对聚糖具有高亲和力和选择性的lambody及其用途
【专利摘要】本发明涉及由这样的亚基组成的二聚蛋白质，所述亚基具有与(ii)多聚化结构域连接的(i)重组七鳃鳗可变淋巴细胞受体(VLR)多变区。所述二聚蛋白质表现出对糖基化抗原的结合特异性，并且其可用于从样品中检测或分离聚糖的方法，以及用于疾病诊断、预后、进展监测、治疗和成像的方法。
【专利说明】对聚糖具有高亲和力和选择性的I ambody及其用途
[0001] 联邦政府赞助的研究与开发声明 本发明使用国家科学基金授予的基金号MCB0614672下的政府支持进行。政府在本发 明中具有一定权利。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及由这样的亚基组成的二聚蛋白质，所述亚基具有与（ii)多聚化结构 域连接的（i)重组七鳃鳗可变淋巴细胞受体（VLR)多变区。所述二聚蛋白质表现出对糖基 化抗原的结合特异性，并且其可用于从样品中检测或分离聚糖的方法，以及用于疾病诊断、 预后、进展监测、治疗和成像的方法。
[0003] 发明背景 蛋白质的糖基化为翻译后修饰的最常见和多样化的形式。其可深度影响处于正常和病 理状态中的糖蛋白的功能，例如处于细胞-细胞粘附、受:精、炎症和恶变中的糖蛋白的功能 (Varki等，2009)。大多数人肿瘤细胞表达具有异常糖基化模式的糖蛋白。研究最多的癌症 特异性聚糖为截短的0-聚糖，例如τ-新抗原（Tn ;GalNAc α )和Thomsen-Friedenreich泛 癌（pancarcinoma)肿瘤相关的糖抗原（TFa、Gal β l_3GalNAcaa 1-Ser/Thr)，其在约 90% 的人癌细胞中独特地修饰粘蛋白型糖蛋白，但在除早期妊娠的胎盘之外的正常组织中显然 为不存在的。这类癌症特异性聚糖的存在可指示增加的侵袭力和转移可能性。
[0004] 因此，糖结合蛋白质作为监测聚糖表达的工具用于大范围的基础研究和临床应 用，具有巨大效用。例如，已使用许多糖结合凝集素和哺乳动物抗体来检测肿瘤相关的糖抗 原表达，以用于诊断和预后目的（Powlesland等，2009 ;Li等，2010 ;Almogren等，2012)。聚 糖结合蛋白质亦可用于多种体内应用，例如靶定特定细胞和组织以用于成像、用于药物递 送以及控制糖介导的过程。遗憾的是，大多数可容易得到的聚糖结合蛋白质，例如植物和动 物凝集素以及哺乳动物抗体，通常显示广泛的反应性、特异性差或二者。例如，特异性识别 Thomsen-Friedenreich抗原的大多数单克隆抗体（mAb)为IgM同种型的，其为具有相对低 亲和力的大型抗体，并因此具有受限的临床效用（Almogren等，2012)。此外，对于人糖组预 估的7, 000余种聚糖决定簇，仅可获得用于其一小部分的糖结合蛋白质（Cummings，2009)。 因此，产生对任何关注聚糖具有高亲和力和选择性的定制聚糖结合蛋白质的方法可革新所 述领域。
[0005] 已评估用于获得聚糖结合受体的许多策略。最常用的方法涉及用适当的聚糖或糖 缀合物使动物免疫以产生mAb (Rittenhouse-Diakun等，1998 ;Li等，2010)，但此过程可能 是缓慢且劳动密集的。此方法在某些情况下效果较好，但许多关注的聚糖在物种之间为保 守的，并因此为非免疫原性的。其它方式包括凝集素（Powlesland等，2009 ;Hu等，2012)以 及单链Fv抗体（scFv) (Ravn等，2007 ;Sakai等，2010)、小肽糖受体（Boltz等，2009)和糖 结合适体（Sun等，2010)的定向进化，但这些方法并未证明为一般方法并且并未得到广泛 使用。因此，仍极其需要简单、有效且通用的方法。
[0006] 发明概述 本发明描述了新的二聚聚糖结合蛋白质类别的成员，其表现出对糖基化抗原的结合特 异性。这些称为lambody的二聚蛋白质由两个lambody亚基组成。各亚基为这样的融合蛋 白，其包含与允许lambody亚基二聚化的多聚化结构域连接的来自重组七鳃鳗可变淋巴细 胞受体（VLR)的多变区。本发明亦阐述了 lambody在从样品中检测或分离聚糖的方法中的 用途，以及在疾病诊断、预后、进展监测、治疗和成像的方法中的用途。
[0007] 在第一方面，本发明关注lambody亚基，其中所述lambody亚基为这样的融合蛋 白，其包含与多聚化结构域连接的七鳃鳗VLR多变区。本发明的lambody亚基表现出对聚 糖、糖脂或糖蛋白的结合特异性。在一些实施方案中，所述lambody亚基包含选自SEQ ID NO: 2或4氨基酸序列的VLR多变区。
[0008] 在第二方面，本发明关注lambody,其中所述lambody包含经由其多聚化结构域二 聚化的两个lambody亚基。本发明的lambody亦表现出对聚糖、糖脂或糖蛋白的结合特异 性。在此方面的一个实施方案中，所述lambody表现出对祀聚糖、糖脂或糖蛋白至少约1 X 10_7 Μ的结合亲和力（KD)。在一些实施方案中，所述lambody亚基包含具有相同氨基酸序列 的VLR多变区。在一些实施方案中，所述lambody亚基包含具有不同氨基酸序列的VLR多 变区。在一些实施方案中，所述lambody亚基包含选自SEQ ID N0: 2或4氨基酸序列的VLR 多变区。在一些实施方案中，所述两个lambody亚基均包含SEQ ID N0: 5、6、7或8中所述 的氨基酸序列。
[0009] 在第三方面，本发明关注lambody多聚体，其中所述lambody多聚体包含经由其多 聚化结构域多聚化的三个或更多个lambody亚基。本发明的lambody多聚体亦表现出对聚 糖、糖脂或糖蛋白的结合特异性。
[0010] 在第一、第二和第三方面的实施方案中，所述聚糖、糖脂或糖蛋白为选自以下的 一个或多个成员：甘露糖、Τη泛癌抗原（GalNAc a )、N-轻乙酰神经氨酸（Neu5Gc α )、轻 化 Ν-乙醜神经氨酸（Neu5Ac)、TF a、Lewis A [Gal β 1-3 (Fuc α 1-4) GlcNAc β ]、Lewis X [Gal@ l-4(Fuca l-3)GlcNAc@]、聚-Man-9、去唾液酸绵羊颌下腺粘蛋白（aOSM)、血型H 3 型三糖（BG-H3)、Thomsen-Friedenreich泛癌肿瘤相关的糖抗原（TF α )、TF α -丝氨酸、糖 蛋白gpl20和聚-Man9 (甘露糖）。在具体的实施方案中，所述聚糖、糖脂或糖蛋白为选自 以下的一种或多种：BG_H3、TFa、TFa-丝氨酸、糖蛋白g P120和聚-Man9。 toon] 在第四方面，本发明关注用于从样品中分离含聚糖成分的方法，所述方法包括（i) 使lambody亚基、lambody或lambody多聚体粘附于支持物，（ii)在允许样品中的含聚糖成 分与所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体结合的条件下，使所述支持物与样品接 触，（iii)从支持物上洗去未结合的样品，（iv)从支持物上洗脱所述含聚糖成分，和（v)收 集所述含聚糖成分。在一个实施方案中，所述支持物为柱中的珠粒。
[0012] 在第五方面，本发明关注用于在来自受试者的生物样品中检测聚糖、糖脂或糖蛋 白的方法，所述方法包括使来自受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多 聚体接触并检测所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与样品中聚糖、糖脂或糖蛋 白的结合。在此方面的一个实施方案中，所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与可 检测标记缀合。在此方面的另一个实施方案中，使用标记的第二结合部分检测所述lambody 亚基、lambody或lambody多聚体，所述第二结合部分结合所述lambody亚基、lambody或 lambody多聚体。
[0013] 在第六方面，本发明关注用于在受试者中诊断癌症的方法，所述方法包括（a)使 来自受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触，所述lambody 亚基、lambody或lambody多聚体结合与癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白，和（b)检测所述 lambody亚基、lambody或lambody多聚体与样品中聚糖、糖脂或糖蛋白的结合。在此方面 的一个实施方案中，所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与可检测标记缀合。在 此方面的另一个实施方案中，使用标记的第二结合部分检测所述lambody亚基、lambody或 lambody多聚体，所述第二结合部分结合所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体。 在又一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺腺癌、大细胞癌、鳞状细胞癌、前列腺腺 癌或结肠腺癌。
[0014] 在第七方面，本发明关注用于对患有癌症的受试者进行预后的方法，所述方法包 括（a)使来自患有癌症的受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接 触，所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体结合与受试者的癌症相关的聚糖、糖脂 或糖蛋白，（b)测定在（a)中结合的lambody亚基、lambody或lambody多聚体的量，（c)将 (b)中测得的量与先前在对照样品中确定的一个或多个量进行比较，和（d)基于（c)中的比 较进行受试者的预后。在此方面的一个实施方案中，所述lambody亚基、lambody或lambody 多聚体与可检测标记缀合。在此方面的另一个实施方案中，使用标记的第二结合部分检测 所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体，所述第二结合部分结合所述lambody亚基、 lambody或lambody多聚体。在又一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺腺癌、大细 胞癌、鳞状细胞癌、前列腺腺癌或结肠腺癌。
[0015] 在第八方面，本发明关注用于在受试者中监测癌症进展的方法，所述方法包括（a) 使来自患有癌症的受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触，所 述lambody亚基、lambody或lambody多聚体结合与受试者的癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋 白，（b)测定在（a)中结合的lambody亚基、lambody或lambody多聚体的量，和（c)将（b) 中测得的量与先前在来自所述受试者的生物样品中确定的一个或多个量进行比较。在此方 面的一个实施方案中，所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与可检测标记缀合。 在此方面的另一个实施方案中，使用标记的第二结合部分检测所述lambody亚基、lambody 或lambody多聚体，所述第二结合部分结合所述lambody亚基、lambody或lambody多聚 体。在又一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺腺癌、大细胞癌、鳞状细胞癌、前列腺 腺癌或结肠腺癌。
[0016] 在第九方面，本发明关注用于在受试者中使癌症成像的方法，所述方法包括向受 试者给予标记的lambody亚基、lambody或lambody多聚体，并在所述受试者中检测所述 lambody 亚基、lambody 或 lambody 多聚体，其中所述 lambody 亚基、lambody 或 lambody 多 聚体结合癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白。在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺 腺癌、大细胞癌、鳞状细胞癌、前列腺腺癌或结肠腺癌。
[0017] 在第十方面，本发明关注用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向患 有癌症的受试者给予治疗上有效量的lambody亚基、lambody或lambody多聚体，其中所述 lambody亚基、lambody或lambody多聚体结合与所述受试者的癌症相关的聚糖、糖脂或糖 蛋白。在一个实施方案中，所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与诸如化学治疗 剂等治疗剂缀合。在又一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺腺癌、大细胞癌、鳞状 细胞癌、前列腺腺癌或结肠腺癌。
[0018] 在本发明的相关方面，所述生物样品为选自以下的一种或多种：体液、分泌物或排 泄物、细胞、组织或组织活检。在本发明的相关方面，所述生物样品亦可以是选自以下的一 种或多种：全血、血浆、血清、粘液、脑脊液、胸膜液、尿、泪、唾液、痰和粪便。
[0019] 在本发明的方法方面，所述lambody可以是由数对下列lambody亚基之一组成的 lambody ：VLRB. aGPA. 23-AGmFc (SEQ ID NO: 5), VLRB. aGPA. 23-GCN4 (SEQ ID NO: 6), VLRB. gpl20. 4-AGmFc (SEQ ID NO: 7)或 VLRB. gpl20. 4-GCN4 (SEQ ID NO: 8)。或者，所述 lambody 可由数对这些lambody亚基的变体组成，所述变体如本文对于lambody亚基的变体所定 义。在又另外的方面，本发明的各方法可使用具有对聚糖、糖脂或糖蛋白的结合特异性的 lambody亚基、lambody或lambody多聚体来实施，所述聚糖、糖脂或糖蛋白由癌症展示，但 在对应的正常细胞或组织中未展示或以降低的水平展示。因此，本发明的方法可使用未在 本文中具体公开的lambody亚基、lambody或lambody多聚体来实施。
[0020] 上文已相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以使接下来的本发明的详述 可得到更好的理解。本发明另外的特征和优点将在本文中阐述，其形成本发明的权利要求 的主题。本领域技术人员应理解的是，本文所公开的任何构想和具体实施方案，均可容易地 用作修改或设计用于实施相同的本发明目的的其它结构的基础。本领域技术人员亦应认识 到的是，这类等同的构造不会背离如在随附权利要求中所述的本发明的精神和范围。认为 是本发明所特有的新特征（就其组构和操作方法二者而言），连同另外的目标和优点，当结 合附图考虑时将从下列描述中得到更好的理解。然而，要明确理解的是，任何描述、附图、实 施例等，仅提供用于说明和描述的目的，而决不意图其定义本发明的限制。
[0021] 附图简述 图1.将七鳃鳗种系VLR基因装配为成熟的VLR。所述种系基因为无功能的，仅由不变 部分组成：N-端信号肽（SP)、完整的或3' -截短的LRRNT部分、1或2个非编码间插序列、 1或2个截短的LRRCT部分以及包含糖基磷脂酰肌醇（GPI)膜锚定基序的柄状C端，所述 锚定基序将VLR约束于淋巴细胞表面。成熟VLR基因的多变区由以下组成：27-34个残基 的LRRNT，1个25个残基的LRR (LRR1)、至多9个24个残基的LRR (LRRV，末端LRRV命名为 LRRVe)，1个16个残基的截短的LRR (命名为CP)，和48-63个残基的LRRCT。成熟的VLR 基因通过经由类似基因转换的过程自位于各基因侧翼的数百个盒的阵列（未显示）序贯插 入LRR编码盒到不完整的种系基因中而装配。LRRNT和LRRCT的种系VLR基因部分充当用 于引入的LRR盒的停泊位点。
[0022] 图2.糖缀合物对于两种抗aGPA VLR克隆的选择性的流式细胞术分析。来自与用于 在指定浓度下标记的去唾液酸-GPA、GPA、TF α -PAA、TF β -PAA、岩藻糖-PAA和甘露糖-PAA 的配体结合的标记强度的点图描述和Υ-平均荧光强度的测定（Υ-平均值〈3表示未结合）。 所有抗原均为生物素化的并使用藻红蛋白缀合的链霉抗生物素（SA-PE)检测。所述合成聚 糖为聚丙烯酰胺（ΡΑΑ)缀合物。VLR表面展示的水平通过使用大鼠抗FLAG mAb接着抗大鼠 Alexa 488抗体标记来检测。
[0023] 图3.人正常组织和癌组织的lambody染色。1.正常肺和肺癌。2.正常肺和肺腺 癌。3.&4.正常前列腺和前列腺腺癌。将组织微阵列载玻片与5 yg/mLVLRB.aGPA. 23-mFc 一起于4°C下孵育过夜，并使用抗小鼠 IgG-HRP和DAB底物（棕色）检测免疫复合物，然后 用苏木精（蓝色）复染。以5x放大率获取照片。
[0024] 图4.人正常组织和癌组织的lambody染色。（a)正常肺（邻接肿瘤）。（b)大细胞 癌。（c&d)鳞状细胞癌。（e)正常结肠（邻接肿瘤）。（f)结肠腺癌。（g)正常前列腺。（h) 前列腺腺癌。以20x放大率扫描图像。将组织微阵列载玻片与5 μ g/mL VLRB. aGPA. 23-mFc 一起于4°C下孵育过夜，并使用抗小鼠 IgG-HRP和DAB底物（棕色）检测免疫复合物，然后 用苏木精（蓝色）复染。
[0025] 图5.使用VLRB.aGPA. 23检测人肺癌。（a)对肺肿瘤和邻接正常肺组织的染色概 述（n=112)。基于对各组织核的阳性染色细胞部分的图像分析分数来对样品分级。阳性染 色-对各组织合并的中高强度分数；阴性染色-对各组织合并的未染色和低强度分数。非小 细胞肺癌（NSCLC ;n=88)的病例为灰色阴影。（b) NSCLC患者的总生存率和经VLRB. aGPA. 23 染色之间的关系。阳性染色样品（n=24 ;较浅的灰色，下线）与阴性染色样品（n=64 ;较深的 灰色，上线）相比较的Kaplan-Meier曲线。插图：使用Mantel-Cox对数秩（log-rank)卡 方检验计算的P值。
[0026] 图6. VLRB. aGPA. 23的聚糖结合特性，显示所识别的四种主要聚糖结构。使用2 Kg/mL lambody将由611种印制聚糖组成的CFG阵列V5. 0染色。
[0027] 图7. VLRB. GPA. 23和亲和力改进的克隆Mut. 10结合糖缀合物的动力学分析。对于 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 11]\1的浓度，显示固定化1311113〇(^与36?六、86-!13^^八 和TF α -PAA的相互作用的代表性SPR传感图。使用1:1 Langmuir结合模型拟合减去参照 和减去空白的结合数据，以确定缔合常数和解离常数。从这些值中计算平衡解离常数。显 示了卡方和U值的统计学，并且对于ka、kd和Rmax的所有T值均>100。
[0028] 图8.可选择性结合单糖、二糖、三糖、多糖和糖蛋白的VLR克隆的测定。对来自各 筛选的代表性克隆的配体结合的标记强度的点图描述和Y-平均荧光强度的测定。（a)经指 定浓度的甘露糖-PAA和对照间隔物-PAA标记的抗甘露糖.5 (Y-平均值〈3表示未结合）。 (b)经 GalNAc α -PAA 和 Man-PAA 标记的抗 GalNAc. 2。（c)经 Neu5Gc α -PAA 和 Neu5Ac α -PAA 标记的抗 Neu5Gc. 8。（d)经 TF α -ΡΑΑ 和 TF β -ΡΑΑ 标记的抗 TF α · 1。（e)经 Lewi sa-PAA 和 经聚-Man9-PAA和gpl20标记的抗gpl20. 2。（h)经aOSM和TF α -PAA标记的抗OSM. 2。生 物素化的抗原使用SA-PE检测，以及VLR表面展示的水平通过使用大鼠抗FLAG mAb接着抗 大鼠 Alexa 488抗体标记来检测。
[0029] 图9.用于检测血清糖蛋白中的癌症诊断抗原的lambody夹心测定法。（A)将捕 获抗岩藻糖lambody固定在固体支持物上；(B)通过与两个岩藻糖结构结合来捕获来自癌 症患者血清样品的岩藻糖化糖蛋白；(C)用抗Lewis X lambody覆盖所述复合物，可将所述 lambody直接标记用于检测或者通过例如标记的抗小鼠 IgG Fc抗体检测。
[0030] 图10.来自乳腺癌（MCF7 ;第一列）、正常乳腺（MCF10A ;第二列）、肺癌（A549 ;第 三列）和正常肺（HBE3 ;第四列）细胞系的细胞表面蛋白质的lambody捕获ELISA。使用链 霉抗生物素-HRP和TMB底物检测生物素化的探针蛋白质。
[0031] 发明详述 定义 除非另有说明，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义 可在例如 Benjamin Lewin, Genes VII，Oxford University Press 出版，2000 (ISBN 019879276X) ;Kendrew 等（编辑）；分子生物学百科全书（The Encyclopedia of Molecular Biology)，Blackwell Publishers 出版，1994 (ISBN 0632021829);和 Robert A. Meyers (编 辑），分子生物学和生物技术：综合案头参考（Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)，Wiley, John & Sons, Inc.出版，1995 (ISBN 0471186341);和其它类似的技术参考文献中找到。
[0032] 本文所用的"一"或"一个"可意指一个或多个。当与用词"包括"连用时，本文所 用的用词"一"或"一个"可意指一个或多于一个。本文所用的"另一个"可意指至少第二个 或更多个。此外，除非文段另有要求，否则单数术语包括复数且复数术语包括单数。
[0033] 本文所用的"大约"是指数值，不论是否明确指出，均包括例如整数、分数和百分 数。术语"大约"一般是指本领域普通技术人员将认为是等同于所述值（例如具有相同的 功能或结果）的数值范围（例如所述值的+/-5-10%)。在一些情况下，术语"大约"可包括 舍入为最接近有效数字的数值。
[0034] 本文所用的术语"治疗"和"处理"具有其普通和常用的意义，且包括以下的一种 或多种：改善疾病症状；阻断或改善疾病症状的复发；降低疾病症状的严重性和/或频率； 减慢、阻断、阻止、控制或制止疾病进展。所述术语不一定表示疾病或疾病症状的全部消除。 治疗意指相对于未给予lambody的受试者改善、阻止、减少、减轻或抑制约1%-约100%。优 选相对于未给予lambody的受试者，所述改善、阻止、减少、减轻或抑制为约100%、99%、98%、 97%、96%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5% 或 1%。
【发明内容】
[0035] 可变淋巴细胞受体（VLR)为例如七鳃鳗和盲鳗等无颚纲鱼类的抗体。VLR通过 DNA重排在淋巴细胞中装配，并且其与从鲨鱼到人等有颚脊椎动物的常规抗体一样多样化， 具有超过1〇14种独特受体的可能库。然而，VLR独特地构建自高度多样化的富含亮氨酸的 重复模块，而非构建自常规抗体的免疫球蛋白构建单元（Pancer等，2004 ;Alder等，2005 ; Tasumi 等，2009)。
[0036] 有 2种 VLR 基因 （Pancer 等，2005 ;Rogozin等，2007)，VLRA 和 VLRB，通过互相排斥 的淋巴细胞群体表达（Alder等，2008)。为了形成成熟的功能受体，种系VLR基因经历DNA 重组，借此各VLR装配自多个编码富含亮氨酸的重复（LRR)的模块，所述模块选自位于各 VLR基因侧翼的数百个盒的阵列。成熟VLR由种系VLR基因所编码的N端前导序列和C端 柄状细胞表面锚定结构域组成。各VLR具有独特的多变区。所述多变区中仅小的氨基端和 羧基端部分由种系基因提供（图1);这些部分充当经由类似基因转换的过程序贯掺入LRR 盒的停泊位点（Rogozin 等，2007 ;Nagawa 等，2007)。
[0037] VLRA和VLRB中的多变区由数组LRR模块组成，该模块各自具有高度可变的序列： 1个27-34个残基的N端LRR (LRRNT)，1个25个残基的LRR (LRR1)，至多9个24个残基的 LRR (LRRV ;末端LRRV命名为LRRVe)，1个16个残基的截短的LRR (命名为连接肽，CP)，和 48-63个残基的C端LRR (LRRCT)(亦参见图1)。所述LRRNT和LRRCT通过2组模块内二硫 键来稳定，所述二硫键用于给两个弯曲的螺线管状多变区的末端加帽（Kim等，2007)。通过 反复的基因盒插入对VLR的装配，连同LRR模块的边界内频繁的重组事件，产生了与哺乳动 物抗体和TCR相当数量的预计多于1014个独特VLR的巨大受体库（Adler等，2005 ;R〇g〇zin 等，2007)。
[0038] 已使用独特的VLR多变区酵母表面展示平台，开发用于从超过108个独立克 隆的文库中产生和高通量筛选重组抗原结合VLR多变区的技术（参见美国专利公布号 20110230374,通过引用以其整体结合到本文中；亦参见Tasumi等，2009)。对这些文库筛选 可选择性结合聚糖、糖脂和糖蛋白的克隆。因此，该技术允许产生和筛选对几乎所有测试的 蛋白质、糖蛋白、糖脂和聚糖抗原均表现出高亲和力的单链单克隆七鳃鳗VLR多变区。在筛 选中鉴定的两个VLR多变区为VLRB. aGPA. 23和VLRB. gpl20. 4。VLRB. aGPA. 23具有在SEQ ID NO: 2中所述的氨基酸序列。该VLR多变区具有对BG-H3、TF α和TF α -丝氨酸聚糖的 结合特异性。编码该多变区的核苷酸序列在SEQ ID NO: 1中提供，所述序列亦包含在本发明 的范围内。因此，本发明包括多变区VLRB.aGPA. 23,其包含在SEQIDN0: 2中所述的氨基酸 序列或由该氨基酸序列组成。VLRB. gpl20. 4具有如在SEQ ID N0: 4中所述的氨基酸序列。 该多变区具有对糖蛋白gpl20和聚-Man9 (甘露糖）的结合特异性。编码该多变区的核苷 酸序列在SEQ ID N0: 3中提供，所述序列亦包含在本发明的范围内。因此，本发明包括多变 区VLRB. gp 120. 4,其包含在SEQ ID N0: 4中所述的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
[0039] 在酵母表面，单体VLR以这样的密度展示，所述密度可使多价抗原（例如大多数 糖缀合物）能够被数个VLR协同结合，因高亲合力而生成稳定的复合物（Tasumi等，2009 ; Hong等，2012)。虽然所述七鳃鳗VLR多变区表现出与糖蛋白、糖脂和聚糖抗原的适度的（微 摩尔的）亲和结合，但如本文所述，本发明人目前亦已发现，当至少两个多变区连接在一起 时，所述结合亲和力可大幅增加，有时以1000倍或更高的级别（低纳摩尔至皮摩尔）增加。 因此，本申请在某种程度上致力于包含两个七鳃鳗VLR多变区的二聚蛋白质。
[0040] 具体而言，本发明在某种程度上涉及二聚聚糖结合蛋白质，其表现出对糖基化抗 原的结合特异性。称为lambody的这些二聚蛋白质，由两个lambody亚基组成。各亚基均为 这样的融合蛋白，其包含与允许lambody亚基二聚化的多聚化结构域连接的来自重组VLR 的多变区。本发明亦涉及具体的lambody，其制备自七鳃鳗VLR多变区，所述多变区在使用 所选聚糖、糖脂和糖蛋白筛选本文所引用的文库中鉴定。本发明进一步涉及lambody亚基 及其变体，当与其所基于的lambody亚基相比时，所述变体具有在VLR多变区中的一个或多 个氨基酸改变。本发明亦进一步涉及包含三个或更多个lambody亚基的lambody多聚体。 如在下文中更详细地论述，某些本发明的lambody特异地与多种肿瘤中的抗原结合，而在 正常组织或邻接肿瘤的良性组织中很少结合或不结合。
[0041] 为了简化，本文所用的术语"lambody"常常用于通用地指本文所述的所有形式和 类型的lambody，包括lambody亚基、lambody亚基的变体、lambody和lambody多聚体。因 此，除非文段中另有指示，否则本文对"lambody"的提及均包括一种或多种lambody亚基、 lambody亚基的变体、lambody和lambody多聚体。
[0042] 本发明的lambody与常规抗体相比具有许多优点，所述常规抗体例如通过包括小 鼠和兔以及人的免疫学主力（workhorse)产生的抗体。这些优点的某些在表1中阐述。
[0043] 表1.哺乳动物抗体和lambody的生物化学和生物物理学特性
【权利要求】
1. 一种lambody，其中所述lambody包含经由其多聚化结构域二聚化的两个lambody 亚基。
2. 权利要求1的lambody，其中所述lambody表现出对于聚糖、糖脂或糖蛋白的结合特 异性。
3. 权利要求1的lambody,其中所述lambody亚基为融合蛋白，所述融合蛋白包含与多 聚化结构域连接的七鳃鳗可变淋巴细胞受体（VLR)多变区。
4. 权利要求3的lambody,其中所述lambody亚基包含具有相同氨基酸序列的VLR多 变区。
5. 权利要求3的lambody,其中所述lambody亚基包含具有不同氨基酸序列的VLR多 变区。
6. 权利要求4的lambody，其中所述lambody亚基包含选自SEQ ID NO: 2和4的氨基 酸序列的VLR多变区。
7. 权利要求1的lambody,其中两个lambody亚基均包含SEQ ID NO: 5、6、7或8中所 述的氨基酸序列。
8. 权利要求1的lambody，其中所述lambody表现出对选自以下的一个或多个成 员的结合特异性：甘露糖、Τη泛癌抗原（GalNAc a )、N-轻乙酰神经氨酸（Neu5Gc α )、轻 化 Ν-乙醜神经氨酸（Neu5Ac)、TF a、Lewis A [Gal β 1-3 (Fuc α 1-4) GlcNAc β ]、Lewis X [Gal@ l-4(Fuca l-3)GlcNAc@]、聚-Man-9、去唾液酸绵羊颌下腺粘蛋白（aOSM)、血型H 3 型三糖（BG-H3)、Thomsen-Friedenreich泛癌肿瘤相关的糖抗原（TF α )、TF α -丝氨酸、糖 蛋白gpl20和聚-Man9 (甘露糖）。
9. 权利要求1的lambody，其中所述lambody表现出对选自以下的一个或多个成员的 结合特异性：BG_H3、TFa、TFa-丝氨酸、糖蛋白g P120和聚-Man9。
10. 权利要求1-9中任一项的lambody，其中所述lambody对于其所表现出结合特异性 的革巴标，表现出至少约1 X 1(Γ7 Μ的结合亲和力（KD)。
11. 一种lambody多聚体，其中所述lambody多聚体包含经由其多聚化结构域多聚化 的三个或更多个lambody亚基。
12. 权利要求11的lambody多聚体，其中所述lambody多聚体表现出对于聚糖、糖脂或 糖蛋白的结合特异性。
13. -种lambody亚基，其中所述lambody亚基为融合蛋白，所述融合蛋白包含与多聚 化结构域连接的七鳃鳗可变淋巴细胞受体（VLR)多变区。
14. 权利要求13的lambody亚基，其中所述lambody亚基包含选自SEQ ID NO: 2和4 的氨基酸序列的VLR多变区。
15. 权利要求13的lambody亚基，其中所述lambody亚基具有对选自以下的一个或多 个成员的结合特异性：甘露糖、Τη泛癌抗原（GalNAc α )、N-轻乙酰神经氨酸（Neu5Gc α )、 轻化 Ν-乙醜神经氨酸（Neu5Ac)、TF α、Lewis A [Gal β 1-3 (Fuc α 1-4) GlcNAc β ]、Lewis X [Gal@ l-4(Fuca l-3)GlcNAc@]、聚-Man-9、去唾液酸绵羊颌下腺粘蛋白（aOSM)、血型H 3 型三糖（BG-H3)、Thomsen-Friedenreich泛癌肿瘤相关的糖抗原（TF α )、TF α -丝氨酸、糖 蛋白gpl20和聚-Man9 (甘露糖）。
16. 权利要求13的lambody亚基，其中所述lambody亚基具有对选自以下的一个或多 个成员的结合特异性：BG_H3、TFa、TFa-丝氨酸、糖蛋白gP120和聚-Man9。
17. -种用于从样品中分离含聚糖成分的方法，所述方法包括（i)使lambody亚基、 lambody或lambody多聚体粘附于支持物，（ii)在允许样品中的含聚糖成分与所述lambody 亚基、lambody或lambody多聚体结合的条件下，使所述支持物与样品接触，（iii)从支持物 上洗去未结合的样品，（iv)从支持物上洗脱所述含聚糖成分，和（v)收集所述含聚糖成分。
18. 权利要求17的方法，其中所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与柱中的 珠粒结合。
19. 一种用于在来自受试者的生物样品中检测聚糖、糖脂或糖蛋白的方法，所述方法 包括使来自受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触并检测所 述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与样品中聚糖、糖脂或糖蛋白的结合。
20. -种用于在受试者中诊断癌症的方法，所述方法包括（a)使来自受试者的生物样 品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触，所述lambody亚基、lambody或lambody 多聚体结合与癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白，和（b)检测所述lambody亚基、lambody或 lambody多聚体与样品中聚糖、糖脂或糖蛋白的结合。
21. -种用于对患有癌症的受试者进行预后的方法，所述方法包括（a)使来自患有癌 症的受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触，所述lambody亚 基、lambody或lambody多聚体结合与受试者的癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白，（b)测定在 (a)中结合的lambody亚基、lambody或lambody多聚体的量，（c)将（b)中测得的量与先 前在对照样品中确定的一个或多个量进行比较，和（d)基于（c)中的比较进行受试者的预 后。
22. -种用于在受试者中监测癌症进展的方法，所述方法包括（a)使来自患有癌症的 受试者的生物样品与lambody亚基、lambody或lambody多聚体接触，所述lambody亚基、 lambody或lambody多聚体结合与受试者的癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白，（b)测定在（a) 中结合的lambody亚基、lambody或lambody多聚体的量，和（c)将（b)中测得的量与先前 在来自所述受试者的生物样品中确定的一个或多个量进行比较。
23. -种用于在受试者中使癌症成像的方法，所述方法包括向受试者给予标记的 lambody亚基、lambody或lambody多聚体，并在所述受试者中检测所述lambody亚基、 lambody或lambody多聚体，其中所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体结合癌症 相关的聚糖、糖脂或糖蛋白。
24. -种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者给 予治疗上有效量的lambody亚基、lambody或lambody多聚体，其中所述lambody亚基、 lambody或lambody多聚体结合与所述受试者的癌症相关的聚糖、糖脂或糖蛋白。
25. 权利要求24的方法，其中所述lambody亚基、lambody或lambody多聚体与化学治 疗剂缀合。
26. 权利要求19-22中任一项的方法，其中所述生物样品为选自以下的一种或多种：体 液、分泌物或排泄物、细胞、组织或组织活检。
27. 权利要求19-22中任一项的方法，其中所述生物样品为选自以下的一种或多种：全 血、血浆、血清、粘液、脑脊液、胸膜液、尿、泪、唾液、痰和粪便。
28. 权利要求19-23中任一项的方法，其中所述lambody亚基、lambody或lambody多 聚体与可检测标记缀合。
29. 权利要求19-23中任一项的方法，其中使用标记的第二结合部分检测所述lambody 亚基、lambody或lambody多聚体，所述第二结合部分结合所述lambody亚基、lambody或 lambody多聚体。
30. 权利要求20-24中任一项的方法，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、肺腺癌、大细胞 癌、鳞状细胞癌、前列腺腺癌或结肠腺癌。
【文档编号】G01N33/574GK104066751SQ201280067764
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月22日
【发明者】Z.潘塞尔, 毛力, 洪夏, 马志清 申请人:马里兰州大学(巴尔的摩)