β-链蛋白及基因的应用的制作方法

文档序号:6183797阅读:375来源:国知局
专利名称:β-链蛋白及基因的应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及β-链蛋白及基因在检测胰岛素瘤试剂和在胰岛素瘤药物筛选中的应用。
背景技术
胰岛素瘤是最常见的功能性胰岛细胞瘤,由Nicholis于1902年首先报道在尸检中发现,其发病率约为1/25万。胰岛素瘤的病因尚不清楚,其典型表现为明显的低血糖及神经系统症状,由于发病率较低及社区医生认知有限,容易被误诊成各种神经系统疾病,包括癫痫、癔症、精神障碍等。长期的低血糖可造成不可逆性的脑损害,引起智力减退、行为缓慢,严重者甚至生活不能自理,常给患者带来很大危害。如果能及时、快速、准确地检测出胰岛细胞瘤,让患者及时得到治疗,将是患者的福音。menin是抑癌基因MENl的编码产物,在进化过程中高度保守。临床上menin的变异可以直接导致多内分泌腺瘤病I型(MENl)的发生。尽管menin广泛分布于各种组织,但正如MENl病人或MENl杂合性突变小鼠所表现的症状那样,menin的缺失仅引起特定的组织器官发生病变,特别是内分泌器官,表现了其高度的功能组织特异性。menin蛋白的晶体结构类似于人半合的左手,拇指和其余手指围合起来连同掌心一起形成一个深的袋形结构,这个袋形结构的底部就是menin的活性中心,用于结合JunD、MLL等效应蛋白。虽然JunD和MLL结合的位点相同,但是menin对二者的调控作用却完全相反,其中的机制尚不清楚。Menin可以与很多蛋白发生作用。这些蛋白广泛地参与转录调节,细胞分裂和DNA修复。本实验室前期的研究发现,menin可以与β -链蛋白(β-catenin)结合并促使β-catenin出核。所以,本发明着重研究β-catenin是否在胰岛细胞瘤的生成过程中发生作用。

发明内容
本发明的目的是研究β -链蛋白(β -catenin)在小鼠胰岛素瘤发生中所起的作用,为临床上治疗和检测胰岛素瘤提`供理论依据和实验数据。本发明涉及链蛋白基因在检测胰岛素瘤试剂中的应用。本发明涉及链蛋白基因在胰岛素瘤药物筛选中的应用。本发明涉及链蛋白在检测胰岛素瘤试剂中的应用。本发明还涉链蛋白在胰岛素瘤药物筛选中的应用。肿瘤抑制基因Menl所编码的蛋白称为Menin,Menl条件性敲除小鼠(Menliwl0X-RipCre+, Menin-ΚΟ)正好提供了一个恰当的胰岛素瘤发生模型,Menin-KO小鼠也可以发生与MENl病人类似的肿瘤谱。实验中,在Menin-KO小鼠胰腺β细胞中进一步敲除β -catenin (DBK0小鼠),然后观察β-catenin的缺失是否能够影响胰岛素瘤的生成。在为期两年的生存率观察中,发现DBKO小鼠的生存率相比Menin-KO小鼠得到了明显提高。对Menin-KO小鼠和DBKO小鼠的死亡尸体进行解剖,在胰腺中均发现肉眼可见的肿瘤,而Menin-KO小鼠的肿瘤体积明显大于DBKO小鼠。肿瘤发生率的统计也表明Menin-KO小鼠的肿瘤发生率在各个观测时间点均高于DBKO小鼠,而在正常小鼠中没有发现胰腺肿瘤,说明β-catenin与胰岛素瘤成正关系,β-catenin —旦缺失,胰岛细胞瘤的发生率将明显降低。同时对各组转基因小鼠及对照正常组小鼠进行空腹血糖、随机血糖、空腹胰岛素水平进行了测试,结果表明,Menin-KO小鼠的胰岛β细胞胰岛素分泌丧失了糖依赖性,在低血糖的状态下仍然可以自主分泌胰岛素。年龄大的Menin-KO小鼠一般表现为活动明显减小,对刺激反应迟钝以及精神萎靡,符合低血糖的临床表现。在Menin敲除的基础上敲除β-catenin可以有效的逆转胰岛素瘤小鼠的低血糖,胰岛素分泌在一定程度上恢复了糖依赖性,从而提高了生存率。与现有技术相比,本发明的有益效果在于1、本发明通过转基因型小鼠的研究了,确定了 β-catenin对胰岛素瘤生长成正关系,能通过β-catenin的检测,快速、准确地对胰岛素瘤小鼠确诊。2、本发明为临床上β-catenin在检测胰岛素瘤试剂中的应用及在胰岛素瘤药物筛选中的应用提供了实验数据和理论基础。


图1为小鼠的生存率比较图。图2为小鼠的肿瘤发生率统计图。图3为胰腺肿瘤组织免疫组化染色对比图。图4为小鼠空腹血糖测试对比图。图5为小鼠随机血糖测试对比图。图6为 10月龄的小鼠的空腹血清胰岛素水平测试比较图。图7为15月龄的小鼠的空腹血清胰岛素水平测试比较图。
具体实施例方式下面结合实施例,对本发明作进一步说明实施例11、转基因小鼠模型的建立通过Cre/loxP技术建立胰岛β细胞条件性敲除β-catenin基因(Catnb)小鼠和Menl/ β -catenin双基因敲除小鼠模型I)购自美国Jackson Lab纯合型Catnb1 71 小鼠(携带IoxP修饰的β -catenin基因),将该小鼠与野生型C57小鼠交配获得Catnbiw+杂合型小鼠。2)将 β 细胞特异性的 Rat-1nsulin-promoter Cre (Rip-Cre)的小鼠,与 Catnb1 7lQX小鼠交配获得β细胞条件性敲除β-catenin基因小鼠模型(Catnbiwira1-RipCre+)(以下简称BBKO小鼠)。3) Menl 条件性敲除小鼠(Menl1ox7lox-RipCre+)(以下简称 Menin-KO 小鼠)与Catnbwirai小鼠交配,2代后获得纯合双基因敲除小鼠模型(Catnbwira1-Menlwl0X-RipCre+)(以下简称DBKO小鼠)小鼠饲养的环境为IVC独立送风饲养笼,温度控制在21±1° C,相对湿度为55± 10%,昼夜节律设为12-12小时,8am开灯,8pm关灯。水和食物充分供给自由取食。2、实验过程及结果
对20只DBKO小鼠和20只Menin-KO小鼠进行了 2年的生存率记录,结果显示DBKO小鼠的生存率大大高于Menin-KO小鼠,Menin-KO小鼠2年的生存率接近0%,而DBKO小鼠的生存率为80%,接近对照组小鼠(即正常小鼠)的90%,具体见图1所示;对4个月、6个月和8个月龄的Menin-KO小鼠、DBKO小鼠、BBKO小鼠及对照组小鼠(即正常小鼠)进行肿瘤发生率统计,结果显示DBKO小鼠的肿瘤发生率明显低于Menin-KO小鼠组,Menin-KO小鼠的肿瘤发生率在6个月时已经达到80%,8个月龄时达到100%,DBKO小鼠在6个月时为37. 5%,并且肿瘤发生率增加缓慢,8个月时仅为41. 7%,具体图2所示;而对各组小鼠进行胰腺肿瘤解剖探查发现,在Menin-KO小鼠胰腺均观察到肉眼可见的肿瘤组织,其肿瘤的大小明显大于DBKO小鼠,BBKO小鼠和对照组小鼠未探查到胰腺肿瘤。将肿瘤组织进行免疫组化染色发现,Menin-KO小鼠的胰岛素瘤出现明显的沟回样结构,核异质性明显,胰岛素染色减弱。而DBKO小鼠瘤组织沟回样结构没有Menin-KO小鼠明显,具体见图3所示(其中,图3a为Menin-KO组,图3b为DBKO组,图3c为BBKO组,图3d为对照组)。上述的结果表明β -catenin在胰岛细胞瘤的发生中发挥着重要作用,β -catenin 一旦缺失,胰岛细胞瘤的发生率将明显降低。将Menin-KO小鼠、DBKO小鼠、BBKO小鼠进行空腹血糖和随机血糖的测试,具体测试结果分别见图4和图5所示,从图中可以看出,Menin-KO小鼠的空腹血糖和随机血糖都明显低于对照组小鼠,尤其是图5中的数据表明18月龄的Menin-KO小鼠平均随机血糖只有1. 97mmol/L,而DBKO小鼠平均随机血糖达到5. 83mmol/L,接近于正常小鼠的8. 05mmol/L ;图6为10月龄的小鼠的空腹血清胰岛素水平,图7为15月龄的小鼠的空腹血清胰岛素水平,从图中的测定结果表明,Menin-KO小鼠的低血糖是由于胰岛素分泌过多造成的,Menin-KO小鼠的血清胰岛素分泌明显高于DBKO和对照小鼠。这表明Menin-KO小鼠的胰岛β细胞胰岛素分泌丧失了糖依赖性,在低血糖的状态下仍然可以自主分泌胰岛素。年龄大的Menin-KO小鼠一般表现为活动明显减小,对刺激反应迟钝以及精神萎靡,符合低血糖的临床表现。在Menin敲除的基础上敲除β -catenin可以有效的逆转胰岛素瘤小鼠的低血糖,从而提高了生存率。这表明DBKO小鼠的胰岛素分泌在一定程度上恢复了糖依赖性。
权利要求
1.β-链蛋白基因在检测胰岛素瘤试剂中的应用。
2.β_链蛋白基因在胰岛素瘤药物筛选中的应用。
3.链蛋白在检测胰岛素瘤试剂中的应用。
4.链蛋白在胰岛素瘤药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域,特别涉及β-链蛋白及基因在检测胰岛素瘤试剂中的应用和β-链蛋白及基因在胰岛素瘤药物筛选中的应用。本发明通过对转基因小鼠的尸体解剖、血糖和胰岛素水平的测定等实验,研究β-catenin与胰岛素瘤的生成的影响关系。实验结果表明β-catenin与胰岛素瘤成正关系,β-catenin一旦缺失,胰岛细胞瘤的发生率将明显降低。本发明的有益效果为通过β-catenin的检测,能快速、准确地对胰岛素瘤小鼠进行确诊。而且本发明也为临床上β-catenin在检测胰岛素瘤试剂中的应用及在胰岛素瘤药物筛选中的应用提供了实验数据和理论基础。
文档编号G01N33/68GK103060463SQ201310023750
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者宁光, 李峰, 李小英, 曹亚南, 姜秀丽 申请人:上海市内分泌代谢病研究所
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