一种检测c型肝炎病毒感染的方法
【专利摘要】本发明涉及在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括同时检测HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体，所述方法使用包括衍生自截短HCV衣壳的抗原性片段的肽来捕获抗衣壳抗体。本发明还涉及用于捕获抗衣壳抗体的肽及包括所述肽的试剂盒。
【专利说明】一种检测C型肝炎病毒感染的方法
[0001] 本发明涉及C型肝炎病毒（HCV)感染的活体外检测及衍生自病毒的衣壳蛋白的抗 原性肽用于此目的的用途。
【背景技术】
[0002] 人们早已认识到，C型肝炎病毒感染尤其在输血中是令人担心的健康问题。
[0003] 为降低输血后的风险，需要在抗体出现之前及在污染后尽可能快地检测病毒本身 的存在。该介于污染与血清转化（即出现抗体）之间的时期被称为"血清学窗口期"。
[0004] 为了找到一种简单、灵敏、特异性、可再现、廉价且容易使用并且可自动进行大规 模筛选以首先检测血清学窗口期期间的HCV抗原、然后监测患者在血清转化后的血清学演 化的方法，已提出检测抗HCV抗体以及检测HCV抗原。
[0005] 然而，主要问题在于存在于血清中的抗HCV抗体与经标记的抗HCV抗体之间存在 干扰。因此，出于检测所给出抗体的目的，在固相上引入具有与被用于同时夹心（sandwich) 检测抗原的经标记的抗体所识别的那些表位相同的表位的靶抗原将使得经标记的抗体不 可逆地固定在固相上，且因此使测试产生假阳性反应。
[0006] 在用于在同一固相上同时检测抗HCV衣壳抗体及HCV衣壳抗原的系统中尤其如 此。因此，出于检测抗HCV衣壳抗体的目的，在固相上沉积具有与被用于检测衣壳抗原的经 标记的抗HCV衣壳抗体所识别的那些表位相同的表位的衣壳抗原可使得经标记的抗体固 定在固相上，且使测试产生假阳性反应。
[0007] 为了解决干扰问题，申请EP1020727(先端生命科学研究所（AdvancedLife ScienceInstitute))提出用于同时测定HCV衣壳抗原及抗HCV衣壳抗体的方法（"组合 (Combo) "型测试），其中用针对衣壳表位的抗体捕获且标记该抗原，所述衣壳表位与用于同 时捕获且检测抗衣壳抗体的衣壳表位不同。该申请给出代表性实施例，其中在以间接分析 夹心检测抗原及抗体的同时分析中，为了检测抗原，使用针对HCV衣壳的第100位氨基酸 (AA)至第130位氨基酸的序列的表位的第一（捕获）抗体以及针对序列AA40-50的表位的 第二（检测）抗体，并且为了检测抗体，所使用的捕获抗原就其本身而言含有序列AA1-42 及AA66-80。
[0008] 专利申请W001/96875 (CHIRON)尤其描述了采用N-月桂基肌氨酸作为洗涤剂来同 时检测衣壳及抗NS3和NS4抗体的分析。其提及用于同时检测衣壳抗原（夹心法）及抗衣 壳和抗非结构HCV蛋白抗体（夹心法，双抗原）的分析。为捕获抗原，使用两种抗体cll-3 及cl1-7,这两种抗体被认为可识别HCV衣壳的延长的N端部分（AA10-53)，并且为了检测， 使用第三抗体cll-14,该第三抗体被认为可识别HCV衣壳的C端部分（AA120-130)。为了 检测抗体，所使用的捕获抗原是与超氧化物歧化酶（"S0D"）的片段融合的具有多个表位的 融合抗原，其含有抗原NS3、NS4、NS5及一系列来自若干HCV菌株的衣壳序列：带有R47L突 变的AA9-53、AA64-88 及AA67-84。
[0009] 专利申请EP1251353 (Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用相同抗体来检测 衣壳的"组合型完全"分析，但并未说明抗体的来源或其表位特异性。抗衣壳抗体通过以下 经修饰（通过诱变）的衣壳抗原来检测：C22KSNV47、48(具有SOD的融合蛋白，其包括第47 和48位氨基酸缺失的衣壳序列AA10-99)或C22KSR47L(具有SOD的融合蛋白，其包括衣壳 序列AA10-99,且在第47位用亮氨酸替代精氨酸）。
[0010] 专利申请W02003/002749 (Abbott)描述了多种抗原及用于检测HCV衣壳抗原的分 析。其以名称"真实组合（RealCombo)"描述的唯一"组合型完全"分析采用被固定于固相 中的对应于衣壳的第11-28位氨基酸的生物素化肽来检测抗衣壳抗体。为了检测衣壳，其 采用在固相中的先端生命科学研究所抗体Cll-14(识别衣壳序列AA45-50)与经吖啶标记 的C11-10(识别衣壳序列AA32-36)的组合。因此，申请W003/002 749通过两个明显分开 即不重叠的衣壳位点（用于检测抗体及抗AA32-36抗体的AA11-28,以及用于检测抗原的 AA45-50)来捕获衣壳抗原并捕获抗衣壳抗体。
[0011]专利申请EPl 310 512 (Ortho-Clinical Diagnostics)描述了使用含有突变衣壳 序列的肽，从而消除了与用于检测HCV感染的测试中所用的HCV特异性小鼠单克隆抗体结 合的可能性。
[0012] 专利申请W02003/095968中所描述的发明的作者通过结构修饰人为地使用于捕 获抗体的靶抗原的某些表位有所不同。然后破坏由此修饰的表位。同时，用于捕获和/或 检测抗原的抗体就其本身而言被选择成使其精确识别存在于患者抗原上的未经修饰的表 位，且从而使得其因此无法与不再具有这些相同表位的经修饰的抗原结合。由于表位不再 相同，用于捕获和/或检测HCV抗原的抗体与患者的抗体之间不再存在竞争。专利申请 W02003/095968更精确地描述了在至少两个分开的表位位点处被突变的HCV衣壳肽，且尤 其描述了肽 1-75(G34-G44-G47)。
【发明内容】
[0013] 本发明人现提出甚至更有利的检测HCV感染的方法。
[0014] 在避免干扰问题的同时，该方法具有极佳灵敏度，允许早期检测，同时容许监测患 者在血清转化后的血清学演化。
[0015] 更精确而言，本发明提供了在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒（HCV)感染 的方法，其包括同时检测HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体，所述方法采用包括衍 生自截短HCV衣壳的抗原性片段的肽来捕获抗衣壳抗体。
[0016] 因此，本发明的一个目标是在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒（HCV)感染 的方法，其包括同时检测存在于生物样品中的HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体， 所述方法包括a)使生物样品与针对所述衣壳蛋白的捕获抗体及能够捕获存在于样品中的 抗衣壳蛋白抗体的捕获抗原接触；b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物； c)检测所形成的抗原-抗体复合物，这任选地采用能够与捕获的衣壳蛋白结合的经标记的 检测抗体和/或任选地也采用能够与针对捕获的衣壳的抗体结合的经标记的检测抗原；所 述方法的特征在于所述捕获抗原是包括衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨 基酸的抗原性片段或由所述抗原性片段组成的肽，所述抗原性片段包括以下序列或由以下 序列组成：i)来自HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第33至36位的至少一个氨基 酸、且优选第34位的氨基酸处具有至少一个点突变的序列，或ii)后者的同源序列。
[0017] 本发明的另一个目标是包括所述抗原性片段的肽。
[0018] 本发明的另一个目标是用于检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒，其包括所 述肽作为抗HCV衣壳抗体的捕获抗原。
【具体实施方式】
[0019] 定义
[0020] 术语"C型肝炎病毒"或"HCV"在本文中涵盖引起C型肝炎的病毒的所有菌株、所 有类型、亚型及基因型。本发明的方法实际上旨在检测任何HCV感染，无论其来源及其基因 型如何。具体而言，这包括在欧洲、美国、日本等流行的病毒的熟知类型及亚型（即6种主 要基因型：1、2、3、4、5、6 及其亚型la、lb、3a等）。参见Stuyver等人（1994) ;Bukh(1995)。
[0021]HCV衣壳蛋白是具有191个氨基酸的蛋白质，其序列为SEQIDNO: 1 :
[0022] Imstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqivggvyllprrgprlgvratrktsersqprg
[0023] 61rrqpipkarqpegrawaqpgypwplygnegmgwagwllsprgsrpswgpsdprrrsrnlg
[0024] 121kvidtltcgfadlmgyiplvgaplggaaralahgvrvledgvnyatgnlpgcsfsifIla
[0025] 181llscltipasa
[0026] 除非另有说明，否则氨基酸定位于衣壳蛋白中（参考序列SEQIDN0:1)，该序列是 基因型1(亚型la、lb、lc)的共有序列。
[0027] 已鉴别出衣壳蛋白的若干表位。尤其已知定位于第16位氨基酸与第40位氨基酸 之间的表位。
[0028] 表述"至多第1位氨基酸至第44位氨基酸"意指具有至多44个氨基酸的肽不延 伸超出序列SEQIDNO: 1的第44位氨基酸，但可任选地缩短，前提是其含有第6-37位序列 (仍参考SEQIDNO: 1)。
[0029] 在本发明背景下，"生物样品"优选由生物流体例如血液、血浆、血清、尿、脑脊液、 唾液等组成。
[0030] 术语"抗体"是指任何全抗体或抗体的功能片段，所述功能片段包括至少一个抗原 识别位点或由至少一个抗原识别位点组成，所述至少一个抗原识别位点允许所述抗体与抗 原性化合物的至少一个抗原决定簇结合。可提及片段Fab、Fab'、F(ab'）2以及链SCFv(单 链可变片段）、dsFv(双链可变片段）等作为抗体片段的实例。这些功能片段尤其可通过遗 传工程来获得。
[0031]用于本发明背景下的单克隆抗体或单特异性多克隆血清是基于常规技术而产生， 其细节在稍后给出。
[0032] "捕获抗体"意指优选固定在固相上的抗体或抗体的一部分，其能够通过亲和结合 来保留存在于生物样品中的HCV抗原。
[0033] 生物样品中抗体及抗原的存在通过特异性标记物来揭露。就抗原检测而言，本发 明尤其构想了通过至少一种"检测抗体"来检测。所述经标记的"检测抗体"能够通过亲和 结合、识别与捕获抗体所识别的表位位点不同的表位位点来结合捕获的抗原。就抗体检测 而言，尤其可使用经标记的抗免疫球蛋白抗体或抗同种型抗体，例如间接ELISA形式中的 抗免疫球蛋白G抗体或夹心形式中的经标记的抗原。
[0034] 捕获抗体和/或检测抗体识别HCV衣壳蛋白的第33-36位部分的天然表位。
[0035] 术语"经标记"是指直接标记（经由酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等） 及间接标记（例如，经由本身经直接标记的抗体或利用经标记的"亲和对"试剂，例如但不 限于经标记的抗生物素蛋白-生物素对等）二者。
[0036] "捕获抗原"意指优选固定在固相上的分离的抗原性片段，其能够被抗HCV抗体识 别且能够允许与后者亲和结合。
[0037] "检测抗原"意指经标记的抗原。其使得可通过竞争来检测捕获的抗原或通过常规 的抗原-抗体-抗原夹心技术（也称为"双抗原夹心"方法）来检测抗体（Maiolini等人 (1978))。
[0038] 术语"特异性的"或"特异性地"在指抗体识别或特异性结合抗原时表示，抗体与 该抗原相互作用且实质上不与其它抗原相互作用，或者如果谈及"特异性"识别表位则指接 近唯一地识别该表位。结合常数优选大于IO8Lmol'
[0039] 术语"同源物"是指包括衍生自HCV衣壳的至多44个氨基酸的抗原性片段的肽。 该抗原性片段包括与HCV衣壳蛋白的至多第1至44位氨基酸的序列不同的序列，该不同之 处在于一个或多个氨基酸的保守取代或在N末端（第1至5位氨基酸）和/或C末端（第 38至44位氨基酸）处的一个或多个氨基酸的缺失。
[0040] 捕获并检测抗体及抗原
[0041] 本发明中所使用的抗体是抗原的特异性抗体，且出于此原因为单克隆抗体或单特 异性多克隆抗体，即其仅特异性识别一个表位。
[0042] 本发明的方法更具体而言涉及抗衣壳抗体的检测，且采用能够固定存在于生物样 品中的抗衣壳抗体的捕获抗原。
[0043] 欲用于捕获抗衣壳抗体的肽包括衍生自HCV衣壳的至多第1至44位氨基酸的抗 原性片段，所述抗原性片段包括HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸的序列或后者的同源序 列。因此应理解，本发明的捕获抗原缺少第45至191位氨基酸（其在HCV衣壳蛋白中通常 存在）。根据【具体实施方式】，可用作本发明捕获抗原的肽的氨基酸序列包括32至44个氨基 酸或由32至44个氨基酸组成，例如由44个氨基酸的序列组成。
[0044] 肽在第33-36位序列中的至少一个氨基酸、且优选第34位氨基酸处具有至少一个 点突变。其可以是用任何非保守氨基酸取代。对于第34位氨基酸而言，优选使用不同于异 亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸残基的氨基酸。优选选择不带电荷的氨基酸。 第34位氨基酸缬氨酸优选被甘氨酸取代。
[0045] 由于捕获抗原性肽的突变，在样品的经固定的抗原-抗衣壳抗体反应与样品的经 固定的抗体-衣壳抗原反应之间不存在干扰。
[0046] 根据优选实施方式，固定在固相上的捕获抗体是针对衣壳蛋白的第33-36位天然 表位的抗体，而在cl)处经直接或间接标记的检测抗体针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的 第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位。例如，其可以是针对 衣壳的第44-47位表位的抗体。
[0047] 根据另一优选实施方式，固定在固相上的捕获抗体是针对与存在于所述HCV衣壳 蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的天然表位不同的表位的抗体，例如其 可以是针对衣壳的第44-47位表位的抗体，而在cl)处经直接或间接标记的检测抗体是针 对衣壳蛋白的第33-36位天然表位的抗体。
[0048] 根据【具体实施方式】，捕获抗原是由HCV衣壳蛋白的第1至44位序列组成且在第34 位的氨基酸处具有点突变、优选为取代成甘氨酸的肽。
[0049] 因此，优选的实例是序列SEQIDNO:2的肽。
[0050] !Mstnpkpqrktkrntnrrpqdvkfpgggqivggg mYllprrgprl
[0051] 也可使用由如上文所定义的序列组成、但此外在N端或c端侧截短1至5个氨基 酸的同源肽。因此，可使用肽6-37,其在第33-36位序列中的至少一个氨基酸、且优选第34 位氨基酸处具有点突变。其优选为序列SEQIDNO:3的肽。
[0052] 6KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGGmYLL37
[0053] 本发明也包括与以上肽的不同之处仅为保守取代的肽。
[0054] 表述"保守取代"表示一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基的任何替代而不改变 该肽的一般构象或抗原性。保守取代包括但不限于被具有相似性质（例如形状、极性、氢键 合电位、酸度、碱度、疏水性等）的氨基酸替代。具有相似性质的氨基酸是本领域技术人员 所熟知的。例如，精氨酸、组氨酸及赖氨酸是碱性亲水性氨基酸且可互换。按照相同方式， 疏水性氨基酸异亮氨酸可被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替代。可彼此替代的中性亲水性氨 基酸包含天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸及苏氨酸。本发明的"经取代"及"经修饰"意指相对 于在自然界中发现的氨基酸已经改变或修饰的氨基酸。
[0055] 因此，在本发明背景下，保守取代是一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸 取代。保守取代的实例在下表1中给出：
[0056] 表1.保守取代I
[0057]
【权利要求】
1. 一种在活体外检测生物样品中的C型肝炎病毒（HCV)感染的方法，其包括同时检测 存在于所述生物样品中的HCV衣壳蛋白及针对所述衣壳蛋白的抗体，所述方法包括a)使所 述生物样品与针对所述衣壳蛋白的捕获抗体及能够捕获存在于所述样品中的抗衣壳蛋白 抗体的捕获抗原接触；b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育混合物；c)检测所形 成的抗原-抗体复合物，这任选地采用能够与捕获的衣壳蛋白结合的经标记的检测抗体和 /或任选地也采用能够与捕获的抗衣壳抗体结合的经标记的检测抗原；所述方法的特征在 于所述捕获抗原是包括衍生自所述HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原 性片段或由所述抗原性片段组成的肽，所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列组成： i)来自所述HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第33至36位的至少一个氨基酸处具 有点突变的序列，或ii)后者的同源序列。
2. 权利要求1的方法，其中所述捕获抗原是在第34位氨基酸处具有点突变的肽。
3. 权利要求2的方法，其中所述捕获抗原是由所述HCV衣壳蛋白的第1至44位序列组 成且在第34位的氨基酸处具有点突变的肽。
4. 权利要求1至3中任一项的方法，其中第34位的氨基酸是甘氨酸残基。
5. 权利要求1至4中任一项的方法，其中将所述捕获抗体及所述捕获抗原固定在固相 上。
6. 权利要求5的方法，其中所述固相还包括至少一种衍生自并非所述衣壳的HCV蛋白 的抗原，优选为NS3或NS4。
7. 权利要求1至6中任一项的方法，其中所述检测抗体在抗原-抗体复合物形成后添 加至所述混合物。
8. 权利要求1至7中任一项的方法，其中使所述检测抗体和/或所述检测抗原与所述 捕获抗体及所述捕获抗原同时与所述生物样品接触。
9. 一种肽，其包括衍生自HCV衣壳的至多第1位氨基酸至第44位氨基酸的抗原性片 段或由所述抗原性片段组成，所述抗原性片段包括以下序列或由以下序列组成：来自所述 HCV衣壳蛋白的第6至37位氨基酸且在第33至36位的至少一个氨基酸处具有点突变的序 列，或ii)后者的同源序列。
10. 权利要求9的肽，其在第34位的氨基酸处具有点突变。
11. 权利要求10的肽，其由所述HCV衣壳蛋白的第1至44位序列组成，且在第34位的 氨基酸处具有点突变。
12. 权利要求9至11中任一项的肽，其中第34位的氨基酸是甘氨酸残基。
13. -种偶联肽，其包括权利要求9至12中任一项的肽，所述肽在其N末端共价结合至 间隔物。
14. 权利要求13的偶联肽，其中所述间隔物是C-Hx，其中C是半胱氨酸且Hx是6-氨 基己酸。
15. 权利要求13和14中任一项的偶联肽，其中如权利要求9至12中任一项所定义的 肽与其本身共价偶合或经由所述间隔物而具有携载分子。
16. -种可用于检测生物样品中的HCV病毒感染的试剂盒，其包括如权利要求9至12 中任一项所定义的肽作为抗HCV衣壳抗体的捕获抗原。
17. 权利要求16的试剂盒，其除了所述捕获抗原外还包括用于检测存在于所述生物样 品中且与所述捕获抗原复合的抗HCV抗体的构件，所述检测构件优选是经标记的抗免疫球 蛋白抗体或抗同种型抗体。
18. 权利要求16和17中任一项的试剂盒，其包括 al)抗HCV衣壳抗体的捕获抗原，其是如权利要求9至12中任一项所定义的肽； a2)优选以及抗非结构蛋白抗体的捕获抗原，所述捕获抗原包括非结构蛋白NS3、NS4 和/或NS5中的一些或全部， b)针对所述HCV衣壳蛋白的捕获抗体； 将所述捕获抗原及所述捕获抗体固定在固相上；以及 cl)经标记的检测抗体， c2) -种或多种抗免疫球蛋白抗体或任选地经标记的检测抗原，所述检测抗原是如权 利要求9至12中任一项所定义的肽。
19. 权利要求16至18中任一项的试剂盒，其包括：抗HCV衣壳抗体的捕获抗体，其被 固定在固相上，针对所述衣壳蛋白的第33-36位天然表位；以及经直接或间接标记的检测 抗体，其针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部分中的 天然表位不同的表位。
20. 权利要求16至18中任一项的试剂盒，其包括：抗HCV衣壳抗体的捕获抗体，其被 固定在固相上，针对与存在于所述HCV衣壳蛋白的第33至36位、更通常为第6至37位部 分中的天然表位不同的表位；以及经直接或间接标记的检测抗体，其针对所述HCV衣壳蛋 白的第33-36位天然表位。
【文档编号】G01N33/569GK104302660SQ201280063508
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】斯特凡·加德勒, 弗朗索瓦·里厄尼耶 申请人:博瑞创新公司