专利名称：辅助pbc诊断的抗体重链、轻链可变区及抗体的制作方法
辅助PBC诊断的抗体重链、轻链可变区及抗体
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于辅助诊断PBC的单克隆抗体。背景技术：
原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种由自身免疫反应介导的慢性肝内胆汁淤积性肝病，病程呈进行性，最终可发展为肝纤维化、肝硬化。研究显示，PBC检出率呈大幅度上升趋势，可达940/100万人口，PBC引起的死亡占肝硬化死亡的2%。因此，PBC作为重要的非病毒性肝病之一，其危害性不容忽视。然而，由于PBC表现呈多样性，缺少特异的血清学、病理学以及临床改变，目前对PBC的诊断仍采取综合判断的原贝U，利用排除法来确诊，极大地限制了其临床诊断。因此，寻找PBC特异的分子诊断标志物，对于PBC这一疑难疾病的临床诊断、早期干预以及药物靶点的开发至关重要。肝细胞膜转运相关分子与PBC发病密切相关。首先，PBC患者中，肝细胞膜转运相关分子表达异常。研究显示，肝细胞胆管侧细胞膜上BSEP和MRP2表达水平均下调，这种下调可能受转录因子RXRci/RARci和HNFl a的转录调控。其次，肝细胞膜转运相关分子已作为PBC治疗药物研发的重要靶点。PBC虽属自身免疫性疾病，但免疫抑制剂治疗效果欠佳。UDCA是目前美国食品药品监督管理局批准的可用于PBC治疗的唯一药物。多数学者认为，UDCA作为一种疏水性胆汁酸，维持肝细胞稳定、促进胆汁分泌是其治疗PBC的核心机制。再次，肝细胞膜转运相关分子的单核苷酸多态性(SNP)可能是PBC发病的重要机制。Paul1-Magnus等人比较了 PBC和正常人群中BSEP和MDR3基因序列中SNP位点的变化。发现BSEP基因的两个错义突变(G620D和A1228V)与PBC的发病相关。MDR3基因的四个位点错义突变(L73V、D243A、K435T和K1251Q)可能与PBC的发生有关。因此，从肝细胞膜转运相关分子入手，更有利于寻找PBC诊断标志物。
发明内容本发明旨在提供PBC辅助诊断抗体及其重链和轻链可变区。本发明是通过以下技术方案来实现:本发明所述的PBC诊断抗体的重链和轻链可变区，其轻链可变区的3个互补决定区(⑶R) DNA序列分别为:CDRl:aaggc cagtc agaat gtgta tactg ctgta gcc ；CDR2:tcggc atcca atcgg tacac t ；CDR3:cagca atata gcagc tatcc attca eg。轻链可变区的3个互补决定区(OTR)氨基酸序列分别为:CDRl:Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Ala ；CDR2:Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr ；CDR3:Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr。
重链可变区的3个互补决定区(OTR)DNA序列分别为:
CDRl:ggctt caaca ttaga gacac ctata tacac ；CDR2:aggat tgatc ctgcg gttgt taata ctaaa tatga cccga atttc caggg c ；CDR3:tactt tgact acD其中重链可变区的3个互补决定区(CDR)氨基酸序列分别为CDRl:Gly Phe Asn He Arg Asp Thr Tyr He His ；CDR2:Arg lie Asp Pro Ala Val Val Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Asn Phe Gln Gly ；CDR3:Tyr Phe Asp Tyr。优选地，轻链可变区的DNA序列为:atgga gtctc atact caggc ctttg tattc gcgtt tctct ggttg tctgg tgttg atggagacat tgtga tgacc cagtc tcaaa aattc atgtc cacat cagta ggaga caggg tcagcatcac ctgca aggcc agtca gaatg tgtat actgc tgtag cctgg tatca acaga gaccaggaca atctc ctaaa ctact gattt actcg gcatc caatc ggtac actgg agtcc ctgatcgctt cacag gcagt ggatc tggga cagat ttcac tctca ccatc agcaa tatgc agtctgaaga cctgg cagat tattt ctgcc agcaa tatag cagct atcca ttcac gttcg gctcggggac aaagt tggaa ataaa aD重链可变区的DNA序列为:atgaa atgca gctgg gttat cttct tcctg atggc agtgg ttaca ggggt caatt cagaggttca gctgc agcag tccgg ggcag agttt gtgaa gccag gggcc tcagt caagt tgtcctgcac agctt ctggc ttcaa catta gagac accta tatac actgg gttaa gcagc ggcctgaaca gggcc tggag tggat tggaa ggatt gatcc tgcgg ttgtt aatac taaat atgacccgaa tttcc agggc aaggc cacta taaca gcaga cacat cctcc ggcac agcct acctgcagct cagca gcctg acatc tgagg acact gccgt ctatt actgt actcc tgggt actactttga ctact ggggc caagg cgccc ctctc acagt ctcct ca或者优选地，轻链可变区的氨基酸序列为:Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe AlaPhe Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asplie Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie ThrCys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln SerPro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr GlySer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp·
Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu IleLys重链可变区的氨基酸序列为:Met Lys Cys Ser Trp Val lie Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu ValGln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys ThrAla Ser Gly Phe Asn lie Arg Asp Thr Tyr lie His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln GlyLeu Glu Trp lie Gly Arg He Asp Pro Ala Val Val Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Asn Phe GlnGly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser LeuThr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly GlnGly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser
一种用于诊断PBC的抗体，其含有上述的PBC诊断抗体的重链和轻链可变区。经过实验证明，本发明所述的抗体可以有效地辅助诊断PBC，当其抗原呈强阳性表达(+++)时提示PBC可能，需要再做进一步的确诊。
具体实施方式下面对本发明作详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明具体按以下步骤实施:1、单克隆抗体的制备1.1用蔗糖密度梯度离心法分离制备PBC患者的肝脏膜蛋白。1.2以分离的PBC患者肝脏膜蛋白为免疫原，免疫BALB/C小鼠(6_8周龄，雌性)。第一次免疫:取100 U g免疫原与等体积弗氏完全佐剂(购自美国Sigma公司)混匀后，多点皮下注射BALB/C小鼠；第二次免疫:隔3周后，取50ii g免疫原与等体积弗氏不完全佐剂(购自美国Sigma公司)混匀后，多点皮下注射BALB/C小鼠；第三次免疫:隔3周后，取50ii g免疫原与等体积弗氏不完全佐剂混匀后，多点皮下注射BALB/C小鼠；第三次免疫10天后，采集小鼠尾静脉血，间接ELISA法(细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P44-46)测定血清效价。第四次免疫:融合前3天，取30 y g免疫原与生理盐水混匀后，腹腔注射准备融合的BALB/C小鼠。
1.3取血清效价大于1: 32000的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，按常规方法(细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P11-12)进行融合。用含HAT和10%胎牛血清的RPM1-1640培养。融合后3天开始出现融合细胞，间接ELISA法和免疫组织化学方法(细胞与分子生物学常用实验技术，第一版，P44-51)筛选阳性克隆。所得阳性克隆通过有限稀释法(细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P13-15),获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1F9。1.4腹水制备和抗体亚型测定将1F9杂交瘤细胞以IX IO6个/只，腹腔注射预先用液体石蜡致敏的8-10周雌性BALB/C小鼠，10-14天后采集腹水。利用SBA Clonotyping System-HRP系统，确定1F9杂交瘤细胞分泌的抗体亚型为IgGl/K。2抗体轻链和重链可变区的测定2.11F9杂交瘤细胞培养按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88) 1F9杂交瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基于37°C，5% CO2孵箱中培养。2.2 总 RNA 提取用TRT7.DT,(S)Pl us RNA Purification System(购自美国 Invitrogen 公司)，按说明书提取总RNA。2.3RT-PCRcDNA第一链合成试剂盒购自美国Invitrogen公司，按产品说明进行反转录合成cDNA第一链。PCR扩增试剂盒购自Takara公司，以cDNA第一链为模板，按说明书进行PCR扩增。2.4PCR产物的克隆、筛选和测序PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,小量胶回收试剂盒(购自美国Axygen公司)回收抗体轻链和重链可变区片段，将回收片段插入标准克隆载体，筛选重组阳性克隆。用双脱氧核酸末端终止法测定基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。轻链可变区的DNA序列为:atgga gtctc atact caggc ctttg tattc gcgtt tctct ggttg tctgg tgttg atggagacat tgtga tgacc cagtc tcaaa aattc atgtc cacat cagta ggaga caggg tcagcatcac ctgca aggcc agtca gaatg tgtat actgc tgtag cctgg tatca acaga aaccaggaca atctc ctaaa ctact gattt actcg gcatc caatc ggtac actgg agtcc ctgatcgctt cacag gcagt ggatc tggga cagat ttcac tctca ccatc agcaa tatgc agtctgaaga cctgg cagat tattt ctgcc agcaa tatag cagct atcca ttcac gttcg gctcggggac aaagt tggaa ataaa a重链可变区的DNA序列为:atgaa atgca gctgg gttat cttct tcctg atggc agtgg ttaca ggggt caatt cagaggttca gctgc agcag tccgg ggcag agttt gtgaa gccag gggcc tcagt caagt tgtcctgcac agctt ctggc ttcaa catta gagac accta tatac actgg gttaa gcagc ggcctgaaca gggcc tggag tggat tggaa ggatt gatcc tgcgg ttgtt aatac taaat atgacccgaa tttcc agggc aaggc cacta taaca gcaga cacat cctcc aacac agcct acctgcagct cagca gcctg acatc tgagg acact gccgt ctatt actgt actcc tgggt actactttga ctact ggggc caagg caccc ctctc acagt ctcct ca或者优选地，轻链可变区的氨基酸序列为:Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asplie Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie ThrCys Lys Ala Se r Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln SerPro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr GlySer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala AspTyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu IleLys重链可变区的氨基酸序列为:Met Lys Cys Ser Trp Val lie Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu ValGln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys ThrAla Ser Gly Phe Asn lie Arg Asp Thr Tyr lie His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln GlyLeu Glu Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Val Val Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Asn Phe GlnGly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser LeuThr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly GlnGly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser3.确定 CDR 区获取抗体可变区序列后，利用NCBI数据库中的IgBlast在线工具，釆用Kabat编号算法，对可变区序列进行框架区(Frameworks, FRs)和互补决定区(ComplementaryDetermining Regions, CDRs)划分。4.辅助诊断PBC免疫组织化学方法检测1F9单克隆抗体识别的抗原在19例正常肝脏、45例脂肪性肝病、23例酒精性肝病、39例药物性肝病、61例乙型病毒性肝病及115例PBC患者肝组织中的表达。结果显示:正常肝脏中，1F9单克隆抗体识别的抗原呈极性分布，主要分布于肝细胞胆管侧；脂肪性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、乙型病毒性肝病中，1F9抗原的表达与正常肝脏无差异。然而，PBC肝脏中，不仅可以看到1F9抗原表达增强，同时约46% (53/115)患者可观察到1F9抗原表达分布紊乱、极性消失，甚至弥漫性分布于肝细胞胞浆中。利用十三点评分法对免疫组织化学结果进行评分，即以0 4分判定阳性细胞百分比:0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞百分比小于25% ；2分，阳性细胞百分比大于25%但小于50% ；3分，阳性细胞百分比大于50%但小于75%;4分，阳性细胞百分比大于75%。染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为0 3分。最终得分为两个指标的乘积，0分记为-，I 4分记为+, 5 8分记为++, 9 12分记为+++。利用非参数检验(Kruskal-Wallis test用于多组间比较，Mann-Whitney test用于两组间比较)对评分结果进行统计分析(见表I)，结果显示1F9抗原在PBC肝脏中的表达较其它组增强，且除PBC外的各组间表达无差异。Spearman相关性分析结果显示PBC分期与1F9抗原表达呈显著正相关(r = 0.74，P < 0.001)。提示患者体内1F9抗原呈强阳性表达(+++)时提示PBC可能，需做进一步确诊。
表1:1F9抗原在不同肝脏疾病中表达的半定量统计分析
权利要求
1.一种PBC诊断抗体的重链和轻链可变区，其特征在于其轻链可变区的3个互补决定区(CDR) DNA序列分别为:CDRl:aaggc cagtc agaat gtgta tactg ctgta gcc ；CDR2:tcggc atcca atcgg tacac t ；CDR3:cagca atata gcagc tatcc attca eg ； 重链可变区的3个互补决定区(⑶R)DNA序列分别为:CDRl:ggctt caaca ttaga gacac ctata tacac ；CDR2:aggat tgatc ctgcg gttgt taata ctaaa tatga cccga atttc caggg c ；CDR3:tactt tgact ac。
2.如权利要求1所述的PBC诊断抗体的重链和轻链可变区，其特征在于 轻链可变区的DNA序列为:atgga gtctc atact caggc ctttg tattc gcgtt tctct ggttg tctgg tgttg atggagacat tgtga tgacc cagtc tcaaa aattc atgtc cacat cagta ggaga caggg tcagcatcac ctgca aggcc agtca gaatg tgtat actgc tgtag cctgg tatca acaga aaccaggaca atctc ctaaa ctact gattt actcg gcatc caatc ggtac actgg agtcc ctgatcgctt cacag gcagt ggatc tggga cagat ttcac tctca ccatc agcaa tatgc agtctgaaga cctgg cagat tattt ctgcc agcaa tatag cagct atcca ttcac gttcg gctcggggac aaagt tggaa ataaa a ； 重链可变区的DNA序列为:atgaa atgca gctgg gttat cttct tcctg atggc agtgg ttaca ggggt caatt cagaggttca gctgc agcag tccgg ggcag agttt gtgaa gccag gggcc tcagt caagt tgtcctgcac agctt ctggc ttcaa catta gagac accta tatac actgg gttaa gcagc ggcctgaaca gggcc tggag tggat tggaa ggatt gatcc tgcgg ttgtt aatac taaat atgacccgaa tttcc agggc aaggc cacta taaca gcaga cacat cctcc aacac agcct acctgcagct cagca gcctg acatc tgagg acact gccgt ctatt actgt actcc tgggt actactttga ctact ggggc caagg caccc ctctc acagt ctcct Ca。
3.如权利要求1所述的PBC诊断抗体的重链和轻链可变区，其特征在于轻链可变区的氨基酸序列为:Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asplie Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser lie ThrCys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln SerPro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr GlySer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala AspTyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu IleLys ； 重链可变区的氨基酸序列为:Met Lys Cys Ser Trp Val lie Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu ValGln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys ThrAla Ser Gly Phe Asn lie Arg Asp Thr Tyr lie His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln GlyLeu Glu Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Val Val Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Asn Phe GlnGly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser LeuThr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly GlnGly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser0
4.一种用于诊断PBC的抗体，其特征在于含有如权利要求1所述的PBC诊断抗体的重链和轻链可变区。
全文摘要
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于诊断PBC的单克隆抗体。本发明所述的PBC诊断抗体轻链可变区的3个互补决定区(CDR)DNA序列分别为aaggccagtcagaatgtgtatactgctgtagcc；tcggcatccaatcggtacact；cagcaatatagcagctatccattcacg。重链可变区的3个互补决定区(CDR)DNA序列分别为ggcttcaacattagagacacctatatacac；aggattgatcctgcggttgttaatactaaatatgacccgaatttccagggc；tactttgactac。经过实验证明，本发明所述的抗体可以有效地辅助诊断PBC，当其抗原呈强阳性表达(+++)时提示PBC可能，需做进一步确诊。
文档编号G01N33/577GK103114096SQ201310019448
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者韩英, 王敬博, 时永全, 王璐, 周新民, 王学昌 申请人:中国人民解放军第四军医大学