专利名称：一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法，尤其涉及一种在微流控芯片上实现对船舶压载水中存活单细胞生物的全自动检测、分选、计数和尺寸判定的装置和方法。
背景技术：
船舶压载水是用于为船舶提供稳性及调整船舶的吃水、吃水差，以满足船舶良好的操纵性能要求。装载部分压载水可以保证船舶在空载或部分空载以及在恶劣海况条件下的航行安全。船舶压载水中含有大量的水生生物，并且由船舶压载水造成的外来海洋生物入侵，已被全球环境基金组织(GEF)确认为危害海洋的四大威胁之一。为更好的管理和控制船舶压载水，国际海事组织(MO)于2004年通过了《国际船舶压载水和沉积物管理与控制公约》(以下简称公约)，公约强制规定船舶压载水排放前必须经过处理，并且处理后的船舶压载水中:(I)最小尺寸大于等于50 y m的活体生物个数小于10个/m3 ; (2)最小尺寸大于等于10 ii m但小于50 ii m的活体生物个数小于10个/mL ; (3)霍乱菌(01和0139)的浓度小于lCFU/100mL或lCFU/g浮游动物样品；(4)大肠杆菌的浓度小于250CFU/100mL ; (5)肠道球菌的浓度小于100CFU/100mL。公约还规定:港口国正式授权的官员有权根据相关导则对处理后的船舶压载水进行取样采样，看是否满足处理标准，但取样分析时间不能对船舶造成不当的延误。一旦公约生效，随着而来的一个巨大挑战是港口国如何开展相关的压载水处理性能的符合性检查。综合目前的技术来看，当前微生物检测和计数方法主要有培养计数法、数字图像分析法、溶液电阻抗法、显微摄影法、幻灯测量法、光学显微镜计数法、荧光显微镜计数法、最可几率数-聚合酶链式反应计数法(MPN-PCR法)、混浊度计数法、流式细胞术法、分子检测方法和生化活力检测等方法。但是，这些方法都需要利用实验室相对成熟的设备和仪器进行分析，体积庞大，费时，不能方便的带到现场，有些检测方法无法区分微生物的死活和尺寸。而且，有些检测仪器需要专门的技术人员操作，因此不适合。可见，发展面向压载水公约要求下的海事执法检查的微型化和便携化分析仪器和设备具有重要和迫切的研发需求，并且在提高我国海事执法水平、保障航运和保护海洋环境等方面也具有重要意义。
发明内容
为解决现有微生物检测仪器应用于船舶压载水检测存在的上述不足之处，本发明提出采用差分库尔特电子检测和激光诱导荧光检测联合法，通过电渗驱动样品流动，在微流控芯片上实现对船舶压载水中存活单细胞生物的全自动检测、分选、计数和尺寸判定。由于样品采用电动驱动和操控，避免了泵阀的使用，可方便的集成为便携化的检测仪器。本发明提供一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法。
一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置，其特征在于，包括PDMS微流控芯片，位于PDMS微流控芯片下方与PDMS微流控芯片封接的玻璃底片G ;所述PDMS微流控芯片包括储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E、主通道、第一聚焦通道、第二聚焦通道、检测通道、第一分选通道、第二分选通道，储液孔A与主通道连接，储液孔B与第一聚焦通道连接，储液孔C与第二聚焦通道连接，储液孔D与第一分选通道连接，储液孔E与第二分选通道连接，第一分选通道、第二分选通道通过检测通道与主通道连接，第一聚焦通道、第二聚焦通道与主通道连接；储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中插入钼电极，储液孔A中的钼电极的另一端与直流电源的正极相连，储液孔E中的钼电极的另一端通过电阻R、双刀双掷继电器和电位器连接至直流电源的负极，储液孔D的钼电极的另一端通过双刀双掷继电器和电位器连接至直流电源的负极，储液孔B和储液孔C中的钼电极直接与直流电源的负极相连接，电阻R两端通过导线连接至差分放大电路的两个输入端，差分放大电路的输出端连接至ARM的输入端；检测通道的上方设置激光发射探头，激光发射探头发射的激光通过第一滤光片进入检测通道，在玻璃底片G下方对着检测通道的位置设置第二滤光片，在第二滤光片的下方设置雪崩探测器，雪崩探测器的输出端连接放大电路的输入端，放大电路的输出端连接至ARM。一种采用权利要求1所述的装置进行快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的方法，其特征在于，包括如下步骤:I)样品提取步骤:从待检测的船舶压载水中提取船舶压载水样品；2)船舶压载水样品以及缓冲液滴加步骤:将采用FDA染料染色后的船舶压载水样品加入到储液孔A中；并向储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中分别滴加缓冲液；3)接通直流电源对储液孔A中的船舶压载水样品进行电渗输运；4)当船舶压载水样品中没有存活单细胞生物时，单细胞生物样品在电渗流的作用下全部通过第一分选通道输送至储液孔D ;5)当船舶压载水样品中存在存活单细胞生物时，活的单细胞生物通过检测通道时，激光发射探头发出的激光对经过FDA染料染色的带有荧光的单细胞生物进行激发，激发出的荧光信号经过第一滤光片和第二滤光片进入雪崩探测器进行光电信号转换，从雪崩探测器输出的电信号经信号放大电路放大后发送至ARM，并且发送至双刀双掷继电器使双刀双掷继电器动作，使储液孔D和储液孔E的电压互换，将或的单细胞生物样品分选至液压孔E中，持续预设时间后结束双刀双掷继电器的动作，使储液孔D和储液孔E中的电源恢复至互换前的数值；6)获得存活单细胞生物的个数以及存活单细胞生物的大小的检测值.存活单细胞生物的个数检测值等于荧光脉冲信号的个数；根据电阻R两端检测到的电压脉冲信号的幅值来判定存活单细胞生物的大小。实施本发明的快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法，具有以下有益效果:(I)采用库尔特电子检测和激光诱导荧光检测联合法，通过电渗驱动样品流动，在微流控芯片上实现对船舶压载水中存活单细胞生物的全自动检测、分选、计数和尺寸判定，采用少量的样品和试剂即可快速获得检测结果；(2)采用微流控芯片进行样品检测，并且采用基于AD620的差分放大电路，和迷你激光诱导荧光检测系统，整个装置的体积很小，可 便携式的用于开展现场分析。
图1是本发明的快速检测船舶压载水中存活单细胞生物装置的一实施例的结构示意图；图2是本发明的微流体芯片的一实施例的结构示意图。图中:1、直流电源；2、电位器；3、双刀双掷继电器；4、电阻R ;5、差分放大电路；6、激光发射探头；7、第一滤光片；8、第二滤光片；9、雪崩探测器；10、放大电路；11、ARM ;12、主通道；13、第一聚焦通道；14、第二聚焦通道；15、检测通道；16、第一分选通道；17、第二分选通道。
具体实施例方式本发明提供一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法，下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明。图1是本发明的快速检测船舶压载水中存活单细胞生物装置的一实施例的结构示意图；图2是本发明的微流体芯片的一实施例的结构示意图，如图所示。PDMS微流控芯片P包括储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E、主通道
12、第一聚焦通道13、第二聚焦通道14、检测通道15、第一分选通道16、第二分选通道17，储液孔A与主通道12连接，储液孔B与第一聚焦通道13连接，储液孔C与第二聚焦通道14连接，储液孔D与第一分选通道16连接，储液孔E与第二分选通道17连接，第一分选通道16、第二分选通道17通过检测通道15与主通道12连接，第一聚焦通道13、第二聚焦通道14与主通道12连接；储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中插入钼电极，储液孔A中的钼电极的另一端与直流电源的正极相连，储液孔E中的钼电极的另一端通过电阻R4、双刀双掷继电器3和电位器2连接至直流电源I的负极，储液孔D的钼电极的另一端通过双刀双掷继电器3和电位器2连接至直流电源I的负极，储液孔B和储液孔C中的钼电极直接与直流电源I的负极相连接，电阻R4两端通过导线连接至差分放大电路5的两个输入端，差分放大电路5的输出端连接至ARMll的输入端。玻璃底片G位于PDMS微流控芯片下方，并与PDMS微流控芯片封接封接成一体。在本发明的实施例中，采用基于AD620的差分放大电路5。PDMS微流控芯片P的制作方法为:采用软光刻技术soft-1 ithography加工出所需的PDMS微流控芯片P，即通过打印掩模、使用SU-8负光刻胶，通过紫外曝光在硅基晶片上加工出具有主通道和混合液注入通道的阳膜，然后在晶片上浇注聚二甲基硅氧烷PDMS，采用恒温真空炉，在70 80°C条件下固化3 4个小时获得具有储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E、主通道12、第一聚焦通道13、第二聚焦通道14、检测通道15、第一分选通道16、第二分选通道17的PDMS微流控芯片P。快速检测船舶压载水中存活单细胞生物装置包括PDMS微流控芯片P，位于PDMS微流控芯片P下方与PDMS微流控芯片封接的玻璃底片G，PDMS微流控芯片P的储液孔A与主通道12连接，PDMS微流控芯片P的储液孔B与第一聚焦通道13连接，PDMS微流控芯片P的储液孔C与第二聚焦通道14连接，PDMS微流控芯片P的储液孔D与第一分选通道16连接，PDMS微流控芯片P的储液孔E与第二分选通道17连接，第一分选通道16、第二分选通道17通过检测通道15与主通道12连接，第一聚焦通道13、第二聚焦通道14与主通道12连接；储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中插入钼电极，储液孔A中的钼电极的另一端与直流电源的正极相连，储液孔E中的钼电极的另一端通过电阻R4、双刀双掷继电器3和电位器2连接至直流电源I的负极，储液孔D的钼电极的另一端通过双刀双掷继电器3和电位器2连接至直流电源I的负极，储液孔B和储液孔C中的钼电极直接与直流电源I的负极相连接，电阻R4两端通过导线连接至差分放大电路5的两个输入端，差分放大电路5的输出端连接至ARMll的输入端；检测通道15的上方设置激光发射探头6，激光发射探头6发射的激光通过第一滤光片7进入检测通道5，在玻璃底片G下方对着检测通道15的位置设置第二滤光片8，在第二滤光片8的下方设置雪崩探测器9，雪崩探测器9的输出端连接放大电路10的输入端，放大电路10的输出端连接至ARM11。采用快速检测船舶压载水中存活单细胞生物装置进行快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的方法，包括如下步骤:I)样品提取步骤:从待检测的船舶压载水中提取船舶压载水样品；2)船舶压载水样品以及缓冲液滴加步骤:将采用FDA染料染色后的船舶压载水样品加入到储液孔A中；并向储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中分别滴加缓冲液；3)接通直流电源I对储液孔A中的船舶压载水样品进行电渗输运；4)当船舶压载水样品中没有存活单细胞生物时，单细胞生物样品在电渗流的作用下全部通过第一分选通道输送至储液孔D ;5)当船舶压载水样品中存在存活单细胞生物时，活的单细胞生物通过检测通道15时，激光发射探头6发出的激光对经过FDA染料染色的带有荧光的单细胞生物进行激发，激发出的荧光信号经过第一滤 光片7和第二滤光片8进入雪崩探测器9进行光电信号转换，从雪崩探测器9输出的电信号经信号放大电路10放大后发送至ARMl I，并且发送至双刀双掷继电器3使双刀双掷继电器3动作，使储液孔D和储液孔E的电压互换，将或的单细胞生物样品分选至液压孔E中，持续预设时间后结束双刀双掷继电器的动作，使储液孔D和储液孔E中的电源恢复至互换前的数值；6)获得存活单细胞生物的个数以及存活单细胞生物的大小的检测值，存活单细胞生物的个数检测值等于荧光脉冲信号的个数；根据电阻两端检测到的电压脉冲信号的幅值来判定存活单细胞生物的大小检测值。当校正用的标准聚苯乙烯颗粒的直径为dg时，利用该标准聚苯乙烯颗粒进行试验测得电阻两端检测到的标准电压脉冲信号的幅值
记为AV—k对单细胞生物样品测试时，若电阻两端检测到的电压脉冲信号的幅值为
O
Ap,j 3
AV 根据公式进行换算，可推算获得存活单细胞生物的直径值d2。 -PutZ，A Klirput2 Ci2本发明所述缓冲液为任意可实现本发明技术方案的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液或者硼酸盐缓冲液。作为优选技术方案，当选用硼酸盐缓冲液作时，硼酸盐缓冲液的PH值为8-9。制作PDMS微流控芯片P的液体PDMS可以为任意可实现本发明技术方案的材料，例如Sylgard184娃树脂。ARMll可以为可实现本发明技术方案的任意型号的ARM，例如型号为S3C6410的ARM。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置，其特征在于，包括PDMS微流控芯片，位于PDMS微流控芯片下方与PDMS微流控芯片封接的玻璃底片G ;所述PDMS微流控芯片包括储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E、主通道(12)、第一聚焦通道(13)、第二聚焦通道(14)、检测通道(15)、第一分选通道(16)、第二分选通道(17)，储液孔A与主通道(12)连接，储液孔B与第一聚焦通道(13)连接，储液孔C与第二聚焦通道(14)连接，储液孔D与第一分选通道(16)连接，储液孔E与第二分选通道(17)连接，第一分选通道(16)、第二分选通道(17)通过检测通道(15)与主通道(12)连接，第一聚焦通道(13)、第二聚焦通道(14)与主通道(12)连接；储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中插入钼电极，储液孔A中的钼电极的另一端与直流电源的正极相连，储液孔E中的钼电极的另一端通过电阻R (4)、双刀双掷继电器(3)和电位器(2)连接至直流电源(I)的负极，储液孔D的钼电极的另一端通过双刀双掷继电器(3)和电位器(2)连接至直流电源(I)的负极，储液孔B和储液孔C中的钼电极直接与直流电源(I)的负极相连接，电阻R (4)两端通过导线连接至差分放大电路(5)的两个输入端，差分放大电路(5)的输出端连接至ARM (11)的输入端；检测通道(15)的上方设置激光发射探头(6 )，激光发射探头(6 )发射的激光通过第一滤光片(7)进入检测通道(5)，在玻璃底片G下方对着检测通道(15)的位置设置第二滤光片(8)，在第二滤光片(8)的下方设置雪崩探测器(9)，雪崩探测器(9)的输出端连接放大电路(10)的输入端，放大电路(10)的输出端连接至ARM (11)。
2.一种采用权利要求1所述的装置进行快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)样品提取步骤:从待检测的船舶压载水中提取船舶压载水样品； 2)船舶压载水样品以及缓冲液滴加步骤:将采用FDA染料染色后的船舶压载水样品加入到储液孔A中；并向储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中分别滴加缓冲液； 3)接通直流电源(I)对储液孔A中的船舶压载水样品进行电渗输运； 4)当船舶压载水样品中没有存活单细胞生物时，单细胞生物样品在电渗流的作用下全部通过第一分选通道输送至储液孔D ; 5)当船舶压载水样品中存在存活单细胞生物时，活的单细胞生物通过检测通道(15 )时，激光发射探头(6)发出的激光对经过FDA染料染色的带有荧光的单细胞生物进行激发，激发出的荧光信号经过第一滤光片(7)和第二滤光片(8)进入雪崩探测器(9)进行光电信号转换，从雪崩探测器(9)输出的电信号经信号放大电路(10)放大后发送至ARM (11)，并且发送至双刀双掷继电器(3 )使双刀双掷继电器(3 )动作，使储液孔D和储液孔E的电压互换，将或的单细胞生物样品分选至液压孔E中，持续预设时间后结束双刀双掷继电器的动作，使储液孔D和储液孔E中的电源恢复至互换前的数值； 6)获得存活单细胞生物的个数以及存活单细胞生物的大小的检测值，存活单细胞生物的个数检测值等于荧光脉冲信号的个数；根据电阻R(4)两端检测到的电压脉冲信号的幅值来判定存活单细胞生物的大小。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测船舶压载水中存活单细胞生物的装置和方法，装置包括PDMS微流控芯片，玻璃底片G；PDMS微流控芯片包括储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E、主通道、第一聚焦通道、第二聚焦通道、检测通道、第一分选通道、第二分选通道，储液孔A、储液孔B、储液孔C、储液孔D、储液孔E中插入铂电极。实施本发明具有以下有益效果(1)在微流控芯片上实现对船舶压载水中存活单细胞生物的全自动检测、分选、计数和尺寸判定，装置的体积小，可便携、快速的用于开展现场分析；(2)采用差分微流控芯片以及信号差分放大机制，可提高检测信号的信噪比，从而提高检测的精度。
文档编号G01N15/02GK103105352SQ20131003267
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者孙野青, 宋永欣, 彭冉, 潘新祥, 李冬青 申请人:大连海事大学