一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法
【专利摘要】本发明提供了黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和黄芪药材指纹图谱的鉴别。通过对黄芪药材进行HPLC指纹图谱测定和分析，确定了9个黄芪药材的特征峰，这些共有特征峰构成了黄芪药材的指纹特征，可作为黄芪药材的对照指纹图谱；对需要鉴别的黄芪药材可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别黄芪药材的质量。
【专利说明】一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黄芪药材指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对黄芪药材的有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。
【背景技术】
[0002]黄苗为豆科植物蒙古黄苗Astragalus membranaceus (Fisch) Bge.var.mongholicus (Bge) Hsiao 或膜荚黄苗 Astragalus membranaceus (Fisch) Bge.的干燥根。黄芪含黄酮、皂苷类成分；黄酮类成分如芒柄花素、3’_羟基芒柄花黄素(毛蕊异黄酮)及其匍萄糖苷、2’，3’ - 二羟基-7，4’ - 二甲氧基异黄酮、7，2’ - 二羟基-3’, 4’ - 二甲氧基异黄烧及其匍萄糖苷、7，3’- 二羟基-4’，5’- 二甲氧基异黄烧、3-羟基-9，10-二甲氧基紫植烧及其葡萄糖苷等；皂苷类成分有黄芪皂苷I~珊及大豆皂苷I ;黄芪甲苷(即黄芪皂苷IV)与黄芪乙苷。中国药典2010版黄芪以黄芪甲苷(C22H22Oltl)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C22H22O10)为指标进行含量测定；李颜建立高效液相色谱法测定黄芪饮片中4个异黄酮成分毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量方法(中国药师，2012年02期)；王宗权采用HPLC-ELSD法测定不同产地黄芪药材中的黄芪皂苷1、黄芪皂苷II和黄芪皂苷IV的含量(药物分析杂志，2010年07期)。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。中国 食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。目前，对中药材质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对制剂进行全面直观的质量控制。采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分(含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除)的产生，更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。《中国药典》2010年版，采用薄层色谱法对黄芪进行鉴别，由于薄层鉴别法本身受温度、湿度、薄层板厚度以及载样量等诸多因素影响，存在样品的化学成分体现不完全，可鉴别的成分数量较少，同一样品的重现性不佳的缺点，而已有文献报道的黄芪指纹图谱技术，图谱中体现的化学成分较少，提供的信息量小，不能很好地代表黄芪药材的整体质量，不能对黄芪药材的质量进行有效的鉴别。而采用本发明方法则可充分展示黄芪化学成分的指纹图谱，信息量丰富，方法重现性良好，可有效鉴别黄芪药材的质量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对黄芪药材进行全面而有效的鉴别。[0004]本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
[0005]本发明黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤:
(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；
(b)供试品溶液的制备取黄芪药材粉末(过筛)，精密称定，加水浸泡，加热回流，提取液离心，滤过，用水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液水浴浓缩，加入乙醇，静置一夜。吸取上清液，热空气吹干,加水溶解,滤过,取续滤液,备用。
[0006](C)测定法吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
[0007]进一步优选的测定条件为:
(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长l(T25cm，内径3~5cm，粒径为f 10 μ m);以乙腈为流动相A，以0.0f 2%冰醋酸水溶液为流动相B ;紫外检测器，检测波长20( T400nm ;柱温2(T50°C，流速为每分钟0.2~2ml。
[0008](b)供试品溶液的制备:取黄芪药材粉末(过30-50目筛)8~12g，精密称定，加水12(Tl80ml,浸泡20~40分钟，加热回流3小时，提取液300(T5000rpm离心5~15分钟，滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液9(T100°C水浴浓缩至l(T20ml，加入80%~95%乙醇3(T50ml，2~5°C静置一夜。吸取上清液2~5ml，5(T70°C空气吹干，加水I~3ml溶解，用微孔滤膜(0.22、.45 μ m)滤过，取续滤液，备用。
[0009](c)测定法吸取供试品溶液5~40 μ 1，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，SP得。
[0010]最佳测定条件:
(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm,内径为4.6mm,粒径为5 μ m ;以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm ;柱温30°C ;流速为每分钟0.9ml。
[0011]
【权利要求】
1.黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤: (O供试品溶液的制备:取黄芪药材粉末(过30-50目筛)8~12g，精密称定，加水120~180ml，浸泡20~40分钟，加热回流I~3小时，提取液3000^5000rpm离心5~15分钟，滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液90-100°C水浴浓缩至l0-20ml，加入80%~95%乙醇30-50ml，2~5°C静置一夜，吸取上清液2~5ml，50-70°C空气吹干，加水I~3ml溶解，用微孔滤膜(0.22、.45 μ m)滤过，取续滤液，备用； (2)指纹图谱测定:取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的黄芪药材对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下:用十八烷基键合硅胶为填充剂；Agilent Zorbax Eclipse XDB C18色谱柱4.6 X 250mm ;乙腈-0.01-2%冰醋酸为流动相梯度洗脱,梯度程序为:0min — 5min — 30min —45min — 60min — 62min — 75min:对应流动相:乙腈:2% — 7% — 15% — 20% — 35% — 50% — 50% ；0.01-2% 冰醋酸:98% — 93% — 85% — 80% — 65% — 50% — 50%,检测波长为 200nm_400nm ；流速为0.2ml/min-2ml/min ;柱温为20°C _50°C;所得到的黄芪药材的对照指纹图谱有9个共有特征峰，其相对保留时间分别为:I号峰=0.16，2号峰:0.17，3号峰:0.20，4号峰:0.35, 5 号 S 峰:1.00，6 号峰:1.32，7 号峰:1.43，8 号峰:1.50，9 号峰:1.56。
2.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于:取黄芪药材粉末(过40目筛)约10g，精密称定，加水150ml浸泡30分钟，加热回流2小时，提取液4000rpm离心10min，滤过，用少量水洗涤滤器，合并滤液与洗涤液，滤液100°C水浴浓缩至15ml，加入95%乙醇42ml，4°C静置一夜，吸取上清液3ml，60°C空气吹干，加水Iml溶解，微孔滤膜(0.45 μ m)滤过,取续滤液,备用。
3.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于:其中所述的检测波长为280nm ;流速为0.9ml/min ;柱温为25°C。
4.根据权利要求1所述的黄芪药材的指纹图谱鉴别方法，其特征在于:其中的流动相乙腈-0.01-2%冰醋酸用乙腈-0.03%磷酸溶液或乙腈-0.03%甲酸溶液代替。
【文档编号】G01N30/02GK103969355SQ201310040435
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月2日 优先权日:2013年2月2日
【发明者】果德安, 吴婉莹, 赵丙贤, 吕延英, 刘蓉霞, 姚帅, 王俊平, 赵兴, 蔡录影, 王丹丹, 侯晋军, 笪娟 申请人:西安世纪盛康药业有限公司