视神经脊髓炎的密码子标签的制作方法

视神经脊髓炎的密码子标签的制作方法
【专利摘要】本发明提供了利用B细胞中的独特密码子标签对受试者视神经脊髓炎(NMO)的诊断和预测，所述标签与NMO相关，而与任何其它自身免疫性疾病无关。更具体的，所述方法可以包括以下步骤：(a)提供来自受试者的含有B细胞的样品，或从其中分离的DNA或RNA；(b)确定来自所述受试者的表达VH1/VH4的B细胞的VH1和/或VH4的结构；(c)确定VH1和/或VH4基因的突变频率；(d)鉴定是否存在与NMO相关或与NMO风险相关的密码子标签；和(e)选择表现所述密码子标签的患者。
【专利说明】视神经脊髓炎的密码子标签
【背景技术】
[0001]本申请要求提交于2011年10月21日的美国临时申请序列号61/550，158的优先权，该申请通过弓I用整体并入本文。
[0002]1.【技术领域】
[0003]本发明涉及病理学、免疫学和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于预测和诊断视神经脊髓炎(NMO)的B细胞抗体基因中的体细胞超变或“标签”型。
[0004]2.相关技术
[0005]视神经脊髓炎(NMO)，又称德维克(Devic)病或德维克综合征，是攻击视神经和脊髓的一种自身免疫性炎疾病。该疾病引起视神经炎症(视神经炎)和脊髓炎症(脊髓炎)。虽然炎症也可能影响脑，但病灶与在相关病症多发性硬化(MS)中观察到的不同。脊髓病灶导致腿或手臂不同程度的无力或瘫痪、感知丧失(包括失明)和/或膀胱和肠的功能障碍。NMO是一种罕见病症，其在几个方面类似于MS，但需要不同的治疗过程以获得最佳效果。至少在一些NMO患者中，自身免疫攻击的可能靶标是神经系统细胞的被称为水通道蛋白(aquaporin)4 的蛋白。
[0006]在身体的免疫系统攻击髓鞘周围的神经细胞方面，NMO与MS类似。与标准的MS不同，认为攻击不是由免疫系统的T细胞介导，而是由所谓的NMO-1gG抗体或简称为NMO抗体介导。这些抗体靶向星形胶质细胞的细胞膜中被称为水通道蛋白4的蛋白，所述水通道蛋白4用作转运水通过细胞膜的通道。水通道蛋白4发现于围绕血-脑屏障的星形胶质细胞的处理过程中，血-脑屏障是负责抑制血液中的物质穿越进入脑中的系统。血-脑屏障在NMO中被削弱，但目前还不清楚NMO-1gG免疫反应如何导致脱髓鞘。
[0007]发明概沭
[0008]本发明的方法鉴定出患有视神经脊髓炎(NMO)或具有形成视神经脊髓炎的风险的人受试者，所述方法包括评估来自所述受试者的表达VHl和/或VH4的B细胞的VHl和/或VH4序列，其中密码子中存在一个或多个与NMO相关的突变时，将所述受试者鉴定为患有NMO或具有形成NMO的风险。更具体地，所述方法可以包括下列步骤:(a)提供来自受试者的含有B细胞的样品，或从其中分离的DNA或RNA ； (b)确定来自所述受试者的表达VHl/VH4的B细胞中VHl和/或VH4的结构；(c)确定VHl和/或VH4基因的突变频率；(d)鉴定是否存在与NMO或与NMO风险相关的密码子标签；和(e)选择表现所述密码子标签的患者。所述样品可以是血液、血清、眼睛流体或眼泪。
[0009]NMO密码子标签可以包含在VHl的密码子47、54、70、79、84和/或91上的突变，或所述VHl密码子中2个、3个、4个、5个或全部6个的突变。NMO密码子标签可以包含在VH4的密码子36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86和/或90上的突变，或所述VH4密码子中2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或全部12个的突变。NMO密码子标签可以包含在VHl的密码子47、54、70、79、84和/或91和在VH4的密码子36、39、45、46、50、
59、61、65、67、70、86和/或90上的突变，或所述密码子中2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个的突变。所述方法还可以包括评估一个或多个传统的NMO风险因子。评估可以包括测序和/或PCR。B细胞可从脑脊液(CSF)或外周血获得。所述方法还可以包括评估J链的使用、J链的长度和/或CDR3的长度。所述方法还可以包括基于所述密码子标签的存在而做出治疗决定。
[0010]在另一个实施方式中，提供了用于治疗视神经脊髓炎(NMO)的药剂的筛选方法，其包括(a)提供由表达VHl和/或VH4的B细胞产生的抗体，所述抗体基因包含选自以下的两个或更多个密码子上的突变=VHl的密码子47、54、70、79、84和VH4的密码子36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86和90 ;(b)使所述抗体与候选配体接触；和(c)评估所述候选配体与所述抗体的结合，其中所述候选配体结合所述抗体时将所述候选配体鉴定为可用于NMO治疗。候选配体可以是肽或拟肽。NMO密码子标签可以包含在VHl和VH4两者中的至少一个或多个突变，如包含所述密码子的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个突变的NMO密码子标签。
[0011]在另一个实施方式中，提供了治疗患有视神经脊髓炎(NMO)或具有形成NMO风险的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用结合VHl或VH4抗体的配体,该抗体包含选自 VHl 的密码子 47、54、70、79、84 和 91 以及 VH4 的密码子 36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86和90的2个或更多个密码子的突变。配体可以是肽或拟肽。配体可以与毒素或B细胞拮抗剂连接。NMO密码子标签可以包含VHl和/或VH4抗体基因上的至少一个或多个突变，如NMO密码子标签，所述NMO密码子标签包含所述密码子中2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个的突变。
[0012]可以理解，本文所述的任何方法或组合物可以用于本文所述的其它方法或组合物方面。
[0013]当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”或“包含”一起使用时，术语“a”或“an”可以是指“一个”，但其也表示“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。
[0014]通过下列描述和附图，将更好地领会和理解本发明的这些和其它实施方式。然而，应当理解，下列描述虽然示出了本发明的各种实施方式和其许多的具体细节，但这是通过示例的方式给出而非限制本发明。可以在本发明的范围内且不脱离本发明的精神下作出许多置换、修饰、添加和/或重排，且本发明包括所有此类置换、修改、添加和/或重排。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]下图构成了本说明书的一部分，并包括在本说明书中用以进一步说明本发明的某些方面。可以通过参考一个或多个附图和本文所述的【具体实施方式】的详细描述，来更好地理解本发明。
[0016]? 1- NMO VHl 和 VH4 标签。
【具体实施方式】
[0017]自1998年以来，许多独立实验室都已证实，表达VH4的B细胞过度出现(overrepresent)于 MS 患者的 CSF(Colombo 等人，2000 ；Monson 等人，2005 ；Owens 等人，2003 ；Qin 等人，1998 ；Ritchie 等人,2004)和脑病灶中(Baranzini 等人，1999 ；Owens 等人，1998)。这一发现最初并不引人注意，原因是发现MS患者的CSF中的克隆扩增的自身反应性B细胞可以利用任何重(和轻)链家族的可变基因(Buluwela and Rabbitts, 1988 ；Humphries 等人，1988 ；Kodaira 等人，1986 ；Lee 等人，1987 ；Shen 等人，1987)。然而，新的证据表明，表达VH4的B细胞群包含自身反应性B细胞(Koelsch等人，2007)，与MS患者中来源于CNS的B细胞群中过度出现的表达VH4的B细胞(Colombo等人，2000 ；Owens等人，2003 ；Qin 等人，1998 ；Ritchie 等人，2004 ；Baranzini 等人，1999 ；Owens 等人，1998 ；Harp等人，2007 ；Owens等人，2007)这一确立的结论组合，促使发明人探究表达VH4的B细胞在MS患者的CSF中的作用。
[0018]为了解决这个问题，本发明人之前将来自13个MS患者的405份源自CSF的B细胞的数据库的库(repertoire)特征和健康对照的数据库的库特征以及数个其它B细胞介导的自身免疫疾病或其它CNS相关病症的数据库的库特征进行了比较。发明人预期，来自MS患者的CSF的表达VH4的B细胞可因与自身反应性相关的特性而丰富，这是由于(i )来自自身免疫性疾病(包括SLE和RA)患者的表达VH4的B细胞因自身反应性而丰富(Pugh-Bernard 等人，2001 ;Zheng 等人，2004 ；Mockridge 等人,2004 ；Voswinkel 等人，1997 ;Hayashi等人，2007 ;Huang等人，1998)，和(ii)来自MS患者的CSF的一些克隆扩增的自身反应性B细胞在其抗体重排中使用了 VH4 (Lambracht-Washington等人,2007)。发明人特别感兴趣的特性是那些已知与自身反应性相关的特性，包括对VH4-34使用的偏好(Zheng等人，2004)，以及受体编辑相关的特性，包括对JH6使用的偏好和长的CDR3长度(Zheng等人，2004 ；Meffre等人，2000)。突变频率降低与受体编辑相关(Meffre等人，2000)，突变靶向减少与MS患者的来自CSF的克隆扩增的B细胞群相关(Monson等人，2005)，因此也包括在分析中。
[0019]为了进行这种VH4特异性分析，发明人构建了大规模的CSF B细胞数据库，其包含13个MS患者的405份来自CSF的B细胞(405CSF_derived B cells)。MS患者的CSF中表达VH4的CD19+B细胞的过度出现是特有的，这是因为并未在来自下列的外周血的B细胞库中观察到VH4过度出现:(i )健康对照供体，(ii )患有其它B细胞参与的自身免疫性疾病，包括全身性红斑狼疮(SLE)或干燥综合征CSj0gren’s syndrome)的患者，或(iii)同一队列(cohort)的MS患者。实际上，对该队列内MS患者的外周血中的那些表达VH4的B细胞的深度分析表明，该组的B细胞可能由于其自身反应潜力(如由高的JH6使用率和长的CDR3长度证明)被识别，而没有进一步的选择(如由低突变频率证明)。本发明人在其它神经系统疾病患者的CSF中也没有观察到表达VH4的B细胞的过度出现，这表明MS患者的CSF中表达VH4的B细胞的过度出现并不是由于表达VH4的B细胞偏好进入CNS的能力。总之，这些数据表明，表达VH4的B细胞被选择到MS患者的CSF B细胞库中，并通过在该群中观察到的高突变频率和增强的突变靶向得到进一步验证。
[0020]在该对比研究中包含的三位CIS患者中，甚至那些在次年转换成CDMS的患者(CIS429和CIS03-01)，在其来自CSF的⑶19+B细胞群中没有VH4家族使用的过度出现。相比之下，在CIS03-01的⑶138+浆细胞中观察到了 VH4过度出现的证据。由于浆细胞和成浆细胞最有可能产生自⑶19+B细胞群(在两个隔室中均可发现相配的克隆)(MartinMdeland Monson, 2007)，有理由假设，在CNS中识别其抗原的表达VH4的B细胞不在存储池中留存长时间，而是通过信号传导迅速分化为成浆细胞和浆细胞。这一假设通过以下也得到了进一步的证实:这些患者的来自CSF的表达VH4的B细胞中缺乏受体编辑(由正常的JH6使用和CDR3长度评估)，以及关于成浆细胞和浆细胞在这些患者的CSF中的高度富集的文献((^pok等人，2005 ；ffinges等人，2007)。这些VH4细胞在疾病进程的开始阶段的失调可能是进行中的发病机制的核心要素。
[0021]本发明人预期，VH4家族使用的增加对应于最频繁用在MS病灶中和在MSCSF中发现的克隆如4-34、4-39和4-59中的特定VH4基因的增加(Monson等人，2005 ；Owens等人，1998)。然而，与发明人所分析的除VH4-34之外的任意队列的PB相比，在表达VH4的CSFB细胞的子数据库中单个VH4基因的使用频率没有差别，VH4-34在SLE和干燥综合征中的使用频率比在MSCSF中高。可能是来自所检查的MS患者的B细胞对多种VH4结合抗原作出反应，而使这些的组合造成无法确定单个基因的增加。另一种可能是，抗原可以结合VH4基因并仅在表达VH4的B细胞中引起超抗原反应，这类似于利用葡萄球菌肠毒素A与表达VH3的B细胞(Domiat1-Saad和Lipsky, 1998)。然而,高突变积累消除了超抗原结合能力(Oppezzo等人，2004)，因此经典的超抗原反应是不太可能的。相比之下，与发明人在本文出现的MSCSF数据库中的描述类似，感染EBV的记忆B细胞往往具有高的突变频率和普遍存在的突变靶向(Souza等人，2007)，但没有报道EBV感染易感性或病毒免疫应答的机制，其相比于其它重链家族表达有利于表达VH4的B细胞。然而，在来自MS患者的CSF的表达VH4的B细胞中观察到的提高的突变频率延续了发明人先前的假设，即来自CSF的B细胞对CNS内抗原的反应在CNS自身中被很大程度的驱动，这表明这种增强的活性中许多发生于来自CSF的表达VH4的B细胞 群中。这些B细胞是否响应自身抗原或有效的外源靶，这仍存在争议。然而，突变分析表明，来自MS患者的CSF的表达VH4的B细胞通过了典型的生发中心，原因是对⑶R和DGYW/WRCH基序的突变靶向是完整的，这与在来自队列的MS患者的单独克隆群中观察到的不同(Monson等人，2005)。此外，在MSCSFVH4子数据库中靶向实际上增加了，这最有可能是因为B细胞在对抗原作出反应中所经历的体细胞超突变的轮数多(由高突变频率证明)。对MS患者的来自CSF的表达VH4的高突变B细胞的抗原特异性的定义，对解析表达VH4的B细胞在MS患者的CSF中的这一独特选择机制是极为重要的。
[0022]MSCSF数据库中的高强度突变积累使发明人能够鉴定VH4取代突变的独特的5密码子标签——密码子31B、40、57、60和69，这在对照数据库中未观察到。在这5个密码子中，对31B特别感兴趣，原因是其以高出预期7倍的频率积累取代突变，这表明这一密码子在抗原-抗体相互作用中起关键作用。可能髓鞘碱性蛋白(MBP)可被排除在这个与该独特抗体标签相互作用的可能抗原的列表之外，原因是与MBP强烈反应的来自CSF的克隆扩增的B细胞之一(Lambracht-Washington等人,2007)利用了不含有密码子31B的VH4-59基因。此外，由于此分析中的其它数据库很少(如果有的话)积累该位置的突变(在HCPB中为0.17% )，可能MS患者来自CSF的表达VH4的B细胞的抗原靶标很大程度上未见于健康供体的外周血中。
[0023]密码子组成也可影响抗体可变区的蛋白结构(Chothia等人，1992)。VH4-34和4-59具有相似结构，其没有密码子3IA或3 IB ;VH4-04、4_B和4_28仅有密码子31A ;而4_30亚基因，4-39、4-61和4-31具有密码子31A和31B两者。此外，需要数个关键的密码子以维持结构；VH4标签密码子均不是改变抗体结构的关键残基(Chothia等人，1992 ；Chothiaand Lesk, 1987)。这推出，相似结构的基因具有相似的抗原结合位点，虽然由于大小、亲水性和周围残基的极性，其确切的定位可能不同。通过Clothia等人(1992)指定的方法，⑶Rl包含残基26至32，原因是这些残基在β折叠框架外并且形成包含在抗原结合口袋中的环，而⑶R2仅包含残基50至58 ;这翻译成密码子30、31B、52、56和57，其都与抗原直接接触，而60在抗原结合口袋和不直接参与抗原结合的另一表面环之间(Chothia等人，1992)。因此，密码子30和52可能是“冷(cold) ”的，以保持抗体与抗原的有效相互作用，而密码子31B(在几个基因上)、56和57中的突变提供了与不同大小、亲水性或极性性质的抗原的更有效结合。目前还不太清楚残基40、69、81和89为何是“热(hot) ”的或残基68为何是“冷”的，以及在这些位置的取代突变如何影响VH4抗原结合(图5)。对这些位置的取代突变的影响的研究，为这些利用VH4的抗体与CNS中自身抗原的相互作用提供了重要线索。
[0024]也可能是残基取代的不同组合影响了与严谨抗原(discreet antigen)的结合。例如，可能密码子A、B和C的取代组合介导了与抗原X的高亲和结合，而密码子BDE的取代介导了与抗原Y的高亲和结合。这解释了不同VH4基因中的取代突变位置的差异；4-31结合抗原X需要密码子位置ABC，而4-39结合抗原Y需要密码子位置BDE。作为支持，发明人发现，不同VH4基因确实在不同水平上选择使用MS标签突变；例如，VH4-30在密码子56和81上具有更多突变，而VH4-39往往更快速地积累密码子31B、50、56和81的突变。
[0025]因此，在分离自MS患者的中枢神经系统的⑶19+B细胞和⑶138+浆细胞中，实质上提高了 VH4家族的使用(Owens等人,2007),但如本文所示,未发生于健康对照、患有其它CNS相关疾病的患者或患有其它B细胞相关的自身免疫性疾病的患者中。MS患者中观察到的VH4过表达是由于VH4家族中许多基因(不是仅VH4-34)的使用的变化，并且突变分析表明，传统生发中心的环境中抗原驱动的选择得到了保留。因此，来自MS患者的CSF的表达VH4的B细胞在该选择水平上未失调。更重要的是，可在MSCSF VH4子数据库中发现独特的11个密码子的印迹的突变特征，而在健康对照外周血或其它神经性疾病患者的来自CSF的B细胞中并未观察到。这个标签，其积累取代突变的频率比健康对照的来自PB的B细胞高7倍，最可能是介导与CNS中存在的抗原有效结合的抗原子标签的组合。
[0026]发明人继续开发这种标签用以在受试者中预测或诊断MS的用途。作为此过程的一部分，发明人寻求确定是否可以使用这种相同的测试策略使NMO患者与MS患者可区分。发明人考虑两种情况。第一，与MS相关的抗体基因标签也可存在于NMO患者中，原因是这两种患者类型的数个临床特征相似。第二，与MS相关的抗体基因标签可能不存在于NMO患者中，虽然这两组患者的数个临床特征相似。由此类推，NMO患者可表现出NMO特有且MS患者的B细胞不表达的体细胞超突变或“标签”型，这也是可能的。
[0027]为了验证这个假设，本发明人分析了 NMO抗体基因数据库，以评估NMO患者是否也带有与MS相关的标签。然后，发明人比较了 MS抗体数据库中的体细胞超突变型与NMO抗体数据库中的体细胞超突变型，以确定密码子是否可被鉴定为在NMO抗体基因中积累体细胞超突变而在MS抗体基因中不积累体细胞超突变。这些分析产生两个结论:(I)与MS相关的标签由NMO患者表达；和(2)NMO患者携带与MS可相区分的标签(图1)。以下段落详细描述了 NMO标签的发现。
[0028]发明人由MS抗体数据库和NMO抗体数据库生成了子数据库，其仅包括那些已导致密码子氨基酸取代的突变。这确保分析集中于导致抗体蛋白本身变化的突变。接着，发明人计算了每个密码子位置的突变频率并使用卡方检验(ch1-square)，以鉴定在MS抗体子数据库中的突变频率与NMO子数据库相比具有统计学差异的密码子位置。该分析鉴定出18个密码子，其在NMO抗体数据库中积累突变的频率高于MS数据库。这些密码子中的6个处于VHl家族的基因中，这些密码子中的12个处于VH4家族的基因中。以下部分提供了对抗体基因家族命名的解释。
[0029]1.VHl 和 VH4
[0030]正常的免疫系统具有产生抗原结合能力不同的数以百万计抗体的能力。免疫球蛋白分子构建的复杂性带来了多样性。这些分子由成对的多肽链(重链和轻链)组成，每个多肽链都包含恒定区和可变区。重链和轻链的可变区的结构通过免疫球蛋白V基因而特异化。重链可变区衍生自被称为VH、D和JH的3个基因节段。在人中，大约有100个不同的VH片段，超过20个D片段和6个JH片段。轻链基因仅有2个片段，VL和JL片段。抗体多样性是VH/D/JH片段与VU几组分的随机组合的结果，附件在随机组合之上的是包括连接多样性和体细胞突变在内的数种机制。
[0031]种系VH基因可以根据前95至101个氨基酸的DNA核苷酸序列的同一性而分成至少6个家族(VHl至VH6)。同一家族的成员通常具有>80%的序列同一性，而不同家族的成员具有小于70%的同一性。这些家族的大小范围为一个VH6基因至估计大于45个VH3基因。此外，存在许多假基因。最近的研究已几乎完成了染色体14q32.13.15上的VH基因座的物理图谱。现在估计，人类VH库由具有约相等数量的假基因的约50个功能性VH片段代表。这些研究估计VH基因座的大小为约llOOkb，这不到先前通过脉冲场凝胶电泳所估计的
2.5至3兆碱基的一半。VHl基因家族包含11个不同的成员:1-02、1-03、1-08、1-18、1-24、l-45、l-46、l-58、l-69、l-e、l-f。VH4 基因家族包含 9 个不同的成员:4-04、4-28、4_30、4-31、4-34、4-39、4-59、4-61、4-B4。
[0032]A.VHl
[0033]本发明涉及对某些B细胞的VHl序列中的“标签”的鉴定。序列标签最初包括残基47、54、70、79、84和91。通过检测序列的这些位置并鉴定一个或多个所述位置的突变，可确定受试者具有形成NMO (而不是MS)的风险，而在另外的因素存在时，确定患有ΝΜ0。
[0034]B.VH4
[0035]本发明涉及对某些B细胞的VH4序列中的“标签”的鉴定。序列标签最初包括残基36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86和90。通过检测序列的这些位置并鉴定一个或多个所述位置的突变，可确定受试者具有形成NMO的风险，而在另外的因素存在时，确定患有NMO。
[0036]I1.核酸及其检测方法
[0037]本发明的另一个方面涉及分离的DNA片段及其在检测受试者的VHl和VH4片段的某些密码子上是否存在突变中的用途。本文所述的许多方法包括基因组DNA、cDNA或mRNA转录物分析中涉及的扩增引物、寡核苷酸探针和其它核酸成分的使用，其是VH4家族基因的种系序列或正常序列、VHl家族基因的种系序列或正常序列。
[0038]术语“核酸”是本领域熟知的。本文所用的“核酸”通常是指包含核碱基的DNA或RNA分子(即链)。核碱基包括，如发现于DNA中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或如发现于RNA中的的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，后者均是术语“核酸”的子类。术语“寡核苷酸”是指长度为约3至约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”是指长度大于约100个核碱基的至少一个分子。“基因”是指基因产物的编码序列及基因产物的内含子和启动子。
[0039]这些定义通常是指单链分子，但在具体的实施方式中也包括部分、基本上或完全与单链分子互补的另外的链。因此，核酸可以包括包含互补链的双链分子或包含分子的特定序列的“互补物”。在某些方面中，核酸编码蛋白或多肽，或其部分。
[0040]A.核酸的制备
[0041]核酸可以通过本领域技术人员所知的任何技术进行制备，如通过化学合成、酶促生产或生物生产制备。合成的核酸(如合成的寡核苷酸)的非限制性实例包括，通过使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学物质的体外化学合成和固相技术来制备，如EP266032中所述，其通过引用并入本文，或通过脱氧核苷H-磷酸酯中间体来制备，如Froehler等人，1986和美国专利5705629所述，其均通过引用并入本文。在本发明的方法中，可以使用一个或多个寡核苷酸。寡核苷酸合成的各种不同的机制已公开于，如美国专利4659774、4816571、5141813、5264566、4959463、5428148、5554744、5574146、5602244 中，其每个均通过引用并入本文。
[0042]酶促生产的核酸的非限制性例子包括，通过诸如酶PCR?在扩增反应中产生的核酸(参见如美国专利4，683，202和美国专利4，682，195，每个均通过引用并入本文)，或通过寡核苷酸合成产生的核酸，如美国专利5645897所述，其通过引用并入本文。生物产生的核酸的非限制性实例包括活细胞中所产生(即复制)的重组核酸，如在细菌中所复制的重组DNA载体(参见如Sambrook等人,2001,其通过引用并入本文)。
[0043]B.核酸的纯化
[0044]核酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯梯度离心、层析柱或通过本领域技术人员已知的任何其它方法进行纯化(参见如Sambrook等人,2001,其通过引用并入本文)。在一些方面中，核酸是药理学上可接受的核酸。药理学上可接受的组合物是本领域技术人员已知的，并在本文中有描述。
[0045]在某些方面中，本发明涉及的核酸是分离的核酸。如本文所用，术语“分离的核酸”是指分离的不含或以别的方式不含一个或多个细胞总的基因组核酸和转录核酸中的大部分的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。在某些实施方式中，“分离的核酸”是指分离的不含或以别的方式不含细胞组分或体外反应组分中的大部分的核酸，所述组分为，例如大分子如脂质或蛋白、小生物分子等。
[0046]C.核酸互补物
[0047]如上所述，本发明包括与核酸互补的核酸。当核酸能够根据标准Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen结合互补原则与另一个核酸碱基配对时,核酸是“互补物”或与另一核酸“互补”。本文所使用的“另一核酸”可以指独立的分子或同一分子的在空间上独立的序列。在优选的实施方式中，互补物是用于核酸多态性检测的杂交探针或扩增引物。
[0048]本文所用的术语“互补的”或“互补物”还指包含连续核碱基序列或半连续核碱基序列(例如，分子中不存在一个或多个核碱基部分)的核酸，所述核碱基序列能够与另一核酸链或双链杂交，即使少于全部的核碱基与相对的核碱基并不是碱基配对的。然而，在一些诊断或检测实施方式中，优选完全互补的核酸。
[0049]D.核酸检测与评估
[0050]本领域技术人容易理解，核酸分子可以是双链分子，并且提及一条链上的特定位点时也指互补链上的相应位点。因此，在多态性位点的定义中，提及核酸分子的正(正义或编码)链上的特定位点的腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、胞嘧啶或鸟嘌呤还旨在(分别)包括核酸分子的互补链的负(反义或非编码)链上的相应位点的胸腺嘧啶(尿苷)、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。因此，可以参照任一链并仍然包括相同的多态性位点，且寡核苷酸可经设计与任一链杂交。在本文中，鉴定多态性位点时，参照正义链，这仅出于方便的目的。
[0051]通常，使用如Jones (1963)中所述的标准技术(其通过引用并入本文)，从取自个体的生物样品如血液、粪便或组织(如肠黏膜)样品中分离核酸混合物。其它合适的组织样品包括全血、唾液、泪液、尿液、汗液、口腔、皮肤和毛发。核酸混合物可以包含基因组DNA、mRNA或cDNA。此外，本领域技术人员理解，mRNA或cDNA制备物不用检测位于内含子或5’和3’非转录区的多态性。
[0052]通过直接扩增个体中存在的基因的一个或两个拷贝中包含多态性位点的靶区域和通过常规方法确定的扩增区域的序列，可以确定多态性位点的核苷酸(或核苷酸对)的情况。本领域技术人员容易理解，当个体在多样性位点是纯合的时，仅检测一条核苷酸的所述位点，而当个体在所述位点是杂合的时，则检测两条不同的核苷酸。多态性可以直接鉴定，称为肯定型鉴定，或者通过推理鉴定，称为否定型鉴定。例如，已知参照群中的SNP是鸟嘌呤和胞嘧啶，对于位点是纯合的个体，该位点可以被肯定的确定为鸟嘌呤或胞嘧啶，或者对于该位点是杂合的个体，该位点可被确定为鸟嘌呤和胞嘧啶两者。或者，所述位点可以被否定的确定为不是鸟嘌呤(因而是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(因而是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
[0053]靶区域可以使用针对寡核苷酸的任何扩增方法进行扩增，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利4965188)、连接酶链式反应(LCR) (Barany等人，1991 ；W090/01069)和寡核苷酸连接法(OLA) (Landegren等人，1988)。在这些类别的方法中用作引物或探针的寡核苷酸应与包含或邻近于多态性位点的核酸的区域特异性杂交。通常，寡核苷酸长度在10至35个核苷酸之间，优选长度在15至30个核苷酸之间。最优选地，寡核苷酸的长度是20至25个核苷酸。寡核苷酸的确切长度将取决于本领域技术人员常规考虑和操作中的很多因素。
[0054]可以使用其他已知的核酸扩增方法，包括基于转录的扩增系统(美国专利5130238 ；EP329822 ;美国专利 5169766 ；W089/06700)和等温法(Walker 等人，1992)，用于扩增靶区域。
[0055]也可以在扩增之前或之后使用本领域已知的数种基于杂交的方法中的一种，分析靶区域的多态性。通常，采用等位基因特异性寡核苷酸实施此类方法。等位基因特异性的寡核苷酸可用作不同标记的探针对，探针对中的一个与靶序列的一个变体完全匹配，而探针对中的另一个与不同的变体完全匹配。在一些实施方式中，使用一组等位基因特异性寡核苷酸或寡核苷酸对一次可以检测多于一个多态性位点。
[0056]等位基因特异性的寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以以两个分子都在溶液中的形式进行，或也可以在寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定于固体支持物上时，进行杂交。结合可以通过例如以下介导:抗体-抗原相互作用、聚-L-赖氨酸、链霉亲和素或亲和素-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学键、UV交联烘烤等。等位基因特异性寡核苷酸可以直接合成于固体支持物上或合成后连接到固体支持物上。适合用于本发明的检测方法的固体支持物包括由硅、玻璃、塑料和纸等制造的基板，其可形成如孔(如96孔板)、载玻片、薄板、膜、纤维、碎屑、盘和珠子。固体支持物可以经处理、包被或衍生，以便于等位基因特异性寡核苷酸或靶核酸的固定。
[0057]个体基因中的一个或多个多态性位点的基因型也可以通过基因的一个或两个拷贝或其片段与核酸阵列和子阵列相杂交来确定，如W095/11995中所述。阵列可包含等位基因特异性寡核苷酸组，其代表了基因型或单倍型中所包含的每个多态性位点。
[0058]多态性的情况还可以使用以下来确定:错配检测技术，所述技术包括但不限于使用核糖核酸探针的RNase A保护法(Winter等人，1985 ；Meyers等人，1985),和识别核苷酸错配的蛋白如大肠杆菌mutS蛋白(Modrich, 1991)。或者,可以通过以下鉴定等位基因变体:单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等人，1989 !Humphries等人，1996)或变性梯度凝胶电泳(DGGE) (Wartell 等人，1990 ；SheffieId 等人，1989)。
[0059]还可以使用聚合酶介导的引物延伸法，鉴定多态性。数个此类方法已在专利和科学文献中有描述。可通过如美国专利5605798中所述的质谱法，检测所延伸的包含多态性的引物。另一个引物延伸的方法是等位基因特异性PCR(Ruano等人，1989 ；Ruano等人，
1991；W093/22456 ；Turki 等人，1995)。
[0060]1.杂交 [0061]使用长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、
60、70、80、90或100个核苷酸，优选17至100个核苷酸，或在本发明的一些方面可达到1_2千个碱基或更长的探针或引物，可以形成稳定的选择性双链分子。通常优选在长度大于20个碱基的相邻延伸段上具有互补序列的分子，以提高所获得的杂交分子的稳定性和/或选择性。通常优选设计用于杂交的核酸分子具有20至30个核苷酸或如果需要则更长的一个或多个互补序列。这样的片段可容易地制得，例如，通过化学手段直接合成片段或通过将所选的序列引入至用于重组生产的重组载体中。
[0062]因此，本发明的核苷酸序列可由于其以下能力而使用:选择性地与DNA和/或RNA的互补延伸段形成双链分子或提供了用于扩增来自样品的DNA或RNA的引物。根据预期的应用，期望使用不同的杂交条件，以实现探针或引物对靶序列的不同程度的选择性。
[0063]对于要求高选择性的应用而言，通常期望使用相对高的严谨条件形成杂合体。例如，相对低盐和/或高温的条件，如由约0.02M至约0.1OM的NaCl、约50°C至约70°C的温度提供的条件。此类高严谨条件容忍探针或引物与模板或靶链之间的很少(如果有的话)错配，并特别适合于分离特定的基因或检测特定的多态性。普遍认为，通过加入数量增加的甲酰胺，可使条件更严谨。例如，在高严谨条件下，与滤膜所结合的DNA的杂交可以于65°C在0.5MNaHP04、7% 十二烷基硫酸钠(SDS)、ImM EDTA 中进行，于 68°C在 0.1XSSC/0.1%SDS 中洗漆(Ausubel 等人，1989)。
[0064]可以通过提高盐浓度和/或降低温度使条件不太严谨。例如，可以由约0.1至
0.25M的NaCl、约37°C至约55°C的温度提供中严谨条件，可以由约0.15M至约0.9M的盐、约20°C至约55°C的温度范围提供低严谨条件。在低严谨条件下，如适度严谨的条件下，洗涤可以在例如42°C、0.2XSSC/0.1% SDS中进行(Ausubel等人，1989)。可以根据所需的结果容易地操控杂交条件。
[0065]在其它实施方式中，杂交可能在下述条件下实现，例如50mM Tris-HCl (pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2U.0mM 二硫苏糖醇，温度在约20°C至约37°C之间。所利用的其他杂交条件可包括约 IOmM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、1.5mM MgCl2，温度为约 40°C至约 72°C。
[0066]在某些实施方式中，使用本发明所定义序列的核酸结合适当的手段如标签来确定杂交是有利的。本领域已知多种适当的指示物，包括能被检测的荧光配体、放射配体、酶配体或其它配体如亲和素/生物素。在优选的实施方式中，可能期望使用荧光标记或酶标签如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性的或其它对环境不利的试剂。在酶标签的情况下，已知能够通过使用比色指示物质提供目视可检测或分光光度可检测的检测手段，从而鉴定与包含互补核酸的样品的特异性杂交。在另一个方面，可以存在特定的核酸酶裂解位点，并可通过是否存在核酸裂解来确定特定核苷酸序列的检测。
[0067]通常，可以预期，本文所述的探针或引物将用作试剂用在溶液杂交中，如用在PCR中，用于检测相应基因的表达或基因型，以及用在使用固相的实施方式中。在涉及固相的实施方式中，测试DNA (或RNA)被吸附或以其它方式固定到所选择的基质或表面上。然后，该固定的单链核酸在所需的条件下与所选的探针进行杂交。所选的条件将取决于具体的情况(取决于，如G+C含量、靶核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的大小等)。本领域技术人员熟知对感兴趣的具体应用的杂交条件的优化。在洗涤杂交分子以去除非特异性结合的探针分子之后，通过测定所结合的标记的量来检测和/或定量杂交。代表性的固相杂交方法公开于美国专利5，843，663,5, 900, 481和5，919，626中。在实施本发明时可以使用的其它的杂交方法公开于美国专利5，849，481,5, 849，486和5，851，772中。这些专利的相关部分和说明书该部分指出的其它参考文献均通过引用并入本文。
[0068]2.核酸的扩增
[0069]作为模板用于扩增的核酸可以根据标准方法(SambiX)Ok等人，2001)从细胞、组织或其它样品中分离。在某些实施方式中，在完整的细胞或组织匀浆或生物流体样品上进行分析，而有或没有进行模板核酸的基本纯化。核酸可以是基因组DNA或部分或全部细胞RNA。当使用RNA时，可能需要首先将RNA转换成互补DNA。
[0070]本文所用的术语“引物”旨在包括能在依赖模板的过程中引导新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是长度为10至20和/或30个碱基对的寡核苷酸，但也可使用更长的序列。引物可以以双链和/或单链形式提供，虽然优选单链形式。
[0071]经设计与对应于可变重链基因座的核酸、其变体或片段选择性杂交的引物对，在允许选择性杂交的条件下与模板核酸相接触。根据所需的应用，可以选择高严谨的杂交条件，这样仅允许与完全互补于引物的序列杂交。在其他实施方式中，杂交可发生在降低的严谨性下，以允许用引物序列扩增包含一个或多个错配的核酸。一旦杂交，模板-引物复合体与一种或多种酶相接触，以促进模板依赖性的核酸合成。进行多个轮次(也称为“循环”)的扩增，直到产生了足够量的扩增产物。
[0072]可对扩增产物进行检测、分析和定量。在某些应用中，检测可以通过可视方法进行。在某些应用中，检测可以包括通过化学发光、掺入放射性标记的放射性闪烁扫描或荧光标记或者甚至通过使用电和/或热脉冲信号的系统来间接鉴定产物(Affymax technology ；Bellus,1994)。
[0073]—些模板依赖性方法可用于扩增给定模板样品中存在的寡核苷酸序列。最熟知的扩增方法之一是聚合酶链式反应(称为PCR?)，其描述于美国专利4，683，195、4，683，202和4，800, 159以及Innis等人，1988中，其均通过引用整体并入本文。
[0074]可用作独立的技术或与其它方法(如PCR)组合使用的引物延伸要求带标记的引物(通常为20-50个核苷酸长)与基因5’端附近的区域互补。引物可以退火至RNA并使用逆转录酶来合成与RNA互补的cDNA，直至到达RNA的5’末端。
[0075]另一种扩增方法是连接酶链式反应(“LCR”)，公开在欧洲申请第320 308号中，其通过引用整体并入本文。美国专利4，883，750描述了用于将探针对结合至靶序列的类似于LCR的方法。也可以使用美国专利5，912，148中所公开的基于PCR?和寡核苷酸连接酶(OLA)(如下详述)的方法。
[0076]可用于实施本发明的扩增靶核酸序列的可选方法公开在美国专利5，843，650、5，846，709,5,846，783,5,849，546,5,849，497,5, 849，547,5, 858，652,5, 866，366、5，916，776,5, 922，574,5, 928，905,5, 928，906,5, 932，451,5, 935，825,5, 939，291 和5，942，391、英国申请2 202 328以及PCT申请PCT/US89/01025中，其均通过引用整体并入本文。PCT申请PCT/US87/00880中描述的Qbeta复制酶也可用作本发明的扩增方法。
[0077]等温扩增法也可用于本发明的核酸扩增中，在该方法使用了限制性核酸内切酶和连接酶，用于实现在限制性位点的链上包含核苷酸5’ _[ α -硫代]三磷酸的靶分子的扩增(Walker等人，1992)。美国专利5，916，779公开的链置换扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一种方法，该方法涉及多轮链置换和合成(即切口平移)。
[0078]其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，其包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等人，1989 ；PCT申请W088/10315，其通过引用整体并入本文)。欧洲申请329822公开了一种核酸扩增方法，该方法包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA (dsDNA)，并且可以用在本发明中。
[0079]PCT申请W089/06700(其通过引用整体并入本文)公开了基于启动子区/引物序列与单链DNA(“ssDNA”)靶的杂交以及随后该序列的多个RNA拷贝的转录的核酸序列扩增方案。该方案是不循环的，即不会由所得到的RNA转录物产生新模板。其它扩增方法包括“RACE” 和“单边 PCR” (Frohman, 1990 ；Ohara 等人，1989)。
[0080]实时聚合酶链式反应，也称为定量实时聚合酶链式反应(qPCR)或动力学聚合酶链式反应，是基于聚合酶链式反应的实验室技术，用于扩增并同时量化DNA靶分子。该方法能够对DNA样品中的特定序列进行检测和定量(拷贝的绝对数目，或当相对于投入的DNA或另外的正常基因进行归一化时的相对量)。
[0081]该过程遵循聚合酶链式反应的基本原理，其主要特点是，在每个扩增循环之后扩增的DNA随其在反应中的积累而被实时定量。两种常见的定量方法使用了插入到双链DNA中的荧光染料和修饰的DNA寡核苷酸探针，所述探针在与互补DNA杂交时发出荧光。
[0082]通常，实时聚合酶链式反应与反转录聚合酶链式反应相组合来量化低丰度的信使RNA (mRNA)，从而使研究人员能在特定时间或在特定细胞或组织类型中量化相对基因表达。虽然实时定量聚合酶链式反应通常按RT-PCR进行销售，但其不应该与反转录聚合酶链式反应(也称为RT-PCR)相混淆。
[0083]DNA结合染料在PCR反应中与所有的双链(ds)DNA结合，引起染料的荧光。因此，DNA产物在PCR过程中的增加导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许对DNA浓度进行定量。然而，dsDNA染料如SYBR Green将与包括非特异性PCR产物(如“引物二聚体”)在内的所有dsDNA PCR产物结合。这可潜在妨碍或阻止对目标靶序列的准确定量。加入荧光dsDNA染料，正常准备反应。
[0084]反应在热循环仪中进行，并且每个循环后，用检测器测量荧光的水平；只有当结合到dsDNA (即PCR产物)时，染料才发出荧光。参照标准稀释物，可确定PCR中的dsDNA浓度。
[0085]如其它实时PCR方法，获得的数值没有与之(即mRNA拷贝/细胞)相关的绝对单位。如上所述，所测DNA/RNA样品与标准稀释物之间的比较仅能给出样品相对于标准物的分数或比例，这仅允许不同组织或实验条件之间的相对比较。为了确保定量的准确性，通常需要将靶基因的表达相对于稳定表达的基因归一化。这能够校正实验样品之间在RNA数量或质量上可能的差异。
[0086]使用荧光报告探针是最准确且最可靠的方法，但也是最昂贵的方法。该方法使用序列基于RNA或DNA的特异性探针仅对包含探针序列的DNA进行定量，因此，使用报告探针显著提高了特异性，并且即便存在一些非特异性DNA扩增也可以进行定量。该方法可能允许多重，即使用具有不同颜色标签的特异性探针在同一反应中对数个基因进行分析，前提是所有基因都以相似效率进行扩增。
[0087]通常，使用在探针的一端具有荧光报告物且在另一端具有荧光猝灭剂的基于RNA的探针，实施所述方法。报告物与猝灭剂的紧邻阻止了其荧光的检测，通过Taq聚合酶的5’至3’的外切酶活性对探针的断裂，破坏了报告物-猝灭剂的紧邻，并因此允许可检测到的荧光的非淬灭释放。因此，由于探针的断裂和报告物的释放，报告探针所靶向的产物在每轮PCR循环的增加导致了荧光的正比例增加。
[0088]正常准备PCR反应(参见PCR)，并加入报告探针。反应开始时，在PCR的退火阶段的过程中，探针和引物退火至DNA靶上。从引物起始新DNA链的合成，并且一旦聚合酶到达探针，其5’ -3-的核酸外切酶将降解探针，使荧光报告物与淬灭剂物理分离，引起荧光增加。
[0089]荧光在实时PCR热循环仪中得到检测并测量，且利用其与产物的指数增加对应的量级增加，来确定每个反应的循环阈值(Ct)。
[0090]传统方法定量基因表达存在许多问题。首先，在Northern印迹上检测mRNA或在凝胶或Southern印迹上检测PCR产物既耗时又不能准确。此外，在20-40个循环的常规PCR反应中，与投入的模板/样品相比，产物的量达到平台期更多地取决于反应混合物中引物的量。
[0091]通过以对数尺度对荧光和循环数作图(这样指数增长的量将产生一条直线)，来确定在反应指数期存在的DNA的相对浓度。确定超出背景的荧光检测的阈值。样品的荧光跨越阈值时的循环称为循环阈值，Ct。由于指数期时DNA的量在每个循环加倍，可以计算出DNA的相对量，例如，Ct值比早3个循环的另一样本具有多23 = 8倍的模板。
[0092]通过将结果与由已知量的RNA或DNA的系列稀释物(例如，未稀释、1: 4、1:16、1:64)的RT-PCR产生的标准曲线相比较，来确定RNA或DNA的量。如上所述，为了准确定量基因表达，用所测定的来自感兴趣基因的RNA的量除以在同一样品中测定的来自持家基因的RNA的量，以对不同样品之间RNA的数量和质量上的可能差异进行归一化。这种归一化允许准确比较不同样品之间感兴趣基因的表达，前提是在归一化中所使用的参考(持家)基因的表达在所有样品之间非常相似。因此，选择参照基因实现这一标准非常重要，并且常常充满挑战，原因是只有很少的基因在一系列不同的条件或组织之间表现相等的表达水平。
[0093]3.核酸的检测
[0094]在任何扩增后，可能需要从模板和/或过量引物分离扩增产物。在一个实施方式中，使用标准方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物(Sambrook等人,2001)。分离的扩增产物可被切出，并从凝胶中洗脱以用于进一步的处理。使用低熔点的琼脂糖凝胶，可以通过加热凝胶移出所分离的条带，然后提取核酸。
[0095]核酸的分离也可以通过本领域已知的离心柱和/或色谱技术来进行。许多种色谱法都可用于本发明，包括吸附、分配、离子交换、羟基磷灰石、分子筛、反相、柱、纸、薄层和气相色谱法以及HPLC。
[0096]在某些实施方式中，扩增产物被可视化，但进行了分离或没有分离。常规的可视化方法包括用溴化乙锭对胶染色并在UV光下使条带可视化。或者，如果扩增产物用放射性标记的或荧光标记的核苷酸整体标记，分离的扩增产物可暴露于X射线胶片或在适当的激发光谱下可视化。
[0097]在一个实施方式中，分离扩增产物后，使带标记的核酸探针与扩增的标记物序列接触。探针优选连接有生色团，但也可以带有放射性标记。在另一个实施方式中，探针连接有结合配偶体，例如抗体或生物素，或携带有可检测部分的结合配偶体。
[0098]在某些实施方式中，利用带标记的探针通过Southern印迹和杂交进行检测。Southern印迹包含的技术是本领域技术人员熟知的(参见Sambrook等人,2001)。前述的一个实例描述于美国专利5，279，721，该专利通过引用并入本文，公开了用于自动电泳和核酸转移的装置和方法。所述装置无需外部操作即可对凝胶进行电泳和印迹，并且非常适合实施本发明的方法。
[0099]在实施本发明时可以使用的其他核酸检测方法公开于美国专利5，840，873、5，843，640,5,843，651,5,846，708,5, 846，717,5, 846，726,5, 846，729,5, 849，487、5，853，990,5, 853, 992,5, 853, 993,5, 856，092,5, 861，244,5, 863，732,5, 863，753、5，866，331,5, 905, 024、5，910, 407、5，912，124、5，912，145、5，919，630、5，925，517、5，928，862,5, 928，869,5, 929，227,5, 932，413 和 5，935，791 中，其均通过引用并入本文。
[0100]4.其它分析或实验
[0101]其它用于遗传筛选的方法也可以在本发明范围内使用，例如，用以检测基因组DNA、cDNA和/或RNA样品的突变。用于检测点突变的方法包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、化学或酶促裂解法、由PCR?扩增的靶区域的直接测序(见上文)、单链构象多态性分析(SSCP)和本领域熟知的其它方法。
[0102]一个筛选点突变的方法基于RNA/DNA或RNA/RNA异源双链上的错配碱基对的RNase裂解。本文所用的术语“错配”定义为在双链RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中的一个或多个未配对或错配的核苷酸的区域。因此，该定义包括因插入/缺失突变以及单个或多个碱基点突变引起的错配。
[0103]美国专利4，946，773描述了 RNase A错配裂解实验，该实验包括单链DNA或RNA测试样品退火至RNA探针上，以及随后用RNase A处理核酸双链。为了检测错配，将根据大小进行电泳分离的RNase A处理的单链产物与经相似处理的对照双链相比较。将包含未见于对照双链中的较小片段(裂解产物)的样品记为阳性。
[0104]其他研究人员已描述了在错配实验中使用RNase I。使用RNase I用于错配检测描述于Promega Biotech的文献中。Promega销售一种包含RNase I的试剂盒,据报道,RNaseI可切割已知的四种错配中的三种。其他人已描述了使用MutS蛋白或其它DNA修复酶用于检测单喊基错配。
[0105]在实施本发明时可使用的检测缺失、插入或取代突变的可选方法描述于美国专利5，849，483,5, 851，770,5, 866，337,5, 925，525 和 5，928，870 中，其均通过引用整体并入本文。
[0106]5.多态性核酸的筛选方法
[0107]进化过程中在生物体的基因组中出现的自发突变通常不会立即传播到该物种的所有成员，由此产生了在物种种群中共存的多态性等位基因。通常，多态性是遗传疾病的病因。已鉴定出数种类型的多态性。例如，可变核苷酸型多态性(VNTR)，由核苷酸的两个或三个核苷酸的重复基序的的自发串联复制产生。如果此类变化改变了限制性内切酶裂解产生的DNA片段的长度，则该变化被称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP广泛应用于人类和动物的遗传分析中。
[0108]另一类型的多态性由单核苷酸的取代产生。此类单核苷酸多态性(SNP)很少导致限制性内切酶位点的改变。因此，SNP很少被限制性片段长度分析检测到。SNP是最常见的遗传变体，每100至300个碱基发生一次，并且已发现数个SNP突变以确实足以引起遗传疾病的方式影响编码蛋白的基因中的单核苷酸。SNP疾病的示例有血友病、镰状细胞贫血、遗传性血色病、迟发性阿尔茨海默病等。
[0109]已经开发了数种筛选多态性的方法，并且在下文列举了一些实例。Kwok和Chen(2003)以及Kwok(2001)提供了其中一些方法的概述；这两篇文献都通过引用并入本文。SNP可以通过使用这些方法的任一种或其合适修改而表征。此类方法包括位点的直接或间接测序、在位点各自的等位基因产生或破坏了限制性位点时使用限制性内切酶、使用等位基因特异性杂交探针、使用特异于由多态性的不同等位基因编码的蛋白的抗体，或任何其它的生化方法。
[0110]1.DNA 测序
[0111]最常用于表征多态性的方法是对侧翼具有多态性和包括多态性的遗传基因座直接进行DNA测序。此类分析可以使用“双脱氧介导的链终止法”(也称为“Sanger法”(Sanger等人，1975))或“化学降解法”(也称为“Maxam-GiIbert法” (Maxam等人，1977)完成。可以使用测序与基因组序列特异性扩增技术如聚合酶链式反应的组合，以便于目标基因的回收(Mullis等人，1986 ;欧洲专利申请50，424 ;欧洲专利申请84，796、欧洲专利申请258，017、欧洲专利申请237，362 ;欧洲专利申请201，184 ;美国专利4，683，202,4, 582，788和4，683，194)，上述所有均通过引用并入本文。
[0112]i1.核酸外切酶耐受
[0113]可以用来确定存在于多态性位点的核苷酸情况的其它方法使用了特异的外切核酸酶耐受性核苷酸衍生物(美国专利4，656，127)。与等位基因序列紧邻3’至多态性位点互补的引物与所研究的DNA杂交。如果DNA上的多态性位点包含了与所存在的具体外切核酸酶耐受性核苷酸衍生物互补的核苷酸，则将通过聚合酶将该衍生物引入到杂交引物的末端。这种引入使引物耐受外切核酸酶的裂解，从而允许对其检测。在知晓耐受外切核酸酶的衍生物的情况时，可以确定DNA的多态性位点上存在的具体核苷酸。
[0114]ii1.微测序法
[0115]用于测试DNA中的多态性位点的其他几个由引物指导的核苷酸引入方法描述于(Komher 等人，1989 ；Sokolov, 1990 ；Syvanenl990 ；Kuppuswamy 等人，1991 ；Prezant 等人，
1992；Ugozzoll等人，1992 ；Nyren等人，1993)。这些方法依赖于带标记的脱氧核苷酸的引入，以区别多态性位点的碱基。由于信号与引入的脱氧核苷酸的数量成正比，同一核苷酸的数条链中出现的多态性产生了与核苷酸的程度成正比的信号(Syvanen等人，1990)。
[0116]iv.溶液中延伸
[0117]法国专利2，650, 840和PCT申请W091/02087讨论了用于多态性位点的核苷酸的情况的基于溶液的方法。根据这些方法，使用与等位基因序列紧邻3’至多态性位点互补的引物。该位点的核苷酸的情况使用带标记的双脱氧核苷酸衍生物来确定，所述衍生物如果与多态性位点的核苷酸互补则被引入到引物末端。
[0118]V.遗传位分析或固相延伸
[0119]PCT申请W092/15712描述了一种使用带标记的终止子和与序列3’至多态性位点互补的引物的混合物的方法。所引入的带标记的终止子与正在评价的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸互补，由此得到鉴定。在此，引物或靶分子被固定于固相。
[0120]v1.寡核苷酸连接实验(OLA)
[0121]这是另一种固相法,该方法使用了不同的方法学(Landegren等人，1988)。所述方法使用了两种寡核苷酸，其能够与靶DNA的单链的邻接序列杂交。这些寡核苷酸之一是生物素化的，而另一个带有可检测的标记。如果在靶分子中发现准确互补的序列，寡核苷酸将会杂交，使其末端邻接，并产生连接物。连接使得可以通过使用亲和素回收带标记的寡核苷酸。基于该方法，还已描述了其它核酸检测实验与PCR的组合(Nickerson等人，1990)。在此，使用PCR实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA对其进行检测。
[0122]vi1.连接酶/聚合酶介导的遗传位分析
[0123]美国专利5，952，174描述了一种也涉及能够与靶分子的邻接序列杂交的两个引物的方法。杂交产物在固定有靶标的固体支持物上形成。在此，发生杂交使得引物彼此以单个核苷酸的间距隔开。在聚合酶、连接酶和含有至少一种脱氧核苷三磷酸的核苷三磷酸混合物存在的情况下孵育该杂交产物，以允许任意对邻接杂交寡核苷酸的连接。连接酶的添加引起产生信号的两个事件，延伸和连接。这产生了比单用延伸或连接的方法高的特异性和低的“噪声”，且与基于聚合酶的实验不同，通过与用于连接至固相的信号的第二杂交和连接步骤相结合，该方法提高了聚合酶步骤的特异性。
[0124]vii1.侵入性切割反应
[0125]可以使用侵入性切割反应评价细胞DNA的特定多态性。一种称为INVADER?的技术采用了此类反应(例如，de Arruda等人,2002 ;Stevens等人,2003,其通过引用并入本文)。通常，有三种核酸分子:1)靶位点上游的寡核苷酸(“上游寡核苷酸”)；2)覆盖靶位点的探针寡核苷酸(“探针”)和3)具有靶位点的单链DNA( “祀”)。上游寡核苷酸和探针不重叠，但它们包含了连续的序列。探针包含供体荧光团如荧光素和受体染料如Dabcyl。上游寡核苷酸3’末端的核苷酸与探针-祀双链的第一个碱基对重叠(“侵入”)。然后，由结构特异性5’核酸酶裂解探针，造成荧光团/猝灭剂对的分离，这提高了能够检测的荧光的量。参见Lu等人(2004)。在一些情况下，实验在固体表面或以阵列形式进行。
[0126]II1.预测和诊断视神经脊髓炎
[0127]A.视神经脊髓炎
[0128]NMO的主要症状是视力和脊髓功能的丧失。对于视神经炎的其它病因，视力障碍通常表现为视敏度(visual acuity)下降，虽然视野缺陷或色觉的丧失可在分离中或者在敏度正式丧失前发生。脊髓功能障碍可导致肌肉无力、感觉降低或丧失膀胱和肠道控制。典型的患者具有腿部(截瘫)或全部四肢(四肢轻瘫)严重的急性痉挛性无力及感官症状，常伴有膀胱控制丧失。
[0129]如上所讨论的，NMO与MS在身体免疫系统攻击髓鞘周围神经细胞方面类似。与标准MS不同，认为所述攻击不是由免疫系统的T细胞介导，而是由称为NMO-1gG或简称为NMO的抗体介导。这些抗体靶向于星形胶质细胞细胞膜中的被称为水通道蛋白4的蛋白，该蛋白用作运输水穿过细胞膜的通道。在血-脑屏障周围的星形胶质细胞的过程中发现了水通道蛋白4，所述血-脑屏障是负责防止血液中的物质穿越进入脑的系统。血-脑屏障在NMO中减弱，但目前并不知道NMO-1gG免疫应答如何导致脱髓鞘。
[0130]对NMO病理的大多数研究都集中在脊髓。脊髓损伤的范围可以从炎症性脱髓鞘至白质和灰质的坏死性损伤。NMO中的炎症性病灶已被归类为II型病灶(补体介导的脱髓鞘)，但其在突出的血管周围分布方面与MS II型病灶不同。因此，炎症型通常与MS中看到的截然不同。
[0131]约20%的单相NMO患者存在永久的视力丧失，且30%存在一条或多条腿的永久性瘫痪。复发NMO的患者中，50%在5年内存在瘫痪或失明。在一些患者中(在一项研究中为33% )，颈部脊髓中的横贯性脊髓炎导致呼吸衰竭并随后死亡。然而，NMO谱由于诊断标准提高而变宽，且治疗方案的选择改善了，作为结果，研究人员认为这些估计将会降低。
[0132]NMO的患病率和发病率尚未确定，部分是因为对疾病的低估且经常与MS混淆。女性比男性更多出现ΝΜ0，女性占超过2/3的患者且其中超过80%具有疾病的复发形式。亚洲人比白种人更多出现ΝΜ0。事实上，已经提出亚洲人的视神经脊髓MS(构成了 30%的日本MS病例)与NMO相同(在日本患者中视神经脊髓和典型的MS之间的差异)。在热带和亚热带地区的土著居民中，罕见MS，但当其出现时，往往是视神经脊髓MS的形式。大多数NMO患者没有受影响的亲属，NMO通常被视为非家族性疾病。
[0133]B.传统诊断
[0134]Mayo诊所在2006年提出了 NMO诊断标准的修订版。新的诊断指南需要两个绝对标准加上三个支持性标准中的至少两个标准:
[0135]绝对标准:
[0136]视神经炎
[0137]急性脊髓炎
[0138]支持件标准:
[0139]发病时脑MRI未满足MS标准
[0140]脊髓MRI具有在3个或更多个椎骨节段上延伸的连续的T2加权信号异常，这暗示脊髓中的相对较大的病灶[0141]NMO-1gG血清阳件状杰:
[0142]NMO-1gG测试检测了存在抗水通道蛋白4抗原的抗体
[0143]在开发NMO-1gG测试后，包括NMO的病症谱被扩展了。现在认为NMO谱由下列组成:
[0144]标准ΝΜ0，根据如上所述的诊断标准
[0145]NMO的有限形式，如纵向延伸的脊髓炎的单个或复发性事件，以及双侧同时的或复发性的视神经炎
[0146]亚洲人的视神经脊髓MS，这种变体可存在如同MS的CNS介入，
[0147]与系统自身免疫疾病相关的纵向延伸脊髓炎或视神经炎
[0148]大脑特定区域如丘脑、室周核和脑干中的与病灶相关的视神经炎或脊髓炎
[0149]NMO是否是一种独特的疾病或者是多发性硬化症的宽谱的一部分还在争论中。最近已经发现，抗病毒免疫应答将MS和NMO区分，但如肝炎或糖尿病，由于MS是异质性病heterogeneous condit1n,其仍然可能被认为是为MS谱的NMO部分。
[0150]根据一些具有合并症的NMO患者的证据，NMO与许多全身性疾病相关。此类合并症包括:胶原血管疾病、自身抗体综合征、感染水痘带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒和HIV，以及暴露于碘氯羟喹和抗结核药物。
[0151]C.样品和制备
[0152]本发明涉及从任何可包含B细胞的样品(液体或组织)中所获得的B细胞中鉴定VHl和VH4序列。特别的，本发明依赖于作为B细胞来源的外周血，考虑到获得的便利性和B细胞的丰富性质。此外，考虑到NMO的CNS含义，脑脊液提供了另一个分析用B细胞的潜在来源。用于分离和分析核酸的方法在上文有提供。
[0153]D.治疗和预防
[0154]基于本文所述的方法所提供的诊断或预测，人们可能希望开始、结束或修改治疗方案。特别的，被诊断为患有NMO或具有形成NMO的风险的受试者可开始治疗方案。治疗的基本目的是在发作后恢复功能、防止再发作和防止残疾。与任何医药治疗一样，NMO管理中所使用的药物存在数个不良作用，且许多可能的治疗仍在研究之中。
[0155]目前，还并未治愈ΝΜ0，但可治疗其症状。一些患者恢复了，但许多人都留下了视觉和肢体的损伤，这可能是严重的。发作用短疗程、高剂量的静脉皮质类固醇如甲泼尼龙IV治疗。当正在发病或不对皮质类固醇的治疗有反应时，血浆去除术可能是一种有效的治疗。这些治疗的临床试验的数量非常小，且大多数没有对照。
[0156]没有对照试验来确定对于预防发作的治疗的有效性。许多医生同意需要长期的免疫抑制来减少发作的频率和严重度，而另一些人则认为正好相反。常用的免疫抑制剂治疗包括硫唑嘌呤(依木兰)加上泼尼松、麦考酚酸吗乙酯加上泼尼松、利妥昔单抗、米托蒽醌、静脉免疫球蛋白(IVIG)和环磷酰胺。单克隆抗体利妥昔单抗正在研究中。在2007年，报道NMO对醋酸格拉替雷和低剂量的皮质类固醇产生反应。通常，在数星期内有一定程度的改善，但残留症状和残疾可持续存在，有时很严重。
[0157]疾病可以是单相的，即一次发作且永久性缓解。然而，至少85%的患者具有该疾病的复发形式并反复发作横贯性脊髓炎和/或视神经炎。在单相形式的患者中，横贯性脊髓炎和视神经炎同时发生或彼此在数天内发生。另一方面，具有复发形式的患者在初始发作之间更可能具有数周或数月，并且在初始的横贯性脊髓炎事件之后更可能具有更好的运动恢复。复发通常较早发生，约55%的患者在第一年复发，90%的患者在前5年内复发。与多发性硬化症不同，NMO很少有继发进展期，继发进展期内的患者在发作之间具有增加的神经衰减且无缓解。相反，残疾产生于急性发作。
[0158]本发明还涉及使用新的治疗药剂，即与本文所述的改变的VH1/VH4基因结合的抗体或肽/类肽，以治疗NMO。VH1/VH4抗体治疗剂可利用熟知的技术来制备并筛选反应性。可以施用充当“模拟位”的肽和类肽或表位模拟结构，并用以使VH1/VH4产物隔离病理学的相互作用。参见 Reimer&Jensen-Jarolim(2007)。
[0159]IV.实施例
[0160]下列实施例用于证明本发明的优选实施方式。本领域技术人员理解，以下实施例所公开的技术代表了发明人所发现的代在实施本发明时发挥良好功能的技术，并因此可被认为构成了本发明的最佳实施方式。然而，在本发明的基础上，本领域技术人员理解，能够对所公开的【具体实施方式】进行许多改变而仍然获得类似或相似的结果，且并不脱离本发明的精神和范围。
[0161]实施例1-材料和方法
[0162]NMO抗体数据库获自Jeff Bennett,其是来自Colorado-Denver大学的NIH研
究人员，在2009年发表了对这些库的分析(Bennett等人，Ann Neurol.2009 ^--月；
66(5):617-29)。除 了使用新软件(设计执行者Dr.Lindsay Cowell, UTSWMC)来整合进行最终分析所需的基于Excel的合适的电子表格外，按照发明人之前利用MS-AGS所建立的，对序列数据库进行抗体基因分析。通过首先排除来自NMO患者的抗体基因的组合池中的，在该密码子位置不引起氨基酸取代的突变，来完成最终分析。接着，计算每个密码子位置的突变频率并与我们MS抗体数据库中每个密码子位置的突变频率进行比较。将与MS抗体数据库相比，在NMO抗体数据库中的突变频率较高的密码子位置均集中到单独的列表中。然后，将该单独列表与我们的健康对照抗体数据库进行比较。将与健康对照抗体数据库相比，在NMO抗体数据库中保持较高突变频率的密码子位置均集中到最终的密码子列表中，该列表的密码子的突变累计高于MS抗体基因或健康对照抗体基因。这些密码子是NMO特异性抗体基因标签(AGS-NMO)的框架。然后，按照本发明人曾用AGS-MS所进行的，发明人计算了每个病人的分数，但使用了这组密码子产生数值。
[0163]实施例2-结果
[0164]仅使用VH4基因的AGS-NMO该分析产生了来自VH4抗体基因的12个密码子，与MS或HC抗体数据库相比，该密码子在NMO抗体数据库中具有的累计突变具有更高的统计学量级。所述 VH4 密码子为:36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86、90。NMO 队列的平均 AGS-NM0分数为1.681(范围为1.33至2.27)。MS队列的平均AGS-NMO分数为0.731 (范围为0.07至1.13)。HC队列的平均AGS-NMO分数为0.669 (范围为0.30至1.10)。如预期，MS队列的AGS-NMO分数在统计学上低于NMO队列的(0.73比1.68，p = 0.018)。HC队列的AGS-NMO分数在统计学上低于NMO队列的(0.68比1.68，p = 0.021)。
[0165]仅使用VHl基因的AGS-NMO该分析产生了来自VHl抗体基因的6个密码，与MS或HC抗体数据库相比，该密码子在NMO抗体数据库中具有的累计突变具有更高的统计学量级。所述VHl密码子为:47、54、70、79、84、91。NMO队列的平均AGS-NMO分数为1.319(范围为0.57至2.17)。MS队列的平均AGS-NMO分数为0.369 (范围为0.09至0.71)。HC队列的平均AGS-NMO分数为0.473 (范围为0.00至0.67)。如预期，MS队列的AGS-NMO分数在统计学上低于NMO队列的(0.37对1.32，P = 0.006)。HC队列的AGS-NMO分数在统计学上低于 NMO 队列的(0.47 比 1.32，P = 0.006)。
[0166]组合使用VHl和VH4基因的AGS-NMO当根据VHl和VH4密码子的组合计算AGS分数时，NMO队列的平均AGS-NMO分数为2.786 (范围为1.75至4.17)。MS队列的平均AGS-NMO分数为1.009 (范围为0.16至1.83)。HC队列的平均AGS-NMO分数为0.873 (范围为0.00至1.73)。如预期，MS队列的AGS-NMO分数在统计学上低于NMO队列的(1.01比2.79，P =
0.0006)。HC队列的AGS-NMO分数在统计学上低于NMO队列的(0.87比2.79，P = 0.0005)。
[0167]实施例3-讨论
[0168]总之，本发明人使用了发现用于MS的AGS的方法来鉴定将NMO与MS、HC和其它神经学疾病区分开来的AGS。在我们的方法中进行了一些修改以进一步提炼用于NMO的AGS，包括如上所述使数据预过滤通过“仅为取代”的筛选和分数的归一化，以考虑每个样品的抗体基因库中的序列数。
[0169]基于本发明公开的内容，可以进行和实施本文所公开和要求保护的所有组合物和/或方法，而不需要过度实验。虽然根据优选实施方式对本发明的组合物和方法进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见是，可对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。某些化学和生理上相关的试剂可以取代本文所述的试剂，仍然获得相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代和修饰都被认为涵盖在由所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。
[0170]V.参考文献
[0171]下列参考文献，以提供了作为本文描述的那些的补充的示例性程序或其它细节的程度，明确通过引用并入本文:
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【权利要求】
1.选择患有视神经脊髓炎(NMO)或具有形成视神经脊髓炎风险的人类受试者的方法，所述方法包括: (a)提供来自受试者的含有B细胞的样品或从其中分离的DNA或RNA； (b)确定所述受试者表达VH1/VH4的B细胞的VHl和/或VH4结构； (c)确定VHl和/或VH4基因的突变频率； (d)鉴定与NMO有关或与NMO风险有关的密码子标签的存在与否；和 (e)选择显示所述密码子标签的患者。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述NMO密码子标签包含在VHl中的密码子47、54、.70、79、84和/或91上的突变。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述密码子标签包含2个、3个、4个、5个或全部6个所述密码子的突变。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述NMO密码子标签包含在VH4中的密码子36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86 和 / 或 90 上的突变。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述密码子标签包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或全部12个所述密码子的突变。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述NMO密码子标签包含VHl的密码子47、54、70、.79,84 和 / 或 91 上的突变和 VH4 的 密码子 36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86 和 / 或 90上的突变。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述密码子标签包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个所述密码子的突变。
8.如权利要求1所述的方法，其进一步包括评估一个或多个传统的NMO风险因子。
9.如权利要求1所述的方法，其中，评估包括测序。
10.如权利要求1所述的方法，其中，评估包括PCR。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述B细胞从脑脊液(CSF)获得。
12.如权利要求11所述的方法，其进一步包括评估J链的使用、J链的长度和/或CDR3的长度。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述B细胞从外周血获得。
14.如权利要求13所述的方法，其进一步包括评估J链的使用、J链的长度和/或CDR3的长度。
15.如权利要求1所述的方法，其进一步包括基于所述密码子标签的存在而做出治疗决定。
16.筛选可用于治疗视神经脊髓炎(NMO)的药物的方法，包括: (a)提供由表达VHl或VH4的B细胞产生的抗体,所述抗体包含在选自以下2个或更多个密码子上的突变:VH1的密码子47、54、70、79、84或VH4的密码子36、39、45、46、50、59、.61、65、67、70、86 和 90 的密码子； (b)使所述抗体接触候选配体；和 (c)评估所述候选配体与所述抗体的结合， 其中将所述候选配体与所述抗体的结合鉴定为所述候选配体可用在NMO的治疗中。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述候选配体是肽或类肽。
18.如权利要求16所述的方法，其中，NMO密码子标签包含在VHl抗体和VH4抗体两者中的至少一个突变。
19.如权利要求16所述的方法，其中，NMO密码子标签包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或所有18个所述密码子的突变。
20.治疗患有视神经脊髓炎(NMO)或具有形成视神经脊髓炎风险的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用结合VHl抗体或VH4抗体的配体,所述抗体包含在以下两个或更多个密码子上的突变:VH1的密码子47、54、70、79、84或VH4的密码子36、39、45、46、50、59、61、65、67、70、86 和 90。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述配体是肽或类肽。
22.如权利要求20所述的方法，其中，NMO密码子标签包含在VHl和VH4两者中的至少一个突变。
23.如权利要求20所述的方法，其中，NMO密码子标签包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个所述密码子的突变。
24.如权利要求20所述的方法，其中，所述配体连接有毒素或B细胞拮抗剂。
25.如权利要求18或22所述的方法，其包括在VHl抗体和VH4抗体两者中的多重突变。
【文档编号】G01N33/564GK104040344SQ201280063835
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2011年10月21日
【发明者】南希·蒙森 申请人:德克萨斯系统大学评议委员会