专利名称：一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光标记的方法
技术领域：
本发明属于病理学领域，具体地，本发明涉及一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法。
背景技术：
肿瘤标志物是肿瘤细胞在恶变、产生、发展、浸润、转移等过程中产生的与肿瘤细胞生长代谢密切相关的生理活性物质。它们往往仅见于胚胎组织，不存在极少存在于正常成人组织，但是在成人肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，通过检测其在相应的细胞或组织中的存在及其浓度的变化，确定不知来源的转移肿瘤的原发肿瘤，可进行肿瘤及其特性的诊断、分类，手术、化疗、放疗的监测，同时给据治疗前后指标的变化，进行评估患者的预后、治疗效果。肿瘤标志物作为病理诊断的依据，对提高临床肿瘤确诊水平具有重要的参考价值。目前随着科学的发展，肿瘤标志物的研究越来越深入，其对肿瘤细胞的生理意义得到逐步的揭示，同时，特异性强的新肿瘤标志物的发现，成为目前肿瘤研究中的一个重要的方向。随着研究的深入，肿瘤标志物的分类越来越精确，多项肿瘤标志物的联合应用，可大大提高检测的效率和准确率。目前组织的病理诊断标准主要是依据免疫组化技术，通过HE染色和一项肿瘤标志物的染色，进行肿瘤的诊断。鉴于免疫组化染色的颜色分类的缺陷，目前还无法实现在一张组织切片进行多标记物的鉴别。如果采用连续切片，在不同切片上进行肿瘤标志物的染色标记，虽然能实现多肿瘤标记物的识别，但是由于切片的自身厚度带来的缺陷，使得同一位点的不同标记物染色可能处在不同的细胞上，无法完全准确的反应同一细胞内的不同标志物水平。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，是肿瘤难以治愈的重要原因。近年来对CSC研究的深入以及干细胞分离技术的进步，使人们对恶性肿瘤有了新的认识，并且发现CSC在肿瘤的发生、生长、浸润、复发和转移中起重要作用。通过分离纯化CSCs，可以对其生物学特性如异质性肿瘤的演化、转移和抗药性机制等进行研究；鉴定CSCs的基因图谱，寻找CSCs的特异性靶位，研制新型针对CSCs的药物。对其特性研究的深入有助于阐明CSCs在肿瘤形成、生长、浸润、复发和转移中的作用机制，进而寻找彻底杀死CSCs的方法以达到最终治愈肿瘤的目的，为肿瘤的临床治疗展现一个全新视角，为肿瘤靶向治疗找到新靶点，使治愈肿瘤成为可能。至今研究人员已先后从乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌等恶性肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的成功分离使得肿瘤学领域的研究跨入CSCs研究时代。肿瘤干细胞的分离鉴定主要赖于CSC特有的表面分子标记物的识别和区别于普通肿瘤细胞的生物学特性。肿瘤干细胞表面分子标记有两类:一种是正常干细胞/祖细胞的标记。如⑶133，Nanog等。研究发现在人肝癌细胞株和原位肝癌组织中存在⑶133+细胞。另一类CSC标记可能是与肿瘤的发展、转移有关的标记，如EpCAM、⑶90+、⑶45+。目前，通过抗体介导识别细胞表面特异受体的方法来实现分别肿瘤细胞、肿瘤干细胞的方法，主要有流式细胞仪细胞仪和免疫荧光法。目前上述需要多抗原标记的技术还很难用免疫组化技术实现，目前同一切片上最多可进行两种抗体的标记，即通过标记辣根酶标记产生棕色和标记碱性磷酸酶产生蓝紫色来区分，但二者颜色的区分和技术操作上都有一定的困难，同时应用两种不同酶标记抗体进行免疫组化染色的应用极少。而免疫组化技术是医院病理科应用最成熟的技术，如何实现多抗原、多目标蛋白在切片的同一切面上进行免疫组化标记，对病理学的诊断的发展具有重要的作用。本发明提供了一种可在切片的同一切面上进行多靶点免疫组化标记的方法与技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，本发明方法实现了多抗原、多目标蛋白在切片的同一切面上进行免疫组化的染色标记，对病理学的诊断的发展具有重要的作用。为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下:
一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，是对组织蜡块进行切片时，取连续的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，即用于染色的两个组织切片表面属同一切面。对属同一切面的两张切片，分别进行不同靶点蛋白的免疫组化或免疫荧光染色，观察时，取对应的同一区域的组织染色结果进行重合比较，实现同一细胞或组织位点多靶点蛋白的存在分析。所述连续的两张切片是指是对组织切片时，紧连在一起的两张切片，第一张切片的背面与第二张切片的正面是一刀切开后的同一组织的两面。所述的切片的正面是指切片时面对切面操作者的一面，所述背面是靠近组织背对操作者的一面。所述靶点蛋白，是指病理检测中具有诊断效果的目标蛋白。本发明的显著优点:本发明的目的在于提供一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，本发明方法实现了多抗原、多目标蛋白在切片的同一切面上进行免疫组化的染色标记，对病理学的诊断的发展具有重要的作用。
具体实施例方式本发明的一种同一切面多靶点蛋白免疫组化染色标记的方法包括如下步骤: 将含肿瘤组织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织
时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入40%-60%的乙醇溶液中I分钟到5分钟，然后再放入40-60° C的热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。加入过氧化物酶阻断剂，其添加量要保证覆盖切片组织，室温孵育10分钟，PBS 缓冲液(组成:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HP04 10mmol/L, KH2P042mmol/L, pH7.2)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入⑶133抗体(鼠单抗，1:200)，一对中的另一切片加入乙醛脱氢酶抗体(兔单抗，1:200)，室温孵育I小时，PBS冲洗3X3分钟。加入辣根酶标记的二抗(50-200ML)，室温孵育15分钟，PBS冲洗3X3分钟。加入DAB显色液，室温孵育5分钟，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，PBS返蓝。经梯度酒精脱水(通过体积比为70%，80%，90%，95%，100%酒精浸泡脱水，其中每个浓度10分钟)干燥，二甲苯浸泡10分钟透明，然后在切片组织上滴加100-200ML的中性树胶，然后小心盖上盖玻片，防止形成气泡。中性树胶封片后进行显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果同一细胞CD133、乙醛脱氢酶都阳性(其中组织中的一个细胞在对应的两片组织上同时呈现棕色)，表明该组织中存在肿瘤干细胞。本发明的一种同一切面多靶点蛋白免疫荧光染色标记的方法包括如下步骤: 将含肿瘤组织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织
时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入40%-60%的乙醇溶液中I分钟到5分钟，然后再放入40-60° C的热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。PBS (配比同实施例1)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入PE标记的⑶24抗体(鼠单抗，1:150)、FITC标记的⑶44 (兔单抗，1:200)混合抗体，一对中的另一切片加入PE标记的ESA (1:200)、FITC标记的乙醛脱氢酶抗体(1:200)，室温孵育I小时，PBS冲洗3X3分钟。进行荧光显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果两片组织的同一细胞同时⑶24、⑶44、ESA、乙醛脱氢酶显绿色和红色荧光，表明该组织中存在肿瘤干细胞。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例是为了进一步说明本发明，但不应视为限制本发明。以下所用生化试剂除特别标明外均购自生工生物工程(上海)有限公司，抗体和临床组织石蜡切片为申请人(福州迈新生物技术开发公司)提供，操作步骤若无说明均为常规操作步骤。实施例1 (免疫组化2靶点标记):
将含肝脏肿瘤组织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入60%的乙醇溶液中I分钟，然后再放入60° C的热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。加入150ML的过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟，PBS缓冲液(组成:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HP04 10mmol/L, KH2P04 2mmol/L，pH7.2)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入⑶133抗体(鼠单抗，1:200)，一对中的另一切片加入乙醛脱氢酶抗体(兔单抗，1:200)，室温孵育I小时，PBS冲洗3 X 3分钟。加入辣根酶标记的200ML 二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗3 X 3分钟。加入DAB显色液，室温孵育5分钟，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，PBS返蓝。经梯度酒精脱水(通过体积比为70%,80%,90%,95%, 100%酒精浸泡脱水，其中每个浓度10分钟)干燥，二甲苯浸泡10分钟透明，然后在切片组织上滴加100ML的中性树胶，然后小心盖上盖玻片，防止形成气泡。中性树胶封片后进行显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果同一细胞同时CD133、乙醛脱氢酶显阳性(即其中组织中的一个细胞在对应的两片组织上同时呈现棕色)，表明该组织中存在肝肿瘤干细胞。 实施例2 (免疫组化4靶点标记):
将含胰腺肿瘤组织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入40%的乙醇溶液中5分钟，然后再放入40° C的热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。加入160ML过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟，PBS (配比同实施例I)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入CD24抗体(鼠单抗，1:150)、⑶44 (兔单抗，1:200)混合抗体，一对中的另一切片加入ESA (鼠单抗，1:200)、乙醛脱氢酶抗体(兔单抗，1:200)，室温孵育I小时，PBS冲洗3X3分钟。加入辣根酶标记抗鼠二抗和碱性磷酸酶标记的抗兔二抗，室温孵育15分钟，PBS冲洗3X3分钟。加入DAB、BCIP/NBT显色液，室温孵育5分钟，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，PBS返蓝。经梯度酒精脱水(通过体积比为70%，80%，90%，95%，100%酒精浸泡脱水，其中每个浓度10分钟)干燥，二甲苯浸泡10分钟透明，然后在切片组织上滴加200ML的中性树胶，然后小心盖上盖玻片，防止形成气泡。中性树胶封片后进行显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果同一细胞同时⑶24、⑶44、ESA、乙醛脱氢酶显阳性(即其中组织中的一个细胞在对应的两片组织上同时呈现棕色和蓝色两种颜色)，表明该组织中存在胰腺肿瘤干细胞。实施例3 (免疫荧光4靶点标记):
将含胰腺肿瘤组织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入40%的乙醇溶液中I分钟，然后再放入40° C热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。PBS (配比同实施例1)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入PE标记的⑶24抗体(鼠单抗，1:150)、FITC标记的⑶44 (兔单抗，1:200)混合抗体，一对中的另一切片加入PE标记的ESA (1:200)、FITC标记的乙醛脱氢酶抗体(1:200)，室温孵育I小时，PBS冲洗3X3分钟。进行荧光显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果两片组织的同一细胞同时⑶24、⑶44、ESA、乙醛脱氢酶显绿色和红色荧光，表明该组织中存在胰腺肿瘤干细胞。实施例4:
将含脑肿瘤织的蜡块固定在组织切片机上，对组织进行切片，当刀片运行到目标组织时，开始选取，将一串连在一起的连续切片放入60%的乙醇溶液中5分钟，然后再放入60° C的热水中展片，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面。同一切面的两张切片作为一对，分别进行不同待测蛋白的检测。一对石蜡切片经脱蜡、水化、自来水冲洗后置于加热至沸的EDTA溶液(pH9.0)中100°C连续加热20分钟。PBS (配比同实施例1)冲洗3次，每次3分钟(即冲洗3X3分钟)。一片加入PE标记的CD 133抗体(1: 200)、FITC标记的Sox-2单抗(1: 200)、AMCA标记的抗musash1-1单抗(1:200)的混合抗体；另一片加入PE标记的Bm1-1抗体(1:200)、FITC标记的nestin单抗(1:200)、AMCA标记的抗melk单抗(1:200)的混合抗体,室温孵育I小时，PBS冲洗3X3分钟。进行荧光显微镜观察。找出同一细胞对应的位置，如果两片组织的同一细胞同时⑶133、Sox-2、musash1-1、Bm1-1> nestin、melk显绿色、红色和蓝色突光,表明该组织中存在脑组织肿瘤干细胞。
权利要求
1.一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，其特征在于:对组织蜡块进行切片时，取连续的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，即用于染色的两个组织切片表面属同一切面。
2.根据权利要求1所述的一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，其特征在于:对属同一切面的两张切片，分别进行不同靶点蛋白的免疫组化或免疫荧光染色，观察时，取对应的同一区域的组织染色结果进行重合比较，实现同一细胞或组织位点多靶点蛋白的存在分析。
3.根据权利要求1所述的一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，其特征在于:所述连续的两张切片是指是对组织切片时，紧连在一起的两张切片，第一张切片的背面与第二张切片的正面是一刀切开后的同一组织的两面。
4.根据权利要求1所述的一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，其特征在于:所述的切片的正面是指切片时面对切面操作者的一面，所述背面是靠近组织背对操作者的一面。
5.根据权利要求2所述的一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，其特征在于:所述靶点蛋白，是指病理检测中具有诊断效果的目标蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，本发明方法对组织蜡块进行切片时，将切片放入相应液体中进行展片，进行目的片捞片时，选取连续相连的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，保证用于染色的两个组织切片表面属同一切面；对来源于同一切面的两张切片，分别进行不同靶点蛋白的免疫组化或免疫荧光染色，观察时，取同一区域的组织染色结果进行重合比较，实现同一细胞或组织位点多靶点蛋白的存在分析，达到同一细胞或组织待测位点进行多目标蛋白标记的效果。
文档编号G01N1/28GK103105324SQ20131003180
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者林齐心, 陈赞烽, 熊玉林, 王小亚 申请人:福州迈新生物技术开发有限公司