多重免疫筛选分析的制作方法

多重免疫筛选分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于病原体的早期检测、病原体的准确鉴定并改进疾病监测的试剂盒和分析方法。更具体地，本发明公开了免疫分析，其引导在受感染患者的生物液体中针对广泛范围的传染性病原体的抗体快速和同时检测。这种免疫分析涉及含有AGT酶与病毒抗原的融合蛋白在可鉴定的固体支持物(例如，荧光微球)上的共价和定向偶联，所述支持物预先用AGT底物包被。这种偶联由AGT酶在其底物上不可逆的反应所介导。因此，与通过标准胺偶联程序产生的抗原偶联的微球相比，所获得的抗原偶联微球显示特异性抗体的增强捕获。与经典ELISA或放射免疫沉淀分析相比，本发明的方法具有多重化、最小化生物样本量的能力，并具有针对靶抗体的增强的灵敏度和特异性。
【专利说明】多重免疫筛选分析

【背景技术】
[0001] 由于疾病的严重程度、高致死性、某些介质（agent)的人类间接触传染性以及对 其中的大多数缺乏有效治疗，传染病和病毒性出血热（VHF)构成显著的公共卫生问题。
[0002] 其中一些是由高传染性的RNA病毒导致，所述RNA病毒来自几个科，其包括包括 黄病毒科（Flaviviridae)(登革热、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒）、 披膜病毒科（Togaviridae)(基孔肯雅（Chikungunya)、罗斯河、马雅罗、西方马型脑炎、东 方马型脑炎、委内瑞拉马型脑炎病毒）、本雅病毒科（Bunyaviridae)(克里米亚-刚果出血 热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（Caliciviridae)(戊型肝炎病毒）、沙粒病毒科 (Arenaviridae)(拉沙热）和丝状病毒（Filoviridae)(埃博拉、马尔堡）。通常通过与感 染的动物贮主或节肢动物载体接触发生传播。虽然大多数的这些病毒在热带和亚热带有更 高的发生率，但其天然贮主和载体地域扩张、以及增加的国际旅行已经使这些介质在非流 行地区极有可能出现。疫情控制关键取决于快速检测以及介质的准确鉴定，以定义和及时 实现并适当行动。在这种情况下，必须产生和验证用于暴发的早期检测、精确鉴定病原体并 改进疾病监测的工具。
[0003] 在这方面，在体液中检测抗体构成了病毒引起的疾病、自身免疫性疾病的诊断以 及癌症检测的重要组成部分。事实上，因为已知某些抗体存在与病原体的暴发有关，因此这 些抗体可作为诊断标记物并可引导预后和治疗。对于专门靶向病毒抗原的抗体的情况尤其 如此。
[0004] 目前用于检测抗体存在的方法包括多种技术，诸如免疫突光显微镜、化学发光分 析、Western印迹、放射免疫沉淀法（RIP)和ELISA。例如，Kim H-J等人的团队最近开 发出一种竞争ELISA用于检测针对在山羊和牛中的裂谷热病毒的抗体（The Journal of Veterinay Medical Science, 2011)。然而，这种技术需要分开测量每种抗体，因而不适用 于在单个生物液体样本中进行多个抗体的平行、快速和高通量分析。因为校准品和所述抗 体在相同的条件下进行分析，通过减少个别分析（如ELISA)之间存在的基质效应，同时平 行检测几种抗体可特别地有用；因此，对在相同样本中存在的多个抗体的测量，其将产生可 比较的结果。
[0005] 然而，使病原相关抗体的直接鉴定复杂化的是正常血清含有大量在复杂染色模式 中表现其自身的天然抗体（Avrameas S. Immunol. Today 1991)。这些天然抗体的存在可 使得疾病相关抗体与"自身免疫噪声"（即天然存在的自身抗体）的复杂背景的差异复杂 化。这就是为什么大多数之前研究评估一个或几个特异性疾病相关抗体，并通过ELISA或 RIA的方法仅筛选出有限数量的纯化的同源或异源的蛋白作为抗原。不可能建立基于这些 抗体的诊断。在另一方面，因为Western印迹法允许同时筛选不同抗原的广泛谱，Western 印迹法已经发展成为检测抗体的最重要工具。最近能够同时分析Western印迹这些复杂 的染色模式的新技术，是基于数字图像分析。这种技术已成功应用于研究重症肌无力、格 雷夫斯病和实验性葡萄膜炎（Zimmerman CW, Electrophoresis 1995)。还可使用表面增强 激光解吸/电离（SELDI)或基质辅助激光解吸/电离质谱技术，优选SELDI质谱技术（US 2006/166268)在蛋白芯片阵列上检测和测量抗体。然而，这些技术使用大型笨重设备，其是 复杂的和维护昂贵，并且需要大量的生物样本来实现低量抗体的检测。
[0006] 鉴于上述情况，需要可寻址系统和方法，其可对产生抗体的疾病的分子诊断提供 高通量、成本效益和精确性的进一步改善。本发明满足了这些和其它需要。

【专利附图】

【附图说明】
[0007] 图1表示嵌合AGT-抗原蛋白定向偶联至底物包被的微球上。偶联的第一步由通过 氨基偶联将AGT底物BG-PEG-NH2偶联至活化的微球所组成。第二步由使底物包被的微球与 含AGT的融合蛋白（例如，SNAP突变体）相接触所组成，所述酶意欲共价附至其BG-PEG-NH2 底物，即至微球上。
[0008] 图2显示嵌合SNAP-病毒抗原蛋白的偶联效率（SNAP-DVL EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-ZIKA)，接着 是抗-SNAP抗体。
[0009] 图3比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV2抗体对嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的免 疫分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通过hAGT蛋白的底物（本发明的偶 联）缀合至微球、或者通过标准胺偶联方法，例如Bio-Plex胺偶联试剂盒BI0RAD进行偶 联。
[0010] 图4比较用于检测纯化的单克隆抗-DV1抗体对嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白的免 疫分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白以单重格式缀合至微球，或者与其它 嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、 SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)以多重格式偶联至微球。
[0011] 图5显示用于检测纯化的单克隆抗-WNV抗体的稀释液对偶联至微球的嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、 SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)的多重免疫分析实验的反应性和特异性。
[0012] 图6显示以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、 SNAP-WSL、SNAP-R0CI0、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA)进行的在小鼠多克隆血清中针对 DV3的抗-DV3 IgG检测（A)以及在小鼠多克隆血清中针对YF的抗-YF IgG检测（B)的反 应性和特异性。
[0013] 图7显示在DV1感染的人类患者血清中以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、 SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-R0CI0、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA、 SNAP-TBE)进行的抗-DV1 IgM检测（A)和抗-DV1 IgG检测（B)的反应性和特异性。
[0014] 图 8 公开 pDeSNAPuniv 盒（cassette)的结构。
[0015] 图 9 公开 pDeSNAPuniv/SBV. N 盒的结构。
[0016] 图10显示（A)使用Cd2+诱导10天（+)或未诱导的（-)的S2/SNAP-SBV. N细胞上 清中进行的免疫印迹分析。使用抗-Hisss抗体检测分泌的嵌合蛋白SNAP-SBV. N(理论丽 50kDa)，与限定量的高纯度嵌合蛋白SNAP-T0S.N(理论MW 49kDa)进行比较。（B)在尺寸排 阻层析柱的馏分（fraction)上进行的免疫印迹（PAGE-SDS的考马斯蓝染色）对应于来自 诱导10天的S2/SNAP+SBV. N细胞的分泌SNAP+SBV. N蛋白的最后纯化步骤。
[0017] 图11显示含有本发明的抗原包被微球的装置的实例。

【具体实施方式】
[0018] 6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（AGT，也被称为ATase或MGMT，以下称为"AGT"） 在IUBMB酶命名法中编号为EC 2. 1. 1.63。它是207个氨基酸残基的6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷 基转移酶的DNA修复酶，其在细胞内的功能是修复烷基化DNA。更精确地，AGT通过将S N2反 应中的甲基不可逆地转移至反应性半胱氨酸残基（Cys 145)对DNA中的06-甲基化鸟嘌呤 发挥作用。目前，已经证明一些06-苄基鸟嘌呤衍生物通过将其苄基转移至AGT酶的活性位 点半胱氨酸上来与所述酶进行不可逆反应（参见Damoiseaux等人，ChemBiochem.，2001，W0 2004/031404 和 TO 2005/085470)。
[0019] 本发明人已经开发和验证了这样的免疫分析，其导向由广泛疾病，特别是虫媒病 毒疾病和VHF产生的几种抗体在生物液体中的快速和同时检测。
[0020] 为实现对低量抗体检测最佳灵敏度和特异性两者，已经开发出定向抗原偶联方 法。这个定向抗原偶联方法基于AGT酶和其底物（06-苄基鸟嘌呤衍生物）之间的共价相互 作用，所述底物通过将其苄基转移至酶的活性位点半胱氨酸上与AGT酶不可逆反应。相应 地，一些靶抗原可融合至AGT酶的部分，从而导致不同的嵌合融合蛋白（以下称为[AGT-抗 原]的融合蛋白），即可以用作对存在于生物样本中的抗体的捕获试剂。本发明人已证明， 得益于特异性AGT-底物相互作用，当这些融合蛋白结合到固体支持物上时这种抗体捕获 得以增强。因此，使用AGT-底物包被所述固体支持物是本发明免疫分析的必要步骤。
[0021] 更确切地说，在本发明的上下文中，用于将抗原偶联至固体支持物的方法包括以 下两个步骤：i)用AGT底物（例如，BG-PEG-氨基）包被固体表面，以及ii)使用AGT底物作 为锚点来共价固定嵌合[AGT-抗原]融合蛋白（参见图1)。固体表面使用所述AGT底物包 被之前，所述固体表面有利地是官能化的，优选通过使用优化的两步碳二亚胺处理（Kufer SK，Eur. Biophys. J，2005)，从而使AGT底物共价附着到固体表面。一旦这些步骤已经完成， 所述固体表面携带AGT底物被不可逆地连接到嵌合[AGT-抗原]融合蛋白上。由于这种反 应的高特异性，所述融合蛋白专门通过含有半胱氨酸的AGT酶结构域偶联，因此使抗原因 其与抗体的相互作用而可被接近。
[0022] 这种偶联过程是非常有利的，因为其允许抗原在固体支持物上以定向的方式结 合。此外，这种抗原偶联方法有利地使得能够获得在固体表面上的多聚体抗原结构，从而增 强免疫球蛋白G、以及可能的免疫球蛋白Μ的捕获效率。因此，与通过标准的非定向胺偶联 程序产生的抗原偶联微球相比，在本申请实验部分中开发的抗原偶联的微球已显示出增强 的特异性抗体捕获（参见以下实验部分和图3)。最后，这种抗原偶联方法使得能够获得抗 原缀合微球的高偶联效率与长期稳定性（在4°C，>6个月）。
[0023] 重要的是，在本发明的免疫分析中使用的固体支持物应是本质上可区分的，因此 有可能准确地确定何种固体支持物上携带何种抗原。然后，抗原偶联的和可区分的固体支 持物用作特异性人免疫球蛋白的捕获试剂，并因此接触患者的生物样本。
[0024] 本发明的方法的最后一步涉及检测有效地结合到免疫球蛋白的固体支持物。免疫 球蛋白包被的固体支持物的鉴定能够诊断哪种病原体在感染患者（因为每种固体支持物 与限定的致病抗原相匹配）。这个最后检测步骤通过任何常规方法进行，例如通过使用标记 的检测抗体以及通过鉴定固体支持物的性质。
[0025] 有利地，本发明的方法仅涉及在患病患者中检测抗体的存在，而不需要关于那些 抗体身份的知识。
[0026] 如在本申请的实验部分所示，本发明人用本发明的抗原偶联方法来生成一些不同 抗原包被的荧光微球。目前，16组不同的微球已与16种纯化嵌合[AGT-抗原]融合蛋白 相偶联，从而允许滴定对以下不同蛋白特异的16种血清抗体：登革血清型1至4、西尼罗、 黄热病、日本脑炎、蝶传脑炎、圣路易脑炎、墨累谷脑炎（Murray Valley encephalitis)、 威塞尔布朗（Wesselsbron)、寨卡（Zika)、罗西奥（Rocio)、乌苏图（Usutu)、裂谷热和基孔 肯雅病毒。这16组不同微球已被混合在单一样本中而不影响检测的灵敏度和特异性（参 见图5)。这种系统的生产是高度时间效益和成本效益好的，因为只需极少量的重组抗原 (<50yg)来产生一组抗原偶联的微球（?1.25X 106微球），这样的组足以进行500个个 体分析。
[0027] 在第一方面，本发明涉及用于在生物样本中检测至少两个靶抗体的方法，其包 括：
[0028] (a)使第一固体支持物与生物样本相接触，所述第一固体支持物包含共价偶联至 第一融合蛋白的AGT底物，所述第一融合蛋白包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活 性的AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表位；
[0029] (b)使第二固体支持物与生物样本相接触，所述第二固体支持物包含共价偶联至 第二融合蛋白的AGT底物，所述第二融合蛋白包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活 性的AGT多肽和由第二靶抗体识别的第二表位；以及
[0030] (c)检测两个靶抗体的存在与否。
[0031] 更确切地说，本发明涉及用于在来自受试者的生物样本中检测至少两种不同靶抗 体存在的体外分析方法，所述方法包括以下步骤：
[0032] (a)提供第一融合蛋白，其包括：
[0033] -含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽，以及
[0034] -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽；
[0035] (b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽 的底物共价偶联；
[0036] (c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物；
[0037] (d)提供第二融合蛋白，其包括
[0038] -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所 识别，以及
[0039] -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽；
[0040] (e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽 的底物共价偶联；
[0041] (f)获得第二固体支持物，其与由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体识别的第 二表位共价偶联，
[0042] 其中所述第一和第二固体支持物可彼此被特异性地鉴定出；
[0043] (g)使所述生物样本与获自步骤（c)和（f)的第一和第二固体支持物相接触；
[0044] (h)检测所述至少两种靶抗体的存在。
[0045] 如下文所用，术语"抗体"、"融合蛋白"、"表位"、"抗原"、"AGT多肽"、"固体支持物" 等明显理解为本领域通常的，即以广义方式所理解的。特别是，它们不仅包括具体的单一分 子还包括一些所述分子。例如，术语"固体支持物"包括许多相同固体支持物的子集，术语 "微粒"包括许多相同的微粒的子集，以及术语"融合蛋白"包括一些相同的单一蛋白分子。 在本发明的上下文中，值得注意的是固体支持物携带一些相同的融合蛋白，所述融合蛋白 除AGT多肽以外还含有相同的抗原，并因此具有相同表位，以便在固体支持物上待检测的 抗体可以被毫无疑义地鉴定。
[0046] 如本文所用，术语"融合蛋白"指含有通过人工连接两个或更多多肽而产生的蛋白 或多肽的多肽。在本发明的免疫分析中，所述融合蛋白包含AGT多肽和含有至少一个表位 的抗原。融合蛋白可通过融合基因的遗传工程而获得。这通常涉及从编码的第一个蛋白的 cDNA序列中去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR符合阅读框地加上第二蛋白的 cDNA序列。然后，所述DNA序列将作为单一蛋白由细胞表达。所述蛋白可被工程化以包括 原始蛋白两者的完整序列，或仅其中一部分。如果这两个实体是蛋白，可以加入接头（或 "间隔区"）肽，这使得蛋白独立地折叠和如预期地行为更有可能。特别地，通过提供含有与 表位或抗原的编码序列在阅读框中的AGT编码序列的载体，可以获得本发明的融合蛋白， 所述表位或抗原的编码序列可附着至AGT DNA序列的N末端或至C末端侧。这些载体可引 入到原核宿主，其包括如大肠杆菌细菌的真细菌，或真核宿主，例如酵母、昆虫细胞或哺乳 动物细胞，以及重组融合蛋白可以在适当条件下产生。典型的结构存在于本申请的实验部 分。
[0047] 如本文所用，术语"抗体"意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。优选地， 待用本发明的免疫分析来检测的抗体是多克隆抗体，其存在于患病患者的生物样本中，并 且因此由不同B细胞来源产生。因此，其识别由致病抗原展示的不同表位（在另一方面，单 克隆抗体源自单一细胞系并识别相同表位）。
[0048] 抗体（或"免疫球蛋白"）由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含由二硫键相连的至少两 条重（H)链和两条轻链（L)。每条重链包含重链可变区（或结构域）（在本文中缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可 变区（本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL 区可以进一步细分为高变区，称为"互补决定区"（CDR)或"高变区"，其主要负责结合抗原 表位并且其散布在更加保守称为骨架区（FR)的区中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR 组成，所述CDR和FR从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫 球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系 统的第一成分（Clq)。
[0049] 抗体可以是不同的同种型（即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的。IgG和IgM型抗体 两者可通过本发明的方法进行检测。值得注意的是，这些同种型的组成是由二硫键连接的 两条相同重链和两条相同的轻链。重要的是，IgM抗体形成聚合物，其中多个免疫球蛋白通 过二硫键共价连接在一起，主要是作为五聚体也可作为六聚体以使其具有约900kDa的分 子量（以其五聚体形式）。因为每个单体具有两个抗原结合位点，五聚体IgM有10个结合 位点。然而，通常IgM抗体不能在同一时间结合10个抗原，因为大多数抗原的大尺寸阻碍 结合至附近的位点。由于IgM的聚合物性质，其具有高亲和力。
[0050] 由于本发明的方法也可以检测到抗体片段。此术语意在包括Fab、Fab'、F(ab'）2、 scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微体、双体及其多聚体以及双特异性抗体片段。
[0051] 单克隆抗体可以在本免疫分析中使用；例如，用于检测结合至固体支持物的免疫 球蛋白。如本文中所用，"单克隆抗体"定义了从同源抗体群中所产生的抗体。更具体而言， 除了可以以最小比例发现的几个可能天然存在的突变以外，群体的单个抗体是相同的。换 言之，单克隆抗体由源自单一细胞克隆（例如杂交瘤、由编码均质性抗体的DNA分子转染的 真核宿主细胞、由编码均质性抗体的DNA分子所转染的原核宿主细胞等）生长的均质性抗 体所组成，并且通常表征为一种且仅一类和亚类的重链，以及仅一种类型的轻链。单克隆抗 体是高度特异性的并且针对单一抗原。另外，与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗 体的多克隆抗体的制备相反，每种单克隆抗体针对抗原的单一表位。
[0052] 术语"抗原"在本文中意为任何物质，其引发免疫系统产生针对所述物质的抗体。 "免疫原性的"抗原是抗原的特定类型，其在自身被注入时能够刺激适应性免疫应答。因此， 在分子水平上，抗原表征为其"结合"到抗体的抗原结合位点的能力。
[0053] 在本发明的上下文中，如果抗体对所述抗原（或表位）具有高于105ΜΛ优选高于 1〇 6ΜΛ更优选高于10V的亲和常数Ka(其为解离常数的倒数，即1/Kd)，则说所述抗体"结 合"限定的抗原（或表位）或"识别"所述抗原（或表位）。这种亲和性可以通过例如平衡 透析或荧光淬灭来测量，这两种技术在本领域中是常规使用的。
[0054] 在本发明的上下文中，抗原或表位包括：蛋白、脂蛋白、多糖以及糖蛋白。所述 蛋白包括病毒、细菌、寄生虫、动物和真菌蛋白如白蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、百日 咳类毒素、细菌外膜蛋白（包括脑膜炎球菌外膜蛋白）、RSV-F蛋白、疟疾衍生肽、B-乳球 蛋白B、抑肽酶、卵白蛋白、溶菌酶、线性肽、寡肽等。所述抗原也可以是肿瘤相关抗原如 癌胚抗原（CEA)、CA15-3、CA125、CA19-9、前列腺特异性抗原（PSA)、TAA复合物、SSX2或 NERCMSL。所述抗原还可以是半抗原以及其它含有低分子量分子的部分，如糖、寡糖、多糖、 肽、粘蛋白、毒素和变应原（花粉、蛋清）。传染性毒素是本领域公知的。可以列举，例如 肉毒杆菌神经毒素、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)的ε毒素、蓖麻毒素、蛤 蛘毒素（saxitoxin)、志贺毒素（shigatoxin)、河豚毒素、葡萄球菌肠毒素等。粘蛋白也 是本领域中公知的。MUC5AC、MUC5B和MUC2是其实例。特别地，其可以是天然存在的多 糖，例如B组链球菌（steptococcal)和肺炎球菌荚膜多糖（包括III型）、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) mucoexo多糖和荚膜多糖（包括费希尔I型）、以及流感嗜血杆 菌（Haemophilus influenzae)多糖。
[0055] 在另一优选的实施方案中，所述抗原或表位通过选自以下的病毒表达：流感病 毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV病 毒、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏图或西尼罗病毒、裂谷热或 托斯卡纳病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞（synticial)病毒、罗西奥病毒、麻疹病毒、穆 雷脑炎病毒、威塞尔布朗（Wesselbron)病毒、寨卡（Zika)病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎 (choreomeningitis)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、拉沙 (Lassa)病毒、胡宁（Junin)病毒、马丘波（Machupo)病毒、萨比亚（Sabia)病毒、瓜纳里多 (Guanarito)病毒、腿腺炎病毒、狂犬病病毒、风疫病毒、水痘带状疱疫病毒、单纯疱疫1和2 型，更通常的ct病毒、腺病毒、艾柯病毒、轮状病毒、黄病毒、鼻病毒、正本雅（orthobunya) 病毒、脊髓灰质炎病毒、人细小病毒、肠病毒、冠状病毒、人乳头状瘤病毒、人巨细胞病毒、爱 泼斯坦-巴尔病毒、来自1、2和3型的副流感病毒、或任何鉴定的病毒。
[0056] 在另一优选的实施方案中，所述抗原或表位由属于这样科的病毒来表达，所述科 选自：黄病毒科（登革热、黄热、西尼罗、日本脑炎、蝶传脑炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科 (基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒）、本雅病毒科 (克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病 毒科（拉沙）和丝状病毒科（埃博拉、马尔堡）。
[0057] 在另一优选的实施方案中，所述抗原或表位通过以下表达：寄生原虫（例如 那些来自于利什曼虫属或刚地弓形虫（Toxoplasma Gondii)、痢疾阿米巴（Entamoeba histolytica)、恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)、月市囊虫（Pneumocystis carinii)、 或贾第鞭毛虫（Giardia lamblia)、懦虫（例如，线虫、绦虫、或吸虫）、或节肢动物（例如， 甲壳类、昆虫、蛛形纲）。
[0058] 在另一优选的实施方案中，所述抗原或表位通过传染性细菌表达，例如沙门 氏菌属（Salmonella)、志贺氏菌属（Shigella)、链球菌属（Streptococcus)、葡萄球 菌属（Staphylococcus)、支原体属（Mycoplasma)、白喉（Diphteriae)、钩端螺旋体属 (Leptospirosa)、立克次氏体（Rickettsia)或埃希氏菌属（Escherichia)中。在另一 优选的实施方案中，所述细菌属于选自以下种之一：流感嗜血杆菌（H. influenzae)、肺 炎链球菌（S. pneumoniae)、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌 (S. aureus)、炭疽芽抱杆菌（Bacillus anthracis)、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes)、百日咳杆菌（Bordetella pertussis)、破伤风杆菌（Clostridium tetani)、表皮葡萄球菌（S. epidermidis)、脑膜炎双球菌（Ν· meningiditis)、绿脓杆 菌（Pseudomonas aeruginosa)、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis)、结核杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、伯纳特氏立克次体（Coxiella burnetii)、问号钩端螺旋 体（Leptospirosa interrogans)和大肠杆菌（Ε· coli) 〇
[0059] 在另一优选的实施方案，所述抗原或表位由真菌或酵母（例如，来自物种念 珠菌属（Candida)、曲霉属（Aspergillus)、隐球菌属（Cryptococcus)、组织胞楽菌属 (Histoplasma)、肺孢子虫属（Pneumocystis)、或葡萄穗霉属（Stachybotrys))表达。
[0060] 抗原通常存在几个表面特征，其可作为对特异性抗体相互作用的点。任何这样独 特的分子特征组成表位。如本文所用，术语"表位"因此指定抗原的特定分子表面特征，例 如抗原的片段，其能够结合至少一种抗体。因此，在分子水平上，表位对应于抗原的特定分 子表面特征（例如，抗原的片段），其能被特定抗体识别和结合。在本发明的上下文中，"融 合蛋白"包含被靶抗体识别的至少一个表位。优选地，所述融合蛋白包括包含几个表位的整 个抗原。这些表位可以是线性或构象表位。如本文所用，线性的（或顺序的）表位是通过 其线性氨基酸序列或一级结构被抗体所识别的抗原。与之相反，构象表位是通过其特定的 三维形状被识别。优选地，本发明的融合蛋白含有构象表位，因为大多数多克隆抗体识别相 同的。
[0061] 然而，重要的是这种抗原不存在交叉反应表位，即由其所结合的非特异性抗体识 别的表位。如果是的话，本发明方法的特异性将降低。
[0062] 在一个更优选的实施方案中，所述表位存在于病毒蛋白中，所述病毒蛋白选自：由 SEQIDN0:3编码的登革病毒1的EDIII蛋白、由SEQIDN0:4编码的登革病毒2的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:5编码的登革病毒3的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:6编码的登革病毒4 的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:7编码的西尼罗病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:8编码的黄 热病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:9编码的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:10 编码的寨卡病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:11编码的威塞尔布朗（Wesselbron)病毒的 EDIII蛋白、由SEQ ID N0:12编码的罗西奥病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:13编码的穆 雷脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:14编码的圣路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:55编码的基因型2 的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56编码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:57编码的基因型5的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、以及由SEQ ID N0:58 编码的拉本斯堡（Rabensburg)病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝 炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒、以及致癌HPV株例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
[0063] 在优选的实施方案中，在本发明方法中使用的与hAGT酶融合在融合蛋白中的第 一和第二表位（或抗原）属于同一分类级别，即其属于相同科（例如，黄病毒科家族、本雅 病毒科、沙粒病毒科或丝状病毒科）或属或种，但具有不同的血清型。换言之，所述第一和 第二表位可通过密切相关的病毒来表达，例如属于相同科、属或种但具有不同血清型，如登 革病毒1、2、3、或4。
[0064] 或者，在另一优选实施方案中，所述第一和第二表位（或抗原）属于不相关生物的 科或属或种。
[0065] 重要的是，本发明的免疫分析依赖于检测大量已知或未知的抗体。"大量"在本文 中理解为至少5种，更优选至少15种，更优选至少50种以及甚至更优选至少100种抗体。 因此，在优选的实施方案中，本发明的分析方法用于从受试者的生物样本中检测至少5种， 更优选至少15种，和优选至少50种以及甚至更优选至少100种靶抗体。对于本发明的方 法而言，无所谓具体抗体是否被适当表征，因为所述方法仅依赖于检测所述抗体的存在而 不是其性质。
[0066] 在本发明优选的实施方案中，与所述第一和第二固体支持物偶联的所述第一和第 二融合蛋白选自以下：
[0067] -SEQ ID NO :21(对应于融合蛋白[SNAP-DEN1.EDIII])
[0068] -SEQ ID NO :42(对应于融合蛋白[SNAP-SBV. N])
[0069] -SEQ ID NO :49(对应于融合蛋白[SNAP-EV71. VP1])
[0070] -SEQ ID N0 :51 (对应于融合蛋白[SNAP-JE. sE])
[0071] -SEQ ID NO :53(对应于融合蛋白[SNAP-JE-1.EDIII])
[0072] -SEQ ID NO :60(对应于融合蛋白[SNAP-JE-2. EDIII])
[0073] -SEQ ID NO :62(对应于融合蛋白[SNAP-JE-4. EDIII])
[0074] -SEQ ID NO :64(对应于融合蛋白[SNAP-JE-5. EDIII])
[0075] -SEQ ID NO :66(对应于融合蛋白[SNAP-RabV. EDIII])
[0076] -SEQ ID NO :68(对应于融合蛋白[SNAP-黄病毒.EDIII])
[0077] -SEQ ID NO :70(对应于融合蛋白[SNAP-RR. sE2])
[0078] -SEQ ID NO :72(对应于融合蛋白[SNAP-MAY. sE2])
[0079] -SEQ ID NO :74(对应于融合蛋白[SNAP-WEE. sE2])
[0080] -SEQ ID NO :76(对应于融合蛋白[SNAP-EEE. sE2])
[0081] -SEQ ID NO :78(对应于融合蛋白[SNAP-VEE. sE2])
[0082] -SEQ ID NO :80(对应于融合蛋白[SNAP-AKA. N])
[0083] -SEQ ID NO :82(对应于融合蛋白[SNAP-AIN. N])
[0084] -SEQ ID NO :84(对应于融合蛋白[SNAP-SHA. N])
[0085] -SEQ ID NO :86(对应于融合蛋白[SNAP-huCOV. N])
[0086] -SEQ ID NO :88(对应于融合蛋白[SNAP-huCOV. S])
[0087] -SEQ ID NO :90(对应于融合蛋白[SNAP-HCV. C])
[0088] -SEQ ID NO :92(对应于融合蛋白[SNAP-MSP+AMA])
[0089] -SEQ ID NO :94(对应于融合蛋白[SNAP-HbpAl])
[0090] -SEQ ID NO :96(对应于融合蛋白[SNAP-MUB40])
[0091] -SEQ ID NO :98(对应于融合蛋白[SNAP-moCLEC5A])
[0092] -SEQ ID NO :100(对应于融合蛋白[SNAP-huCLEC5A])
[0093] -SEQ ID NO :102(对应于融合蛋白[SNAP-cxVAGO])
[0094] -SEQ ID NO :104(对应于融合蛋白[SNAP-aaVAGO])
[0095] -SEQ ID NO :109(对应于融合蛋白[SNAP-CCHF. N])
[0096] -SEQ ID NO :111 (对应于融合蛋白[SNAP-EBO. N])
[0097] -SEQ ID NO :113(对应于融合蛋白[SNAP-MAR. N])
[0098] -SEQ ID NO :115(对应于融合蛋白[SNAP-LAS. N])
[0099] -SEQ ID NO : 117 (对应于融合蛋白[SNAP-JUN. N])
[0100] -SEQ ID NO :119(对应于融合蛋白[SNAP-MAC. N])
[0101] -SEQ ID NO :121(对应于融合蛋白[SNAP-GUA.N])
[0102] -SEQ ID NO :123(对应于融合蛋白[SNAP-SAB. N])
[0103] -SEQ ID NO :125(对应于融合蛋白[SNAP-OMSK. EDIII])
[0104] -SEQ ID NO :127(对应于融合蛋白[SNAP-KYA. EDIII])
[0105] -SEQ ID NO :129(对应于融合蛋白[SNAP-ALK. EDIII])
[0106] -SEQ ID NO :131 (对应于融合蛋白[SNAP-LAS. ectoGPl])
[0107] -SEQ ID NO :133(对应于融合蛋白[SNAP-JUN. ectoGPl])
[0108] -SEQ ID NO :135(对应于融合蛋白[SNAP-MAC. ectoGPl])
[0109] -SEQ ID NO :137(对应于融合蛋白[SNAP-GUA. ectoGPl])
[0110] -SEQ ID NO :139(对应于融合蛋白[SNAP-SAB. ectoGPl])
[0111] -SEQ ID NO :141(对应于融合蛋白[SNAP-LAS. ectoGP2])
[0112] -SEQ ID NO :143(对应于融合蛋白[SNAP-JUN. ectoGP2])
[0113] -SEQ ID NO :145(对应于融合蛋白[SNAP-MAC. ectoGP2])
[0114] -SEQ ID NO :147(对应于融合蛋白[SNAP-GUA. ectoGP2])
[0115] -SEQ ID NO : 149 (对应于融合蛋白[SNAP-SAB. ectoGP2])，以及
[0116] -SEQIDN0:151(对应于融合蛋白[SNAP-HEV·C])。
[0117] 因此，本发明的体外方法能够检测为病毒、细菌、酵母或真菌介导感染的靶疾病。 优选地，所述病毒感染是由以下导致：乳头瘤病毒或来自黄病毒科（登革、黄热、西尼罗、 日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒）的RNA病毒、披膜病毒科（基孔肯雅、罗斯河、马雅 罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒）、本雅病毒科（克里米亚-刚果出血 热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病毒科（拉沙）和丝状 病毒科（埃博拉、马尔堡）。优选地，所述细菌感染是由问号钩端螺旋体（L印tospirosa Interrogans)导致的。优选地，所述感染是由恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)导致 的。
[0118] 如本文所用，术语"生物样本"是指从患者已经获得的并可能含有抗体的任何样 本。优选地，所述生物样本是生物液体，例如未经过滤的生物液体如尿液、脑脊液、胸膜液、 滑膜液、腹膜液、羊水、胃液、血液、血清、血浆、淋巴液、组织液、唾液、生理分泌物、眼泪、粘 液、汗液、乳汁、精子、精液、阴道分泌物、来自溃疡和其它表面皮疹、水泡、以及脓肿的液体。 其也指组织提取物，包括正常、恶性以及可疑组织的活检、或可含有抗体的身体的任何其它 成分。在所述生物样本可以在使用前预先处理，例如从血液制备血浆、稀释粘性流体等；治 疗方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、干扰化合物的失活、以及加入试剂。在优选的实施方案 中，所述生物样本选自全血、血清、血浆、尿液、精液、脑脊髓液和唾液。
[0119] 在本发明方法中可以使用任何具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的多肽。 出于本发明的目的，这些多肽将称为"AGT多肽"。
[0120] AGT从其底物06-烷基鸟嘌呤-DNA上将烷基不可逆地转移至其半胱氨酸残基之 一。迅速与AGT反应的底物类似物是06-苄基鸟嘌呤，其二级速率常数为约103秒
[0121] 在本发明的上下文中，如果多肽能够从含有ο6-烷基鸟嘌呤的分子上将烷基不可 逆地转移至其自己的半胱氨酸残基之一上，则认为多肽具有"0 6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转 移酶的活性"（或"AGT活性")。例如，通过接触已知标记的06-苄基鸟嘌呤衍生物并监测所 述标记转移至测试多肽，可证明所述多肽的"06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性"。如 果在细胞（in cellulo)或在细胞提取物中进行分析，宿主细胞的内源性AGT反应应加以控 制以使内源性AGT不干扰所述多肽。因此，优选使用已知的AGT-缺陷细胞系。现在，鉴定 AGT活性的分析是公知的。几个06-苄基鸟嘌呤衍生物是商业上可获得的（例如通过Santa Cruz生物技术分销得到0 6-苄基鸟嘌呤，以及荧光标记的06-苄基-鸟嘌呤衍生物可从New England Biolabs NEB 获得）。这些分析中的一些在 W0 2005/085470 和 W02004/031405 中 公开。
[0122] 在本发明的上下文中，AGT多肽的"催化结构域"对应于所述酶的活性位点，或者 换句话说，对应于酶的部分，其中发生从其底物0 6-烷基鸟嘌呤-DNA将烷基至反应半胱氨 酸残基的转移。在hAGT于其活性位点结合06-苄基鸟嘌呤的结构中，4个氨基酸在苄基 环（Prol40、Serl59、Glyl60)上接近，或可以接触核碱基（Asnl57)的N9。之前已证明在 位置Prol40和Glyl60上的突变影响hAGT与0 6-苄基鸟嘌呤的反应（Xu-Welliver等人， Biochemical Pharmacology 1999):认为在位置140上的脯氨酸对于其与节基环的相互作 用是至关重要的，以及突变Glyl60Trp已被证明增加 hAGT对06-苄基鸟嘌呤的反应性。
[0123] 在优选的实施方案中，具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽是序 列 SEQ ID NO: 1 的人 AGT 多肽（参考 ΝΡ_002403· 2)、鉴定为 ΝΡ_032624· 1 的小鼠 AGT(SEQ ID NO :18)、鉴定为NP_036993. 1的大鼠 MGMT(SEQ ID NO :19)或者其同源序列，所述源序列 具有〇6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
[0124] 如本文所用，术语"同源的"是指具有序列相似性的序列。术语"序列相似性"，以 其所有语法形式，是指核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应程度。在本发明的上下文中， 当至少约80%、或者至少约81 %、或者至少约82%、或者至少约83%、或者至少约84%、或 者至少约85%、或者至少约86%、或者至少约87%、或者至少约88%、或者至少约89%、或 者至少约90%、或者至少约91 %、或者至少约92%、或者至少约93%、或者至少约94%、或 者至少约95%、或者至少约96%、或者至少约97%、或者至少约98%、或者至少约99%的氨 基酸相似时，两条氨基酸序列是"同源的"。优选，通过使用Needleman和ffunsch算法鉴定 相似或同源的多肽序列。
[0125] 优选地，AGT酶的同源序列与SEQ ID NO: 1分享至少64%的氨基酸序列同一性， 优选至少约65%的氨基酸序列同一性、或者至少约66%的氨基酸序列同一性、或者至少约 67%的氨基酸序列同一性、或者至少约68%的氨基酸序列同一性、或者至少约69%的氨基 酸序列同一性、或者至少约70%的氨基酸序列同一性、或者至少约71%的氨基酸序列同一 性、或者至少约72 %的氨基酸序列同一性、或者至少约73 %的氨基酸序列同一性、或者至 少约74 %的氨基酸序列同一性、或者至少约75 %的氨基酸序列同一性、或者至少约76% 的氨基酸序列同一性、或者至少约77%的氨基酸序列同一性、或者至少约78%的氨基酸序 列同一性、或者至少约79 %的氨基酸序列同一性、或者至少是80 %的氨基酸序列同一性、 或者至少约81 %的氨基酸序列同一性、或者至少约82%的氨基酸序列同一性、或者至少约 83%的氨基酸序列同一性、或者至少约84%的氨基酸序列同一性、或者至少约85%的氨基 酸序列同一性、或者至少约86%的氨基酸序列同一性、或者至少约87%的氨基酸序列同一 性、或者至少约88 %的氨基酸序列同一性、或者至少约89 %的氨基酸序列同一性、或者至 少约90%的氨基酸序列同一性、或者至少约91%的氨基酸序列同一性、或者至少约92%的 氨基酸序列同一性、或者至少约93%的氨基酸序列同一性、或者至少约94%的氨基酸序列 同一性、或者至少约95%的氨基酸序列同一性、或者至少约96%的氨基酸序列同一性、或 者至少约97%的氨基酸序列同一性、或者至少约98%的氨基酸序列同一性以及或者至少 约99%的氨基酸序列同一性。在优选的实施方案中，SEQ ID N0 :1的同源序列与SEQ ID NO : 1至少64 %，优选70 %，以及更优选80 %相同。
[0126] 在优选的实施方案中，所述同源多肽是SEQ ID NO: 1的hAGT多肽的片段或突变 体，所述片段或突变体具有〇6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
[0127] 所述片段可具有至少50种，优选100种，以及更优选150种氨基酸的尺寸，并且至 少包含如上定义的AGT多肽的"催化结构域"，其负责AGT酶的0 6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转 移酶活性。这些片段可使用技术人员已知的一般技术获得。
[0128] 到目前为止，已经描述了源自天然AGT的不同突变酶（Lim A.等人，1996 ;Daniels D.S.等人，2000 Juillerat Α·等人，2003、W0 2005/085470、W0 2004/031405)。尤其是， 获得了含有突变 Cys62Ala、Lysl25Ala、Alal27Thr、Argl28Ala、Glyl31Lys、Glyl32Thr、 皿6七1341^11、4找135561'、〇78150561'、4811157617、561'1596111、在182位氨基酸被截短的201^^ 的突变蛋白（WO 2005/085470中所谓的"AGT26"突变体，在WO 2006/114409中也称为 "SNAP 26"）。这种特定突变体"SNAP26"已被证明具有增强的标记活性。
[0129] 在本发明的上下文中，更优选的AGT多肽序列包含W0 2005/085470中描述的突 变，其位置相对于SEQ ID N0:1可以很容易地调换，SNAP26的起始蛋氨酸残基对应于SEQ ID N0 :1第32位的蛋氨酸残基（因此，31个氨基酸应加入到W0 2005/085470所公开的位 置中，从而获得SEQ ID NO: 1中对应的那些）。
[0130] 在优选的实施方案中，用于本发明的AGT同源序列对应着SEQ ID N0 :1的天然AGT 序列，其中在1和30个之间，优选6和25个之间，以及特别是14、15、16、17、18、19、20、21、 22或23个氨基酸被其它氨基酸所取代，和/或在C-端1至40个，优选1至20个，特别是 10至20个氨基酸，更优选15个氨基酸被删除。
[0131] 在更优选的实施方案中，与SEQ ID N0 :1相比，AGT同源序列包含以下突变：
[0132] (A)Lys31取代为Arg、或Met32取代为Ser、或Cys93取代为Ala、或Lysl56取代 为Ala、或Alal58取代为Thr、或Argl59取代为Ala、或Glyl62取代为Lys、或Glyl63取代 为Thr、或Metl65取代为Leu、或Argl66取代为Ser、或Cysl81取代为Ser、或Asnl88取代 为Gly、或Serl90取代为Glu、或Gly214取代为Pro、或Ser215取代为Ala、或Ser216取代 为Gly、或Gly217取代为lie、或Leu218取代为Gly、或Gly220取代为Pro、或Ala221取代 为Gly、或Trp222取代为Ser，或
[0133] (B)Lys31-Met32 取代为 Arg-Ser、或 Alal58-Argl59 取代为 Thr-Ala、或 Glyl62-Glyl63 取代为 Lys-Thr、或 Metl65-Argl66 取代为 Leu-Ser、或 Glyl62-Glyl63/ Metl65-Argl66 取代为 Lys-Thr/Leu-Ser、或 Asnl88/Serl90 取代为 Gly/Glu、或 Gly214-Se r215-Ser216-Gly217-Leu218 取代为 Pro-Ala-Gly-Ile-Gly、或 Gly220-Ala221-Trp222 取 代为Pro-Gly-Ser，优选与（A)中描述的任何其它氨基酸取代相组合，或
[0134] (C)在Leu223后截断（氨基酸224-238被删除），优选与（A)或（B)中描述的任 何其它氨基酸取代相组合。
[0135] 优选的AGT同源序列是在Leu223后被截断的那些。
[0136] 优选的AGT同源序列是在其中存在修饰（B)中的2个的那些，以及任选在Leu223 后截断。
[0137] 优选的AGT同源序列是在其中存在修饰（B)中的3个的那些，以及任选在Leu223 后截断。
[0138] 优选的AGT同源序列是在其中出现修饰（B)中的4个的那些，以及任选在Leu223 后截断。
[0139] 优选的AGT同源序列是在其中存在修饰（B)中的5个的那些，以及任选在Leu223 后截断。
[0140] 优选的AGT同源序列是在其中存在修饰（B)中的6个的那些，以及任选在Leu223 后截断。
[0141] 其它优选的 AGT 同源序列是含有 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20个选自（A)中公开的修饰的突变的组合的那些，以及任选在Leu223后截断。
[0142] 在一个非常更优选的实施方案中，本发明的AGT多肽是SEQ ID N0 :2的SNAP突 变体，其与hAGT酶同源并且与SEQ ID N0:1相比含有突变Lys31Arg、Met32Ser、Cys93Ala、 Lysl56Ala> Alal58Thr> Argl59Ala> Glyl62Lys> Glyl63Thr> Metl65Leu> Argl66Ser> Cysl81Ser、Asnl88Gly、Serl90Glu、Gly214Pro、Ser215Ala、Ser216Gly、Gly217ne、 Leu218Gly、Gly220Pro、Ala221Gly、Trp222Ser、以及在Leu223 后截断。SEQIDN0:2的 SNAP突变体与人6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（NP_002403. 2，SEQ ID NO :1)的氨基酸 序列共享77%的同源性，并且与小鼠6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（NP_032624. 1，SEQ ID NO :18)的氨基酸序列共享70%的同源性。
[0143] 在甚至更优选的实施方案中，AGT酶是SEQ ID N0 :2的具有06-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶活性的SNAP突变蛋白或其同源物。优选地，所述SNAP突变蛋白的同源序列与序 列SEQ ID N0 :2的SNAP突变蛋白是至少高于80%、优选81 %、更优选82%、更优选83%、 更优选84 %、更优选85 %、优选86 %、更优选87 %、更优选88 %、更优选89 %、更优选90 %、 更优选91 %、更优选92 %、更优选93 %、更优选94 %、更优选95 %、更优选96 %到甚至更优 选97%相同，并且具有如上定义的06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
[0144] 可以使用技术人员已知的蛋白工程技术、和/或使用分子进化来产生所述具有 06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的同源多肽，以产生和选择新的0 6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶。这种技术是，例如靶向诱变、噬菌体展示法、饱和诱变、易错PCR以在序列的任 何地方引入变化，在饱和诱变和/或易错PCR后使用的DNA改组（shuffling)、或者使用来 自几个物种的基因进行的家族改组。
[0145] 在最优选的实施方案中，在本发明方法中使用的AGT多肽是SEQ ID N0:2的SNAP 突变体。
[0146] AGT酶从其底物06-烷基鸟嘌呤-DNA上将烷基不可逆地转移至其半胱氨酸残基之 一上。然而，在苄基环C4上的0 6-苄基鸟嘌呤的取代并不显著影响AGT对06-苄基鸟嘌呤 衍生物的反应性。这种性质已用来将附在苄基环C4上的标记转移至AGT的苄基环（参见 W0 2004/031404 和 W0 2005/085470)。
[0147] 已证明一些06-苄基鸟嘌呤衍生物通过将其苄基转移至AGT酶的活性位点半胱氨 酸上来与 AGT 酶反应（参见 Damoiseaux 等人，ChemBiochem.，2001、W0 2004/031404 和 W0 2005/085470)。
[0148] 在优选的实施方案中，在本发明方法中使用的AGT底物是06苄基鸟嘌呤衍生物， 其具有式I :
[0149] R1-X-CH2-R3-R4-Y
[0150] 其中：
[0151] -R1是被所述AGT多肽作为底物识别的基团，例如含有1至5个氮原子的杂芳基 团，以及优选如下式的嘌呤自由基：
[0152]

【权利要求】
1. 一种用于检测存在于来自受试者的生物样本中至少两种不同靶抗体的体外分析方 法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供第一融合蛋白，其包括： -含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽，以及 -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽； (b) 使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底 物共价偶联； (c) 获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物； (d) 提供第二融合蛋白，其包括： -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别， 以及 -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽； (e) 使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底 物共价偶联； (f) 获得第二固体支持物，其与由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表 位共价偶联， 其中所述第一和第二固体支持物可彼此特异性地鉴定； (g) 使所述生物样本与获自步骤（c)和（f)的第一和第二固体支持物相接触； (h) 检测所述至少两种靶抗体的存在。
2. 根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的方法用于检测来自受试者的生物样本 中至少5种，更优选至少15种以及甚至更优选至少50种靶抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的分析方法，其中所述第一和第二表位属于相同的生物种 或属于不相关的生物种。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其中所述AGT多肽是SEQ ID N0:2 的SNAP突变体。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的分析方法，其中所述AGT多肽的所述底物是06 苄基鸟嘌呤衍生物，其具有式I : R1-X-CH2-R3-R4-Y 其中： -R1是含有1至5个氮原子的杂芳基团，优选如下式的嘌呤自由基：
其中R5是氢、卤素如氯或溴、三氟甲基、或羟基；R6是氢、羟基或者未取代的或取代的 氨基；以及R2是氢、1至10个碳原子的烷基、或糖部分； -X是氧或硫原子；优选氧原子； -R3是芳香或杂芳基团，或任选地被连接至CH2的双键所取代的不饱和烷基、环烷基或 杂环基团；优选苯基，例如由在对位或间位的R4所取代的苯基； -R4是接头部分，优选-CH2-NH-C〇-NH-[C2H4-〇] n-，其中η在1至8,优选2至6之间； -Υ是反应性基团。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物可通过其特定 定位、尺寸、直径、重量、粒度测定、和/或标记来特异性鉴定。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物使用荧光染料、 生色团、放射性同位素、和/或质量标签来标记。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物由聚苯乙烯、纤 维素、硝基纤维素、玻璃、陶瓷、树脂、橡胶、塑料、二氧化硅、硅树脂、金属、和/或聚合物制 成。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物在接触AGT底 物之前已使用与AGT底物的反应性基团互补的基团进行官能化。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物使用表面羧基 基团进行官能化。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的分析方法，其中所述AGT底物通过碳二亚胺 反应共价偶联至所述固体支持物。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物是试管、微量 滴定孔、片、珠、芯片、和/或微粒。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物是微粒。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物有磁性。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物是用荧光染 料进行内部标记的微粒。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的分析方法，其中所述固体支持物是用荧光染 料进行内部标记的具有磁性的微粒，其封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被中以 便共价偶联配体。
17. 根据权利要求1至16中任一项所述的分析方法，其中所述第一和/或第二表位 存在于病毒蛋白中，所述病毒蛋白选自：SEQ ID ΝΟ:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID N0:4的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID NO:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID NO:6 的登革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID NO:7的西尼罗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:8的黄 热病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:9的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 10的寨卡病 毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 11的威塞尔布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 12的罗西奥 病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 13的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO: 14的圣 路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56编 码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:57编码的基因型5的日本脑炎 病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:58编码的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIVUHIV2、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒以及致癌HPV株例如HPV16U8、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 的病毒蛋白。
18. 根据权利要求1至16中任一项所述的分析方法，其中与所述第一和第二固体支持 物偶联的所述第一和第二融合蛋白选自：SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:76、SEQ ID N0:78、SEQ ID N0:80、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:84、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:88、SEQ ID N0:90、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:98、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:102、 SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:111、SEQ ID N0:113、SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:119、SEQ ID N0:121、SEQ ID N0:123、SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:127、 SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149 和 SEQ ID NO:151。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的分析方法，其中所述生物样本选自全血、血 清、血浆、尿液、精液、脑脊髓液和唾液。
20. -种试剂盒，其用于检测存在于来自受试者的生物样本中的至少两种不同的靶抗 体，其包括在权利要求1中所限定的至少两种固体支持物： -在权利要求1的步骤（c)中所获得的第一固体支持物，其共价偶联至第一 靶抗体所识别的第一表位；以及 -在权利要求1的步骤（f)中所获得的第二固体支持物，其共价偶联至第二 靶抗体、而不是所述第一靶抗体所识别的第二表位； 其中所述至少两种固体支持物可以特异性地彼此鉴定以便能够检测两种不同靶抗体。
21. 根据权利要求20所述的试剂盒，其包括至少10种，优选至少50种，更优选至少100 种不同的偶联固体支持物。
22. 根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述固体支持物是微粒。
23. 根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒，其中所述固体支持物在至少一个单 区室中混合在一起。
24. 根据权利要求20至23中任一项所述的试剂盒，其中所述固体支持物是混合在微滴 定板的至少一个孔或在至少一个管中的微粒。
25. 根据权利要求20至24中任一项所述的试剂盒，其进一步包括用于检测结合至固体 支持物的至少两种靶抗体的工具。
26. 根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述工具是识别靶抗体恒定部分的第二抗 体，所述第二抗体优选被标记。
27. 根据权利要求20至26中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和/或第二表位存在 于病毒蛋白中，所述病毒蛋白选自：SEQ ID N0:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID N0:4 的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID N0:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID N0:6的登 革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID N0:7的西尼罗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID N0:8的黄热病 毒的EDIII蛋白、SEQ ID N0:9的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 10的寨卡病毒的 EDIII蛋白、SEQ ID NO: 11的威塞尔布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 12的罗西奥病毒 的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 13的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO: 14的圣路易 斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、 由SEQ ID N0:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56编码的 基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:57编码的基因型5的日本脑炎病毒 的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:58编码的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒的病毒蛋白以及致癌HPV株如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 的病毒蛋白。
28. 根据权利要求20至26中任一项所述的试剂盒，其包含由至少两种融合蛋白所包 被的至少两种固体支持物，所述至少两种融合蛋白选自：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:42、SEQ ID N0:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID N0:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO: 100、 SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO: 115,SEQ ID NO: 117,SEQ ID NO: 119,SEQ ID N0:12USEQ ID NO: 123,SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO: 137,SEQ ID NO: 139,SEQ ID N0:14USEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149 以及 SEQ ID NO: 151。
29. 权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒用于检测来自受试者的生物样本中至 少两种靶抗体的用途。
30. 权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒用于诊断受试者中至少两种靶疾病 的用途，其中所述靶疾病是由乳头瘤病毒或来自黄病毒科（Flaviviridae)(登革、黄热病、 西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科（Togaviridae)(基孔肯雅、罗斯 河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒）、本雅病毒科（Bunyaviridae) (克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（Caliciviridae)(戊型 肝炎病毒）、沙粒病毒科（Arenaviridae)(拉沙）或丝状病毒科（Filoviridae)(埃博拉、马 尔堡）的RNA病毒所引起的病毒感染，由问号钩端螺旋体（Leptospirosa Interrogans)引 起的细菌感染，或者由恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)引起的感染。
31. -种用于诊断受试者中至少一种靶疾病的体外方法，所述靶疾病已知在所述受试 者中诱导至少一种靶抗体的合成，所述体外方法包括进行权利要求1至19中任一项所限定 的分析方法，其中如果所述至少一种靶抗体的量高于对照值，则所述受试者被诊断为患有 所述至少一种靶疾病。
32. 根据权利要求31所述的体外诊断方法，其中所述至少一种靶疾病是由乳头瘤病毒 或来自黄病毒科（登革、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蝶传脑炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科 (基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒）、本雅病毒科 (克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病 毒科（拉沙）或丝状病毒科（埃博拉病毒、马尔堡）的RNA病毒所引起的病毒感染，由问号 钩端螺旋体引起的细菌感染，或者由恶性疟原虫引起的感染。
33. 根据权利要求31或32所述的体外诊断方法，其中所述方法用于诊断所述受试者中 至少5种，更优选至少15种以及甚至更优选至少50种病毒感染。
34. 根据权利要求31至33中任一项所述的体外诊断方法，其中所述对照值表示在来自 未患所述靶疾病的受试者样本中所述靶抗体的量。
35. -种用于在官能化的固体支持物上共价偶联具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶 活性的AGT多肽的方法，所述方法包括以下步骤： a) 活化所述官能化的固体支持物； b) 加入所述AGT多肽的底物，所述底物悬浮于含有在0和20%之间的DMSO的缓冲液 中，在适当条件下使得底物共价附着于所述支持物； c) 在PBS/DTT缓冲液中使所述AGT多肽接触步骤b)的底物包被的支持物； 其中未结合的分子在步骤b)和c)后被洗脱。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中DTT在PBS/DTT缓冲液中浓度是ImM。
37. 根据权利要求35至36中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是使用荧光染料 进行内部标记的具有磁性的微球，所述微球封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被 中。
38. -种通过权利要求35至37中任一项所述的方法获得的固体支持物。
39. 根据权利要求38所述的固体支持物，其中所述固体支持物是微球。
40. 根据权利要求38或39所述的固体支持物在根据权利要求1至19所述的分析方法 中的用途。
41. 一种载体，其用于在宿主细胞中表达施马伦贝格病毒的N核蛋白，所述载体包含编 码以下的核苷酸序列：a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽；b)6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶（AGT)、其突变体、片段或催化结构域；以及c)SEQ ID NO: 16的施马伦贝格病毒 的N核蛋白。
42. 根据权利要求41所述的载体，其包含核苷酸序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36 的核苷酸序列。
43. -种重组细胞，其被根据权利要求41或42所述的载体稳定地转染。
44. 根据权利要求43所述的重组细胞，其中所述重组细胞是昆虫细胞，优选S2细胞。
45. 根据权利要求43或44所述的重组细胞，其中所述重组细胞是S2细胞，其已在2012 年4月24日以编号CNCM 1-4616保藏在法国国家微生物保藏中心（CNCM)，巴斯德研究所 (法国，巴黎15区邮编75724, Docteur Roux大街25号）。
46. -种融合多肽，其包含：a) 6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（AGT) (EC 2. 1. 1. 63)、 其突变体或催化结构域；和b) SEQ ID NO: 16的施马伦贝格病毒的N核蛋白。
47. 根据权利要求46所述的融合多肽，其具有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID N0:46。
48. -种用于制造权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒的方法，所述方法包括以 下步骤： (a) 提供至少第一融合蛋白，其包含： -含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽，以及 -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽； (b) 使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底 物共价偶联； (c) 获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物； (d) 提供至少第二融合蛋白，其包括： -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别， 以及 -具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽； (e) 使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底 物共价偶联； (f) 获得与第二表位共价偶联的第二固体支持物，所述第二表位由第二靶抗体而不是 由所述第一靶抗体所识别； 其中所述至少第一和至少第二固体支持物可彼此特异性地鉴定出。
49. 一种多重免疫筛选分析，其包含至少2、25、50、96种权利要求1或48所限定的固体 支持物，并且其中每种所述固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长。
50. -种多重免疫筛选分析方法，其包括： a) 使一种或几种生物样本接触至少2、25、50、96种权利要求1或48所限定的固体支持 物，并且其中每种固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长；以及 b) 检测靶抗体的存在或不存在。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述靶抗体选自对来自病毒的抗原特异的抗 体，所述病毒根据WHO或FDA的指南为在血液库中待检测的，如例如选自HBV、HCV、HIV1、 HIV2和WNV的病毒。
52. 根据权利要求50所述的方法，其中所述靶抗体选自对致癌HPV株，例如HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 特异的抗体。
53. 根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中每种所述靶抗体使用可检测的标 记进行标记。
54. -种用于进行根据权利要求49所述的分析或根据权利要求50所述的方法的设备， 所述设备包括： -技术装置，其用于检测从固体支持物中发射的光源和从靶抗体或结合到靶抗体的标 记抗体中所发射的光源；以及 -计算或计算机装置，其用于鉴定哪种固体支持物与靶抗体结合，从而说明在分析样本 中存在或不存在抗原、细菌、病毒或寄生虫。
55. -种用于在生物样本中检测至少两种靶抗体的试剂盒，所述试剂盒包括： (a) 第一固体支持物，其包含与第一融合蛋白共价偶联的AGT底物，所述第一融合蛋白 包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表 位；以及 (b) 第二固体支持物，其包含与第二融合蛋白共价偶联的AGT底物，所述第二融合蛋白 包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗体、而不是由所述 第一靶抗体识别的第二表位。
56. -种用于在生物样本中检测至少两种靶抗体的方法，所述方法包括： (a) 使第一固体支持物与生物样本相接触，所述第一固体支持物包含共价偶联至第一 融合蛋白的AGT底物，所述第一融合蛋白包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的 AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表位； (b) 使第二固体支持物与生物样本相接触，所述第二固体支持物包含共价偶联至第二 融合蛋白的AGT底物，所述第二融合蛋白包含具有06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的 AGT多肽和由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位；以及 (c)检测两种靶抗体的存在或不存在。
【文档编号】G01N33/564GK104114697SQ201280069229
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月10日 优先权日:2011年12月9日
【发明者】J-C·马努圭拉, J·瓦努韦根, P·德普雷斯, S·保卢斯 申请人:巴斯德研究所