专利名称：一种适合教学与科研使用的nk细胞活性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种NK细胞活性检测方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。体外检测NK细胞活性是了解NK细胞功能及其与某些疾病关系的一种重要手段，因而日益受到重视。目前把检测机体外周血中的NK细胞活性作为反映机体细胞免疫功能的一项重要指标，并用来判断某些疾病的发生、发展和预后。医学免疫学是一门实践性很强的学科，因此，开设实验课不仅可以验证学生在理论课上学到的相关理论知识，而且还能训练学生的基本实验操作技能、培养其科学思维能力，进而提高学生的综合素质。但由于NK细胞活性检测实验课时有限，要在有限的课时内使学生尽可能多的直观的了解更多的免疫学知识及实验操作技能，结合实际教学条件对NK细胞活性检测实验教学方法的改进显得尤为必要。目前检测NK细胞活性的方法有形态学法、同位素释放法、乳酸脱氢酶释放法、MTT比色法、荧光染料释放法、流式细胞计数仪法等，这些方法各有一定的优缺点。采取同位素释放法检测NK细胞的活性，虽然该法微量、客观、敏感，但由于同位素的设备条件较高，且操作繁琐及存在同位素防护和处理等问题，这样就导致了实验老师包揽了后续的实验操作，因而其在学生的实验教学中的应用受到限制。MTT比色法相对简便，能同时处理大量样本，并可定量检测，避免同位素掺入法的不稳定性和放射性污染，除广泛用于细胞的活化、增殖以及药物的细胞毒作用检测外，也广泛用于病毒感染细胞、肿瘤细胞及异常的自身细胞具有细胞毒作用的效应细胞活性测定，但是效、靶细胞孵育时间长，因细胞增殖速度不平衡造成NK细胞活性的非特异性增加而影响实验结果。流式细胞计数仪法检测NK细胞活性具有快速、敏感、所需效应细 胞少的优点，但是设备条件要求高，需要专业人员操作，目前难以在学生实验室中开展。
发明内容
一种适合教学与科研使用的NK细胞活性检测方法，由淋巴细胞分离、NK细胞的制备、靶细胞的制备、细胞毒试验步骤组成。其原理在于NK细胞具有自然杀伤肿瘤细胞的活性，检测NK细胞杀伤活性常用的敏感靶细胞如K562细胞。NK细胞通过与靶细胞的直接接触而杀死靶细胞，噻唑蓝(MTT)是水溶性浅黄色物质，经活细胞内线粒体代谢而生成蓝紫色的甲臜结晶，沉积于细胞内和细胞周围。在一定条件下甲臜生成量与活细胞的数量呈正比。通过测定OD值，可反映NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性。淋巴细胞分离1.无菌抽取静脉血2 mL或采用分离的脾细胞，去掉针头注入含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2 mL PH7. 2 Hank’s液进行对倍稀释，混匀。2.用吸管吸取稀释后的血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中(血液Hank’s液淋巴细胞分离液的比例为1:1:1)，使稀释血液缓慢逐层叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。3.离心2000r/minX20min，小心取出试管。4.用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hank’ s溶液洗漆两次,每次离心1500r/minX lOmin。5.弃上清液,加RPM1-1640培养液ImL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。在该步骤中可用毛细吸管轻轻吸取离心后中间层似白雾状的外周血单个核细胞，置入15ml离心管中，用生理盐水IOml洗涤细胞2次，代替用Hank’s液洗涤细胞，这样获得的细胞数明显增多。细胞的制备
利用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出单个核细胞。经RPM1-1640细胞培养液洗涤3次，置于细胞培养瓶中于25 37°C孵育I小时，以去除其他单核细胞(优选为37°C)。然后调整细胞浓度为2X106个/mL备用。因为单核细胞与NK细胞贴壁的速率不同，NK细胞贴壁的速率较慢，普通单核细胞先于NK细胞贴壁，此时培养液中绝大多数细胞都是NK细胞，所以采用25 37°C下孵育I小时的方法，能有效的去除大多数的普通单核细胞，该方法简单高效，但该方法不能保证完全去除所有的其他单核细胞，所以只适合教学和科研，并不能用于临床诊断。靶细胞的制备
取细胞培养的对数生长期的K562细胞，经细胞培养液洗涤3次，调整细胞浓度为2 X IO5个/mL。K562细胞来源为人慢性髓原白血病细胞，该细胞系对NK细胞的杀伤作用极为敏感，常用来作为NK杀伤实验的靶细胞。
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细胞毒试验
取上述效应细胞和靶细胞悬液各50 μ 1，加到96孔细胞培养板内混匀，同时设单独效应细胞对照孔和单独靶细胞对照孔，每个样本做3个复孔。于37°C，5%C02饱和湿度条件下孵育4小时，加入MTT溶液每孔10 μ I。继续孵育4小时，加SDS- 二甲基甲酰氨100 μ I终止反应，置37°C 14 18小时后，待其充分溶解后，在酶标仪上测定光密度值测定波长为570nm_630nm。优选 570nm。二甲基甲酰氨为一种极性溶剂可与多种溶液混合，本步骤中二甲基甲酰氨用于洗脱未结合的MTT，其使用液为10%SDS-50% 二甲基甲酰胺溶液采用IOg SDS放入IOOmL 50%二甲基甲酰胺中加热溶解。二甲基甲酰胺极性较其他常用的有机溶剂强，且对细胞毒性较小，所以用其洗脱MTT更为高效，实验结果也更为准确。但二甲基甲酰氨对人体也具有一定的毒性，所以实验中可以采用HCl-异丙醇代替二甲基甲酰胺，终止反应时每孔加入HCl-异丙醇溶液ΙΟΟμ 1，充分混匀后置酶标仪测定OD值。HCl-异丙醇溶液的配方为含有4% HCl和96%的异丙醇。该步骤中采用的MTT溶液配制方法为配制浓度为5g/l的MTT溶液，采用
O.Olmol/Ι磷酸缓冲液(pH7. 4)配制，过滤除菌，于_20°C保存。此外，每个样本每次最好取2 3个效靶比例(即效应细胞和靶细胞的比例)，范围一般在10:1 50:1，同时每个效靶比做3个复孔。混合前效应细施与靶细胞的存活力均应大于90%，否则过多的死细胞影响结
果O结果计算测定每孔OD值后按下列公式计算NK细胞的细胞毒活性
权利要求
1.一种NK细胞活性检测方法，由淋巴细胞分离、NK细胞的制备、靶细胞的制备、细胞毒试验步骤组成，其特征在于NK细胞的制备的步骤，将分离的淋巴细胞置于细胞培养瓶中于25 37。。孵育I小时。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于细胞毒试验步骤: 采用SDS- 二甲基甲酰氨溶液或HCl-异丙醇溶液终止反应。
3.根据权利要求2所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于SDS-二甲基甲酰氨溶液为含有10% SDS和50%的二甲基甲酰氨。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于淋巴细胞分离步骤用生理盐水代替Hank’ s液洗涤细胞。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于细胞毒试验步骤 每个样本每次取2 3个效靶比例，效靶比例范围为10:1 50:1。
6.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于I)淋巴细胞分离无菌抽取静脉血2 mL —注入含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2 mL PH7.2 Hank’ s液进行对倍稀释，混匀一然后用吸管吸取稀释后的血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中，使稀释血液缓慢逐层叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面，2000r/min离心20min —小心取出试管，然后用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层一用Hank’ s溶液洗漆两次,每次1500r/min离心IOmin,弃上清液一加RPM1-1640培养液ImL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定；2)NK细胞的制备利用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出单个核细胞，经RPM1-1640 细胞培养液洗涤3次，置于细胞培养瓶中于25 37°C孵育I小时，以去除其他单核细胞，然后调整细胞浓度为2 X IO6个/mL备用；3)靶细胞的制备取细胞培养的对数生长期的K562细胞，经RPM1-1640细胞培养液洗涤3次，调整细胞浓度为2 X IO5个/mL ；4)细胞毒试验取上述效应细胞和靶细胞悬液各50μ I —加到96孔细胞培养板内混匀，同时设单独效应细胞对照孔和单独靶细胞对照孔，每个样本做3个复孔，于37°C，5%C02 饱和湿度条件下孵育4小时一然后加入MTT溶液每孔10 μ 1，继续孵育4小时一加SDS- 二甲基甲酰氨100μ 1，置37°C 14 18小时后，待其充分溶解后一在酶标仪上测定光密度值测定波长为570nnT630nm —然后计算和分析结果。
全文摘要
一种适合教学与科研使用的NK细胞活性检测方法，由淋巴细胞分离、NK细胞的制备、靶细胞的制备、细胞毒试验步骤组成。其原理在于NK细胞具有自然杀伤肿瘤细胞的活性，检测NK细胞杀伤活性常用的敏感靶细胞如K562细胞。NK细胞通过与靶细胞的直接接触而杀死靶细胞，噻唑蓝(MTT)是水溶性浅黄色物质，经活细胞内线粒体代谢而生成蓝紫色的甲臜结晶，沉积于细胞内和细胞周围。在一定条件下甲臜生成量与活细胞的数量呈正比。通过测定OD值，可反映NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性。
文档编号G01N21/31GK103045712SQ201310029288
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月27日 优先权日2013年1月27日
发明者罗奇志, 余平, 龚拯, 黄柏胜, 王芙艳, 霍治, 王洁, 黎明 申请人:罗奇志