉。
[0135]另外，例如，可以每检测一种受检物中所含的纤维状物质就进行第2检测步骤，检测与该纤维状物质结合的石棉结合蛋白，再次返回到第I检测步骤，检测受检物中所含的其他纤维状物质。这样，通过在第I检测步骤中每检测一种纤维状物质就进行第2检测步骤，可以在同一视野中高效率地检测石棉。
[0136]这样当然可以，但在第I检测步骤中，粗略地检测完受检物中所含的纤维状物质后，对于检测到的纤维状物质，可以进行第2检测步骤。
[0137]这样，在本发明的石棉检测方法中，以在荧光显微镜下检测后又一次在相差显微镜下进行检测的方式，根据需要可以无数次地切换相差显微镜和荧光显微镜以确认检测对象，因此可以更准确地检测石棉。
[0138]但是，第2检测步骤必须在第I检测步骤之后进行。通过在第I检测步骤之后进行第2检测步骤，在第I检测步骤中首先将用相差显微镜无法检测的微细的石棉纤维排除在外，因此在第2检测步骤中不可能将这样的石棉纤维作为石棉来观察。即，通过本发明的石棉检测方法最终检测到的石棉总数不可能多于通过相差显微镜检测同一样品时检测到的石棉总数。`
[0139]另外，在本发明的石棉检测方法中，上述第I检测步骤和上述第2检测步骤在同一视野中进行。
[0140]在本发明的石棉检测方法中，通过使用相差/荧光显微镜等作为显微镜，只需将光路从相差观察用的透射光切换到落射荧光，即可不改变视野而进行第I检测步骤和第2检测步骤。因此，通过在同一视野中进行第I检测步骤和第2检测步骤，即在第I检测步骤中，在相差显微镜下缩小检测对象物后，只需在此状态下直接将显微镜的光路从相差模式切换成荧光模式，不改变视野，即可进行第2检测步骤。由此，对于第I检测步骤中检测的纤维状物质，可以立即判别每一个纤维状物质是否是石棉。
[0141]这里，对“第I检测步骤”和“第2检测步骤”进行说明。
[0142](2-1.第I检测步骤)
[0143]“第I检测步骤”是指，在经过接触步骤后(根据情况，经过透明化步骤后)，使用相差显微镜检测受检物中所含的纤维状物质的步骤。
[0144]这里，上述“纤维状物质”只要是具有纤维状的部分的物质即可，可以是纤维状部分分枝出来的物质，也可以是在纤维状部分附着颗粒的物质。上述“纤维状物质”的判断标准的细节记载在“石棉监测手册(卜? 二夕'J >夕'' 7 二 Λ Τ?)(第4.0版)”(非专利文献I)中。
[0145]在第I检测步骤中，只要根据相差显微镜法中的纤维状物质的检测标准检测上述“纤维状物质”即可。与相差显微镜法中的检测标准一致的纤维状物质是指，例如满足长5μπι以上、宽不足3μπκ且长与宽的比例为3:1以上的条件的纤维状物质(参照“石棉监测手册(7 X 7卜? 二夕U >夕'' 7 二二 7?)(第4.0版)”(非专利文献I))。即，在本发明的石棉检测方法中，根据现行的相差显微镜法中的检测标准，在第I检测步骤中，优选检测长5μπι 以上、宽不足3μπκ且长与宽的比例为3:1以上的纤维状物质。
[0146]这里，纤维状物质的“长度”例如使用安装在接眼透镜上的目镜分划板的刻度可以比较容易地进行判断，但纤维状物质的“长度”的判定方法并不限于此。
[0147]纤维状物质的“宽”也可说成是纤维状物质的“直径”。上述“直径”是指纤维状物质所内切的圆的直径。纤维状物质的“宽”例如利用安装在接眼透镜上的目镜分划板的刻度可以比较容易地进行判断，但纤维状物质的“宽”的判定方法并不限于此。
[0148]纤维状物质的“长与宽的比例”也可说成是纤维状物质的“长径比”。
[0149]关于纤维状物质的“长”、“宽”和“长与宽的比例”，在“石棉监测手册(了 K”:e 二夕U 7 二二 (第4.0版)”(非专利文献I)中有详细的规定，按照该文献中规定的方法，可以进行纤维状物质的“长”、“宽”和“长与宽的比例”的判定。
[0150]但是，本发明的石棉检测方法中的纤维状物质的检测标准并不限于上述标准。当变更相差显微镜法中的纤维状物质的检测标准时，在本发明的石棉检测方法中，也可以根据变更后的相差显微镜法中的纤维状物质的检测标准检测纤维状物质即可。这样，在本发明的石棉检测方法中，在第I检测步骤中，根据相差显微镜法中的纤维状物质的检测标准检测纤维状物质，因此不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，即可检测石棉。
[0151]在本发明的石棉检测方法中，首先，在第I检测步骤中，通过在相差显微镜下从捕集到滤器中的受检物中检测规定的纤维状物质，缩小在接下来的第2检测步骤中检测的对象物，因此在采用生物荧光法的第2检测步骤中，不可能检测出通过相差显微镜-电子显微镜法无法检测的微细的石棉纤维。即，通过本发明的石棉检测方法最终检测到的石棉总数不会多于按照相差显微镜-电子显微镜法检测同一样品时检测到的石棉总数。因此，不改变现有方法的石棉检测标准，即可检测石棉。
[0152](2-2.第2检测步骤)
[0153]“第2检测步骤”是使用荧光显微镜检测与第I检测步骤中检测的纤维状物质结合的石棉结合蛋白的步骤。
[0154]在第2检测步骤中，使用荧光显微镜检测石棉结合蛋白所带有的荧光标记，从而可以容易地检测与第I检测步骤中检测的纤维状物质结合的石棉结合蛋白。即，在第I检测步骤中检测的纤维状物质中，若在荧光显微镜下可以确认到荧光，则可以判断为该纤维状物质中结合有石棉结合蛋白，若无法确认到荧光，则可以判断为该纤维状物质中没有结合石棉结合蛋白。而且，可以判断石棉结合蛋白所结合的纤维状物质是石棉，并可以判断石棉结合蛋白未结合的纤维状物质不是石棉。
[0155]对使用荧光显微镜的荧光标记的检测方法没有特别限定，只要在适当研究符合该荧光标记的检测方法(激发波长等)后采用优选的条件即可。
[0156]对用于进行各检测步骤的相差显微镜和荧光显微镜的构成没有特别限定，例如，通过使用具备相差显微镜用电容器和落射荧光装置的显微镜(相差/荧光显微镜)或者具备两者的偏光显微镜作为显微镜，只需将光路从相差观察用的透射光切换到落射荧光，即可不改变视野而进行各检测步骤。即，通过使用相差/荧光显微镜这样的显微镜，在第I检测步骤中，在相差显微镜下缩小检测对象物后，只要在此状态下直接将显微镜的光路从相差模式切换成荧光模式，即可进行第2检测步骤。由此，在第2检测步骤中，对于第I检测步骤中检测的纤维状物质，立即可以判别每一个纤维状物质是否是石棉。
[0157]〔3.透明化步骤〕
[0158]“透明化步骤”是将经过接触步骤后的滤器透明化的步骤。通过在透明化步骤中将滤器透明化，当受检物被捕集到滤器中时，在接下来的第I检测步骤中，可以在相差显微镜下检测受检物中所含的纤维状物质。因此，滤器的透明化(无色化)方法只要是能够将滤器透明化至在接下来的第I检测步骤中在相差显微镜下可以检测纤维状物质的程度的方法即可，没有特别限定。例如，可以列举向滤器喷洒丙酮蒸气直至滤器变得透明的方法。该方法具体记载在“石棉监测手册(7 ^ 卜? 二夕U二二 7 (第4.0版)”(非专利文献I)中。作为其他的透明化方法，可以列举使用DMF溶液[35%的DMF (二甲基甲酰胺)、50%的水、15%的乙酸]的方法。该方法具体记载在“石棉监测手册(7 ^ 卜? 二夕U)"二 H (第4.0版)”(非专利文献I)中。
[0159]需要说明的是，经过透明化步骤后，捕集到滤器中的受检物处于无法与石棉结合蛋白接触的状态，因此进行透明化步骤时，必须在接触步骤之后进行透明化步骤。
[0160]〔4.其他〕
[0161]本发明的石棉检测方法可以包含上述步骤以外的步骤。例如，在接触步骤前，可以包含用滤器过滤测定环境中的空气以捕集受检物的捕集步骤。另外，还可以包含根据通过一系列的检测步骤得到的结 果，算出受检物中的石棉浓度的步骤或算出测定环境中的石棉浓度的步骤。
[0162]如上所述，根据本发明的石棉检测方法，不改变现有方法的石棉检测标准，与相差显微镜-电子显微镜法相比，可以更有效率地、简便且高精度地检测石棉。
[0163]本发明还可以如下构成。
[0164]在本发明的石棉检测方法中，优选进一步包括透明化步骤，即，将上述受检物捕集到滤器中，并将经过上述接触步骤后的上述滤器透明化，并且在经过上述透明化步骤后进行上述第I检测步骤。
[0165]如上所述，本发明的石棉检测方法，其特征在于:为了检测石棉而将相差显微镜和荧光显微镜组合使用，更具体而言，在第I检测步骤中，首先，在相差显微镜下检测规定的纤维状物质，之后对于所述的纤维状物质在第2检测步骤中进行生物荧光法，但是当为检测大气中的石棉的情形等、受检物被捕集到滤器中的情形时，通过在透明化步骤中将捕集到受检物的滤器透明化，可以将相差显微镜和荧光显微镜组合使用。所述透明化步骤必须在上述接触步骤之后进行。这是由于经过透明化步骤后的滤器无法使溶液通过，无法进行滤器的清洗，因此无法充分进行接触步骤的缘故。
[0166]因此，当为上述构成时，不改变相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，与相差显微镜-电子显微镜法相比，可以更有效率地、简便且高精度地检测大气中的石棉。
[0167]在本发明的石棉检测方法中，优选至少重复进行I次上述第I检测步骤和上述第2检测步骤。
[0168]在本发明的石棉检测方法中，根据需要可以无数次地切换相差显微镜和荧光显微镜以确认检测对象。因此，以在荧光显微镜下的检测后又一次在相差显微镜下进行检测的方式，根据需要可以无数次地切换相差显微镜和荧光显微镜以确认检测对象。其结果，可以更准确地检测石棉。
[0169]在本发明的石棉检测方法中，在上述第I检测步骤中，优选检测长5 μ m以上、宽不足3μπκ且长与宽的比例为3:1以上的纤维状物质。
[0170]当为上述构成时，按照现行的相差显微镜法的标准，在第I检测步骤中检测长5 μ m以上、宽不足3 μ m、且长与宽的比例为3:1以上的纤维状物质，因此通过本发明的石棉检测方法最终检测到的石棉总数不可能多于通过相差显微镜检测同一样品时检测到的石棉总数。因此，不改变现行的相差显微镜-电子显微镜法的石棉检测标准，即可检测石棉。
[0171]在本发明的石棉检测方法中，优选上述石棉结合蛋白是经过上述透明化步骤后维持与石棉的结合的蛋白，且上述荧光标记为经过上述透明化步骤后通过荧光显微镜可以检测荧光的标记，
[0172]当为上述构成时，即使在经过透明化步骤后，也可以高精度地检测石棉。
[0173]在本发明的石棉检测方法中，上述石棉结合蛋白可以是选自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一种以上的蛋白。
[0174]当为上述构成时，即使在经过透明化步骤后，也可以高精度地检测石棉。
[0175]在本发明的石棉检测方法中，上述荧光标记可以是选自Cy3、DyLight488、荧光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555 的一种以上的荧光物质。
[0176]当为上述构成时，即使在经过透明化步骤后，也可以高精度地检测石棉。
[0177]在本发明的石棉检测方法中，上述石棉结合蛋白优选为选自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一种以上的蛋白的多聚物。
[0178]由于石棉结合蛋白为多聚蛋白，因此与经由I个蛋白与石棉结合时相比，可以使石棉与石棉结合蛋白的结合力变得更强。因此，当为上述构成时，即使在经过透明化步骤后，也可以高感度地检测石棉。
[0179]本发明的石棉检测方法可以是如下的构成:在上述接触步骤中，使作为上述石棉结合蛋白的两种以上的不同的石棉结合蛋白与受检物接触，上述两种以上的不同的石棉结合蛋白是与互不相同的种类的石棉特异性结合的蛋白，并且可以带有发出互不相同的波长的突光的突光标记。
[0180]当为上述构成时，根据荧光的颜色的不同，可以容易地判别不同种类的石棉。
[0181]本发明并不限于上述各实施方式，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，关于将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合得到的实施方式，也包含在本发明的技术范围内。
[0182]实施例
[0183]以下，通过实施例来具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
[0184]〔实施例1:石棉结合蛋白H-NS6ch9ci的制备和荧光标记〕
[0185]利用生物素-链霉亲和素(str印tavidin)相互作用，使生物素修饰的石棉结合蛋白与荧光标记的链霉亲和素结合，制作荧光标记的石棉结合蛋白。[0186]首先,制作生物素化的石棉结合蛋白。以蛋白表达载体pET21_b (Novagen公司)为模板，使用寡核苷酸引物 Pl (GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA:SEQ ID NO:1)和寡核苷酸引物 P2 (CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC:SEQ ID NO:2)进行反向PCR，由此在pET21_b的HisTag前插入生物素化尾端。反向PCR反应使用KOD-plus-诱变试剂盒(TOYOBO公司)，按照该公司的方案来进行。将该生物素化蛋白表达载体命名为“pET21-AviTag-C”。
[0187]接着，以大肠杆菌K-12 株(Escherichia coli K12, ATCC700926)的基因组 DNA 为模板，使用寡核苷酸引物P3 (CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC:SEQ ID NO: 3)和寡核苷酸引物 P4 (GGATCCAAACAACGTTTAGCTTTGGTGCC:SEQ ID N0:4)进行 PCR，从而扩增编码作为石棉结合蛋白的H-NS蛋白(数据库名=GenBank，检索号:AAC74319)的第60位~第90位的氨基酸区(SEQ ID N0:8)的基因。PCR反应使用KOD-plus Neo DNA聚合酶(TOYOBO公司)，按照该公司的方案来进行。
[0188]将PCR扩增产物和生物素化蛋白表达载体pET21-AviTag-C用限制酶NdeI和BamHI在37°C下处理I小时，之后进行琼脂糖凝胶电泳。对于从凝胶中切出的DNA片段，使用Ligation High (TOYOBO公司)在16°C下连接30分钟，转化到大肠杆菌JM109株中。从得到的集落中提取插入有目标DNA片段的质粒，将其命名为“pET-H-NS6(l_9(l-AViTag-C”。
[0189]使用2XYT培养基，将用pET-H-NS6Q_9Q-AViTag-C质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)pBirA (Novagen公司)在37°C下培养一夜，以1% (v/v)接种在200ml的TYH培养基[20g/I的胰蛋白胨、10g/l的酵母提取 物、llg/1的HEPES、5g/l的NaClUg/Ι的硫酸镁、0.5%的葡萄糖、用氢氧化钾调节至PH7.2~7.4]中。在37 °C下培养直至0D_达到0.6，之后添加IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷，isopropyl- β -D-thioglactopyranoside)(终浓度为0.5mM)和D-生物素(终浓度为10(^10，在281:下培养4小时。通过离心分离培养液来集菌。
[0190]向得到的菌体团块中加入IOml的缓冲液A[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl、10%的甘油]进行悬浮，通过超声波进行破碎。将得到的细胞破碎液供给Histrap FF柱(GE Healthcare Bioscience公司),使C末端具有组氨酸的生物素化H-NS6chxi蛋白吸附在该柱上，用缓冲液B[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl,10%的甘油、0.5M的咪唑]洗脱。对于取得的生物素化H-NS6chxi蛋白，通过聚丙烯酰胺电泳确认纯度时，纯度为95%以上。
[0191]接下来，进行石棉结合蛋白(H-NS6tl,蛋白)的荧光标记。进行荧光修饰时，利用生物素-链霉亲和素的相互作用，使荧光标记的链霉亲和素与生物素修饰的石棉结合蛋白结合。将2.7 μ I的生物素化H-NS6ch9ci蛋白(495 μ Μ)和4 μ I的荧光修饰链霉亲和素溶液(lmg/ml)混合，在室温下培养I小时使之结合，对H-NS6ch9ci蛋白进行荧光标记。通过该操作，得到H-NS6ch9ci蛋白与荧光标记链霉亲和素的复合体。将使用经荧光色素Cy3标记的链霉亲和素(invitrogen公司)进行了荧光修饰的H-NS6chxi蛋白命名为“H-NS6ch9c1-链霉亲和素_Cy3”，将使用经突光色素DyLight488标记的链霉亲和素(Thermo Scientific公司)进行了突光修饰的H-NS6chxi蛋白命名为“H-NS6(i_9(1-链霉亲和素-DyLight488”，将使用经荧光色素DyLight550标记的链霉亲和素(Thermo Scientific公司)进行了突光修饰的H-NS6chx!蛋白命名为“H-NS6ch9c1-链霉亲和素_DyLight550”，将使用经荧光色素CF555标记的链霉亲和素(Biotium公司)进行了荧光修饰的H-NS6ch9ci蛋白命名为“H-NS6ch9c1-链霉亲和素-CF555”，将使用经荧光色素CF488A标记的链霉亲和素(Biotium公司)进行了荧光修饰的H-NS6ch9q蛋白命名为“H-NS6ch9q-链霉亲和素-CF488A”。
[0192]需要说明的是，“H-NS6tl,-链霉亲和素_Cy3”、“H-NS6chx1-链霉亲和素-DyLight488”、“H-NS6ch90-链霉亲和素-DyLight550”、“H-NS6ch90-链霉亲和素-CF555，，和“H-NS6Q_9Q-链霉亲和素-CF488A”由于利用链霉亲和素与石棉结合蛋白的融合蛋白，因此通过链霉亲和素的作用形成四聚体。即，“H-NS6ch9c1-链霉亲和素-Cy3”、“H-NS6ch9c1-链霉亲和素-DyLight488”、“H-NS6ch90-链霉亲和素-DyLight550”、“H-NS6ch90-链霉亲和素-CF555，，和"H-NS60^90-链霉亲和素-CF488A”是将4个H-NS6chxi蛋白聚合的四聚体蛋白用荧光色素进行标记的。
[0193]〔实施例2:利用相差荧光法进行的石棉显微镜观察(I)〕
[0194]将捕集了作为受检物的铁石棉(茶石棉)(JAWE231)的薄膜滤器切成1/8片，将捕集面朝上，滴加3次20 μ I的缓冲液C[0.3Μ的磷酸缓冲液(pH8.0),0.3M的NaCU0.5%的Tween80 (注册商标)]。
[0195]然后，滴加5次20 μ I的含有作为荧光蛋白的H-NS6ch9c1-链霉亲和素_Cy3(12.5nM)、H-NS6chx1-链霉亲和素 _DyLight488 (50nM)、H-NS60^90-链霉亲和素 _DyLight550(12.5nM)、H-NS6chx1-链霉亲和素-CF555 (12.5nM)或 H-NS6chx1-链霉亲和素-CF488A (50nM)的缓冲液C，使荧光蛋白与铁石棉结合。之后，滴加3次20 μ I的缓冲液C，以除去未结合的荧光蛋白。最后，滴加3次20 μ I的水，除去来自缓冲液的表面活性剂或盐。
[0196]接着，将滤器捕集面朝上放在载玻片(MATSUNAMI制、MICRO SLIDE GLASS白缘磨，Imm厚)上，使其充分干燥。干燥后，捕集面朝上沐浴丙酮蒸气，以将滤器透明化，之后将封入液夹在盖玻片(MATSUNAMI制、18 X 18mm)与滤器之间，得到观察用的标本。
[0197]使用相差/荧光显微镜(落射荧光显微镜BX-60、奥林巴斯公司制)观察所得的标本。首先，用相差显微镜进行观察，确认铁石棉纤维后，将光路切换成荧光模式，观察相同的视野。
[0198]图1是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。图1 (A)表示使用“H-NS6(I_9(1-链霉亲和素-Cy3”作为荧光蛋白时的结果，图1 (B)表示使用“H-NS6(I_9(1-链霉亲和素_DyLight488”作为荧光蛋白时的结果，图1 (C)表示使用“H-NS6(I_9(1-链霉亲和素_DyLight550”作为荧光蛋白时的结果，图1 (D)表示使用“H-NS6ch9q-链霉亲和素-CF555”作为荧光蛋白时的结果，图1 (E)表示使用“H-NS6chx1-链霉亲和素-CF488A”作为荧光蛋白时的结果。在图1 (A)~(E)的各图中，左图表示相差显微镜图像，右图表示与相差显微镜图像在同一视野中的荧光显微镜图像。如图1所示，在相差显微镜下观察的铁石棉纤维中，在荧光显微镜下可以确认到荧光蛋白的结合。
[0199]需要说明的是，在荧光色素Cy3、DyLight550和CF555的观察中，使用U-MNG立方体(二向色镜:DM570、激发滤光片:BP530-550、吸收滤光片:BA590)，在荧光色素DyLight488和CF488A的观察中，使用U-NIBA立方体(二向色镜:DM505、激发滤光片:BP470-490、吸收滤光片:BA515-550)。图像的采集使用显微镜数码相机DP_70(奥林巴斯公司制)。
[0200]需要说明的是，透明化步骤前后的纤维的荧光强度(=蛋白结合量+荧光物质强度)通过测定亮度来进行评价。具体而言，在透明化步骤前后使用图像分析软件VHAnalyzer (KEYENCE)测定图像中的纤维的亮度，算出荧光强度的维持率。其结果，以透明化步骤前的荧光强度为100%时，“H-NS6ch9c1-链霉亲和素_Cy3”在经过透明化步骤后的荧光强度维持90%。以透明化步骤前的荧光强度为100%时，“H-NS6ch9c1-链霉亲和素-DyLight488”在经过透明化步骤后的荧光强度维持90%。以透明化步骤前的荧光强度为100%时，"H-NS6Q_9(l-Neutravidin-DyLight550”在经过透明化步骤后的突光强度维持80%。以透明化步骤前的荧光强度为100%时，“H-NS6ch9c1-链霉亲和素-CF555”在经过透明化步骤后的荧光强度维持80%。以透明化步骤前的荧光强度为100%时，“H-NS6chx1-链霉亲和素-CF488A”在经过透明化步骤后的荧光强度维持90%。
[0201 ] 由以上的结果确认:通过使用H-NS6ch9ci蛋白作为石棉结合蛋白、使用Cy 3、DyLight488、DyLight550、CF555或CF488A作为荧光标记，在相差荧光法中能够检测铁石棉。
[0202]〔实施例3:利用相差荧光法进行的石棉显微镜观察(2)〕
[0203]除了使用捕集了作为受检物的铁石棉(茶石棉)(JAWE231)和岩棉(JFM标准纤维样品)的薄膜滤器、并只使用“H-NS6(i_9(1-链霉亲和素-Cy3”作为荧光法蛋白以外，利用与实施例2相同的方法制作标本。
[0204]使用相差/荧光显微镜(落射荧光显微镜BX-60、奥林巴斯公司制)观察所得的标本。首先，用相差显微镜进行观察，确认纤维状物质后，将光路切换成荧光模式，观察相同的视野。
[0205]图2是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。图2 (A)表示相差显微镜图像，(B)表示与(A)的相差显微镜图像在同一视野中的荧光显微镜图像，(C)表示将(A)的相差显微镜图像和(B)的荧光显微镜图像叠加的图。如图2所示，在相差显微镜下观察的纤维状物质2和3中，在荧光显微镜下可以确认荧光蛋白的结合。而在相差显微镜下观察的纤维状物质I和4中，在荧光显微镜下可以确认荧光蛋白的结合。其结果，判定纤维状物质2和3是石棉，判定纤维状物质I和4不是石棉。
[0206]由以上的结果确认:采用相差荧光法时，能够非常高效地、简便且高精度地判定在相差显微镜下观察的纤维状物质是否是石棉。
[0207]〔实施例4:石棉结合蛋白DksA的制备和荧光标记〕
[0208]接着，以大肠杆菌K-12 株(Escherichia coli K12，ATCC700926)的基因组 DNA 为模板，使用寡核苷酸引物 P5 (GGAATTCGCTAGCATGCAA—GAAGGGCAAAACCG:SEQ ID NO: 5)和寡核苷酸引物 P6(GTTGGATCCCCGCAGCCAGCCATCTGTTTTTCGC:SEQ ID NO: 6)进行 PCR，从而扩增编码作为石棉结合蛋白的DksA蛋白(数据库名=GenBank，检索号:AAC73256)的基因。PCR反应使用KOD-plus DNA聚合酶(TOYOBO公司)，按照该公司的方案来进行。
[0209]将PCR扩增产物和蛋白表达载体pET21_b用限制酶NheI和BamHI在37°C下处理I小时，之后进行琼脂糖凝胶电泳。使用Ligation High，将从凝胶中切出的DNA片段在16°C下连接30分钟，转化到大肠杆菌JM109株中。从得到的集落中提取插入有目标DNA片段的质粒，将其命名为“ ρΕΤ-DksA ”。
[0210]使用2XYT 培养基，将用 pET-DksA 转化的 Rosetta? (DE3) pLysS (Novagen 公司)在37°C下培养一夜，以1% (v/v)接种在200ml LB培养基[10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物、5g/l的NaCl]中。在37 °C下培养直至0D_达到0.6，之后添加IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)使终浓度达到0.5mM,在28°C下培养4小时。通过离心分离培养液来集菌。在得到的菌体团块中加入IOml缓冲液A[0.05M的Tris-HCl (pH8.3)、
0.05M的NaCl、10%的甘油]进行悬浮，通过超声波进行破碎。
[0211]将得到的细胞破碎液供给Histrap FF柱，使C末端具有组氨酸的DksA蛋白吸附在该柱上，用缓冲液B[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl,10%的甘油、0.5M的咪唑]洗脱。对于得到的DksA蛋白，通过聚丙烯酰胺电泳确认纯度时，纯度为95%以上。
[0212]接下来,进行DksA蛋白的突光标记。首先，用突光素标记DksA蛋白。将5nmol的DksA蛋白溶解于400 μ I的包含50mM的NaCl和10%甘油的25mM的HEPES-NaOH缓冲液(PH7.4)中。在上述溶液中添加4.3μ 110mg/ml的荧光素_5_马来酰亚胺(ThermoScientfic公司)/二甲基甲酰胺，之后在暗处、于室温下静置2小时。上述的反应溶液经凝胶过滤除去未结合的荧光素来进行纯化。将该用荧光素标记的DksA命名为“DksA-荧光素”。
[0213]接下来，用Alexa488标记DksA。将5nmol的DksA蛋白溶解于400 μ I包含50mM的NaCl和10%甘油的25mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.4)中。在上述溶液中添加6.4 μ 11Omg/ml的Alexa488_5_马来酰亚胺(invitrogen公司)/ 二甲基甲酰胺，之后在暗处、于室温下静置2小时。上述反应溶液经凝胶过滤除去未结合的Alexa488来进行纯化。将该用Alexa488标记的DksA蛋白命名为“DksA-Alexa488”。
[0214]〔实施例5:利用相差荧光法进行的石棉显微镜观察(3)〕
[0215]除了使用捕集了作为受检物的温石棉(白石棉)(JAWE111)的薄膜滤器、使用DksA-荧光素(350nM)或DksA-Alexa488 (200nM)作为荧光法蛋白、并使用缓冲液D[0.1M的碳酸缓冲液(PH9.4)、1.0%的TWeen80 (注册商标)]作为缓冲液以外，按照与实施例2相同的方法制作标本。
[0216]使用相差/荧光显微镜(落射荧光显微镜BX-60、奥林巴斯公司制)观察得到的标本。首先，用相差显微镜进行观察，确认温石棉纤维后，将光路切换成荧光模式，观察相同视野。
[0217]图3是显示相差荧光法的石棉的显微镜观察结果的图。图3(A)表示使用“DksA-荧光素”作为荧光蛋白时的结果，图3 (B)表示使用“DksA-AleXa488”作为荧光蛋白时的结果。在图3 (A)和(B)的各图中，左图表示相差显微镜图像，右图表示与相差显微镜图像在同一视野中的荧光显微镜图像。如图3所示，在相差显微镜下观察的温石棉纤维中，在荧光显微镜下可以确认荧光蛋白的结合。
[0218]关于物质1，如图3 (A)所示，在相差显微镜下可以确认到纤维，进一步在荧光显微镜下可以确认到荧光蛋白的结合。而关于物质2，如图3 (A)所示，在荧光显微镜下可以确认到荧光蛋白的结合，但由于是宽(直径)不足0.25 μ m的微细纤维，所以通常在相差显微镜下不能作为石棉而被检测出来。在相差荧光法中，由于在相差显微镜下检测规定的纤维状物质的第I检测步骤中将这样的微细石棉纤维排除在外，所以象物质2这样的不能作为石棉而被相差显微镜检测出来的纤维不可能包含在最终检测到的石棉总数中。
[0219]需要说明的是,在突光色素突光素和突光色素Alexa488的观察中，使用U-NIBA立方体(二向色镜:DM505、激发滤光片:BP470-490、吸收滤光片:BA515_550)。图像的采集使用显微镜数码相机DP-70 (奥林巴斯公司制)。
[0220]需要说明的是，按照与实施例2相同的方法，评价透明化步骤前后的纤维的荧光强度(=蛋白结合量+荧光物质强度)时，在以透明化步骤前的荧光强度为100%的情况下，“DksA-荧光素”经过透明化步骤后的荧光强度维持80%。另外，以透明化步骤前的荧光强度为100%时，“DksA-Alexa488”经过透明化步骤后的荧光强度维持80%。
[0221]由以上的结果确认:通过使用DksA蛋白作为石棉结合蛋白、并使用荧光素和Alexa488作为突光标记,在相差突光法中可以检测温石棉。
[0222]产业实用件
[0223]如上所述，根据本发明的石棉检测方法，不改变相差显微镜-电子显微镜法等现有方法的石棉检测标准，与相差显微镜-电子显微镜法相比，可以更有效率地、简便且高精度地检测石棉。因此，本发明作为应对石棉的检测要求迅速性的解体现场等中的石棉风险的手段极为重要。
[0224]因此，本发明可以在使用石棉的产业、进行石棉检测的产业等各种广泛的产业中应用。
【权利要求】
1.一种石棉检测方法，其特征在于，包括下述步骤: 接触步骤，使带有荧光标记的石棉结合蛋白与受检物接触； 第I检测步骤，在经过上述接触步骤后，使用相差显微镜检测上述受检物中所含的纤维状物质；以及 第2检测步骤，使用荧光显微镜检测与上述第I检测步骤中检测的上述纤维状物质结合的上述石棉结合蛋白，其中 上述第I检测步骤和上述第2检测步骤在同一视野中进行。
2.根据权利要求1所述的石棉检测方法，其特征在于: 上述受检物被捕集到滤器中， 进一步包含透明化步骤，该步骤将经过上述接触步骤后的上述滤器透明化，并且 在经过上述透明化步骤后进行上述第I检测步骤。
3.根据权利要求1或2所述的石棉检测方法，其特征在于:至少重复进行I次上述第I检测步骤和上述第2检测步骤。
4.根据权利要求1?3中任一项所述的石棉检测方法，其特征在于:在上述第I检测步骤中，检测长5μπι以上、宽不足3μπκ且长与宽的比例为3:1以上的纤维状物质。
5.根据权利要求2?4中任一项所述的石棉检测方法，其特征在于: 上述石棉结合蛋白是经过上述透明化步骤后维持与石棉的结合的蛋白， 上述荧光标记是经过上述透明化步骤后通过荧光显微镜可以检测荧光的标记。
6.根据权利要求5所述的石棉检测方法，其特征在于:上述石棉结合蛋白是选自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一种以上的蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的石棉检测方法，其特征在于:上述荧光标记是选自Cy3、DyLight488、荧光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550 和 CF555 的一种以上的荧光物质。
8.根据权利要求6所述的石棉检测方法，其特征在于:上述石棉结合蛋白是选自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一种以上的蛋白的多聚体。
9.根据权利要求1?8中任一项所述的石棉检测方法，其特征在于: 在上述接触步骤中，使作为上述石棉结合蛋白的两种以上的不同的石棉结合蛋白与受检物接触， 上述两种以上的不同的石棉结合蛋白是与互不相同的种类的石棉特异性结合的蛋白，并且带有发出互不相同的波长的荧光的荧光标记。
【文档编号】G01N21/64GK103733048SQ201280039165
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2011年8月12日
【发明者】黑田章夫, 石田丈典, 西村智基 申请人:国立大学法人广岛大学