专利名称：一种以功能化基底为介质、单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用新型功能化基底作为检测平台，以多单色及色荧光量子点为标签并与免疫学手段相结合的针对各类激素、蛋白、核酸和病原体等的体外多功能复合免疫诊断方法。
背景技术：
突光量子点(Quantum Dots,以下简称QDs)是粒径小于或接近激子波尔半径的I1-VI族和II1-V族半导体纳米晶体颗粒。其激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄而对称、发射光稳定性强，不易发生光漂白，通过改变粒子的尺寸和组成可获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱，因此相对传统有机荧光试剂具有无可比拟的优越性。本发明是利用表面通过化学修饰的各种不同材料(如纤维、树脂、玻璃等)和不同形貌(如微孔状、网格状等)的基底为检测介质(此处以表面羧基化的微孔纤维素滤膜为实例)，以不同颜色的荧光量子点作为标记物，借助免疫学方法应用于各类激素、蛋白、核酸和病原体等的快速、高灵敏度的单一或者复合式临床定量检测新方法。为了能直观明了地阐述该发明，在这里以唐氏综合症二联检测的两个指标:人绒毛促性腺激素(以下简称HCG)和甲胎蛋白(以下简称AFP)为例加以说明。唐氏综合症(Down’ s Syndrome, DS)又称21—三体综合症，是一类常见的由于染色体畸变而造成出生儿先天缺陷的疾病，表现为患儿面容表型异常、智力低下、体格发育迟缓、畸形残疾或伴随各种严重疾病。目前临床上对唐氏综合症的筛查主要是对孕妇采用绒毛膜穿刺取样和对孕妇血液进行检测。绒毛膜穿刺取样诊断法具有损伤性，会引发一定几率的流产，同时检测过程也会给受检着带来一定的心理恐惧；而孕妇血液检测主要针对血液中的人绒毛促性腺素(human chorionic gonadotrophin)、甲胎蛋白(a -fetoprotein)、雌三醇(Free estriol, E3)、抑制素 A(Inhibin-A)等的含量检测评估。对上述物质的检测方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、时间分辨荧光免疫法(TRFIA)、化学发光免疫法(CLIA)、胶体金免疫层析法等。这些传统的方法有各自的缺点:放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫和化学发光免疫法都存在操作繁琐，耗时长，所需检测设备昂贵的问题，对操作人员乃至工作环境有一定要求；化学发光法发光时间较短，不能实现同一样本的反复测量；而放射免疫法的标记物对操作者有害，环境友好性差，因此限制了其普遍推广和基层使用；胶体金技虽然简便快捷但是只能实现半定量，不能用于较高灵敏度和多种抗原的复合式检测。本发明方法成功地实现了对目标分子的单项定性、定量检测(如单独对HCG、AFP的单项检测);双项同时定性、定量复合检测(如对唐氏综合症的二联筛查)以及多项同时定性、定量复合检测(如对各型肝炎病毒的复合检测)。同时本发明方法也能广泛适用于如促卵泡生成激素(FSH)、黄体化激素(LH)、甲状腺球蛋白(Tg)等以及艾滋病病毒(HIV)抗体、乙肝表面抗原(HBsAg)等各类病原体、核酸的单一或者多项同时定性、定量的复合检测。
发明内容
本发明能解决的技术问题:
以对唐氏综合症二联筛查的两项指标HCG和AFP的单一和复合检测为实例，本发明中采用表面经过各种基团修饰处理的微孔状、网格状基底作为抗体固定的介质，通过基底表面呈递出来的各种官能团与抗体蛋白携带的对应残基结合形成化学键，稳定地将抗体固定在基底介质表面作为捕获抗原用的固定相抗体，较之传统的胶体金检测试纸利用纤维的空间位阻包被抗体的方法，大大提高了固定相抗体的结合率以及稳定性；由于本发明还充分利用了荧光量子点的诸多优点，将表面经过羧基、氨基、巯基等基团修饰的不同颜色的水溶性无机半导体荧光量子点与抗体通过化学键结合作为标记抗体，相比胶体金检测法中将金纳米颗粒通过静电吸附与抗体蛋白结合更加稳定、牢固而且能够更广范的标记各种生物分子；本发明基于量子点的荧光特性和色彩丰富的特点，较之胶体金检测法不仅有更好更直观的视觉效果，最重要的是还在此基础上建立多色的多功能综合检测体系，实现快速、精确地一次性检测出诸如血液、尿液等样本中的多种目标分子。本发明不仅具备胶体金检测法简便、快捷的优点，更提高了检测的灵敏度，最重要的是能同时检测多种抗原，并以不同颜色的荧光信号反应出结果，真正实现了复合多功能检测。本发明采用的技术方案:
以对唐氏综合症二联筛查的两项指标HCG与AFP的单一和复合检测为例，首先，本发明将表面经过羧基化处理的基底(以下采用微孔滤膜)作为固定包被抗体蛋白的介质，将羧基化微孔滤膜在MES缓冲溶液中与碳化二亚胺盐酸盐(以下简称EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐(以下简称Sulfo-NHS)反应以活化微孔滤膜表面的羧基，之后使微孔滤膜表面活化后的羧基与包被用抗体蛋白的氨基残基反应生成酰胺键，从而将抗体蛋白稳定地固定在滤膜表面。其次，本发明分别采用了发射波长为620nm (红色)和540nm (绿色)的CdSe/ZnS核壳结构量子点作为荧光材料，通过水相转移将其表面修饰羧基作为具备良好生物兼容性的荧光标记物，之后与EDC和Sulfo-NHS在MES缓冲溶液中反应以活化量子点表面羧基。通过离心分离后，将量子点表面活化后的羧基与抗体蛋白的氨基残基反应形成酰胺键，从而使量子点与抗体蛋白稳定结合以制备量子点标记的抗体蛋白。在检测时，将样本(尿液或者血液)滴加到固定了捕获用抗体蛋白(包被抗体)的微孔滤膜上并在37°C下孵育一段时间，此时样本中的抗原将被微孔滤膜上固定的抗体识别并结合，用缓冲液冲洗之后将量子点标记的抗体经过稀释后滴加到微孔滤膜表面，通过在37°C下孵育一段时间，微孔滤膜表面的固相抗体捕获了样本中的抗原之后再与量子点标记抗体结合，最终在微孔滤膜表面形成固相抗体——抗原——量子点标记抗体的三明治夹心结构。由于该复合结构存在于微孔滤膜表面，使得滤膜被赋予了突光特性，其突光强弱与样本中的抗原浓度相关，对于HCG检测浓度范围为1IU/L 10_6IU/L ；AFP检测浓度范围为1000ng/ml lng/ml0针对本发明在检测样本快捷性这一特点上，通过对HCG为代表的该发明系列相关实验证明，该方法检测样本的最短显色(荧光)时间为20min，最佳显色(荧光)时间为40min。同时,制备的HCG单克隆抗体固定的微孔滤膜在4°C下能够稳定保存至少一个月仍然具有理想的检测活性。
本发明相对于现有技术，有以下优点:
本发明相比目前临床上对激素、蛋白、核酸和病原体的诸多快速检测方法(ELISA法、胶体金法等)，创新地利用经过化学修饰的微孔状、网格状基底作为固定固相抗体的介质，通过化学键将抗体固定在基底上，增加了固相抗体的稳定性。此外，不同形貌的和结构的基底不仅能最大限度地固定抗体，也能满足各种不同的检测环境和样本的要求。本发明方法还利用了荧光量子点的特性，能用于对各种抗原的单一检测和多功能复合检测且工序流程简单，对于操作人员没有特殊要求，检测滤膜可以长期保存，方便实用。相比传统的酶联免疫吸附法(ELISA)大大缩短了检测时间和操作步骤，提高了工作效率；而相比胶体金快速检测手段其优势在于极大地提高了检测灵敏度，拓展了检测浓度下限。可以说本方不仅具备了 ELISA法和胶体金检测法的优势，而且还能用于复合检测，检测结果清晰直观，所使用的材料均安全无毒、绿色环保，在临床应用方面有着广阔的空间和极大的市场潜力。
图1.为利用羧基修饰的水溶性荧光量子点通过Sulf0-NHS与EDC介导与抗体蛋白形成酰胺键从而制备量子点标记抗体的示意图，其中(I)为表面修饰了羧基官能团的水溶性量子点，(2)为用于与量子点连接的抗体蛋白，(3)为标记了荧光量子点的抗体蛋白；
图2.为通过Sulfo-NHS与EDC介导将抗体蛋白固定在表面羧基化处理的基底上并对样本中抗原进行检测，最终形成抗体——抗原——标记抗体的三明治夹心结构的流程示意图，其中(I)为表面带有羧基的功能化基底，(2)为表面固定了抗体蛋白的功能化基底，(3)为识别了样本中的抗原从而形成抗体——抗原——标记抗体的三明治夹心复合结构的功能化基底；
图3.为本发明的流程示意图，其中(I)为固定了包被抗体的功能化基底，(2)为待检测的临床样本(血样、尿样等)，(3)代表连接了不同颜色量子点的标记抗体，(4)为加入标记抗体后形成抗体——抗原——标记抗体的三明治夹心结构的功能化基底，(5)代表激发量子点所用的激发光源，(6)代表荧光信号收集装置，(7)代表荧光信号处理系统，(8)代表检测数据和结果；
图4.为识别了样本中的抗原并形成了抗体——抗原——标记抗体的三明治夹心复合结构微孔滤膜的激光共聚焦显微镜(Confocal)照片，其中(I)为识别了 HCG抗原，并在表面形成抗体——抗原——CdSe/ZnS核壳结构红色量子点标记抗体三明治复合结构的微孔滤膜的Confocal照片，(2)为识别了 AFP抗原，并在表面形成抗体——抗原——CdSe/ZnS核壳结构绿色量子点标记抗体三明治复合结构的微孔滤膜的Confocal照片，(3)为同时识别了 HCG和AFP抗原，并在表面形成抗体——抗原——CdSe/ZnS核壳结构红色量子点和CdSe/ZnS核壳结构绿色量子点标记抗体三明治复合结构的微孔滤膜的Confocal照片；
图5.为识别了样本中不同浓度的HCG抗原并形成了抗体——抗原——CdSe/ZnS核壳结构红色量子点标记抗体之三明治夹心复合结构的微孔滤膜在波长为365nm激发光下的相对荧光强度图谱，7条曲线按照峰高自上而下分别代表检测浓度为:1IU/L、10_2IU/L、l(r3IU/L、l(T4IU/L、l(T5IU/L、l(r6IU/L、0IU/L 的荧光强度 图6.为识别了样本中不同浓度的AFP抗原并形成了抗体——抗原——CdSe/ZnS核壳结构绿色量子点标记抗体之三明治夹心复合结构的微孔滤膜在波长为365nm激发光下的荧光强度图谱，5条曲线按照峰高自上而下分别代表检测浓度为1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml、0ng/ml 的突光强度 图7.为同一张用AFP包被抗体和HCG包被抗体固定的免疫微孔滤膜同时识别了样本中的HCG和AFP抗原后的双抗原复合检测微孔滤膜在波长为365nm激发光下的荧光强度图谱和空白对比图谱，波长为540nm处对应的是AFP的检测峰；波长为620nm处对应的是HCG的检测峰；下方曲线为空白对比；
图8.为该检测体系针对样本中相同浓度的HCG抗原在不同的反应时间下荧光强度的变化图谱，8条曲线按图上箭头所标注分别表示反应时间分别为lmin、5 min、10 min、15min、20 min、40 min、60 min> 100 min的突光强度图。当反应时间为20 min时已有相对较高的荧光强度，当反应时间为40 min时对应的荧光强度比较理想，继续反应到60 min对应的荧光强度没有太明显的升高，当反应到100 min时对应的荧光强度有略微的下降；
图9.为随反应时间增加，检测样本后微孔滤膜的相对荧光强度百分比率的变化趋势图。当反应时间为40 min是耗时较短且检测荧光强度较高的理想反应时间；
图10.为表面置结合了包被抗体的微孔滤膜在4°C下放置0小时、I小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、192小时、360小时、720小时后检测相同浓度抗原样本后的荧光强度变化趋势图。微孔滤膜在4°C下开始放置100小时后其检测抗原后的荧光强度有略微下降，放置更长时间后其检测抗原后的荧光强度比较稳定没有明显变化。
具体实施例方式以下对唐氏综合症的二联筛查的两个指标HCG和AFP的检测为具体实施例来说明本发明的技术方案，但以本发明所涉及的检测激素、核酸、蛋白以及病原体种类的保护范围不限于此:
实施例一:
以HCG单克隆抗体为例，制备红色荧光量子点标记的抗体:取表面修饰了羧基的红色水溶性荧光量子点(发射波长为620nm) 100 U I溶解于900 u I MES缓冲溶液(0.lmol/L,pH=4.7)中溶解均匀，分别加入EDC 2mmol和Sulfo-NHS 5mmol在20°C下反应40min后于IOOOOrpm离心90min除去上清液，将下层颜色较浓的红色荧光量子点溶液溶解于Iml硼酸缓冲溶液(0.lmol/L, pH=8.5)中摇勻，15000rpm再次离心30min后弃上清,将下层颜色较浓的红色量子点溶液分散于Iml PBS缓冲溶液(0.01mol/L, pH=7.4)中同时加入0.1mg标记用HCG单克隆抗体，20°C 25°C下反应3小时。反应结束后加入Iml 1% BSA溶液于37°C孵育30min，于15000rpm离心60min将下层颜色较浓的红色量子点溶液分散于PBS缓冲溶液并置于4°C保存备用。反应过程如图1所示。实施例二:
以AFP单克隆抗体为例，制备绿色荧光量子点标记的抗体:取表面修饰了羧基的绿色水溶性荧光量子点(发射波长为540nm) 100 U I溶解于900 u I MES缓冲溶液(0.lmol/L,pH=4.7)中溶解均匀，分别加入EDC 2mmol和Sulfo-NHS 5mmol在20°C下反应40min后于40000rpm离心40min除去上清液，将下层颜色较浓的绿色荧光量子点溶液溶解于Iml硼酸缓冲溶液(0.lmol/L, pH=8.5)中摇勻，50000rpm再次离心30min后弃上清,将下层颜色较浓的绿色量子点溶液分散于Iml PBS缓冲溶液(0.01mol/L, pH=7.4)中同时加入0.1mg标记用AFP单克隆抗体，20°C 25°C下反应3小时。反应结束后加入Iml 1%BSA溶液于37°C孵育30min，于50000rpm离心30min将下层颜色较浓的绿色量子点溶液分散于PBS缓冲溶液并置于4°C保存备用。反应过程如图1所示。实施例三:
以HCG单克隆抗体为例，制备HCG包被抗体固定的微孔滤膜:将表面羧基化处理的滤膜片放置于洁净的玻璃瓶中，加入Iml MES缓冲溶液(0.lmol/L，pH=4.7)，分别加入2mmolEDC和5mmol Sulfo-NHS在20°C下反应40min，之后将膜片取出，用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L，pH=7.4)冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于Iml PBS缓冲溶液中(0.0lmol/L，pH=7.4)，同时加入固定用的HCG包被抗体，使溶液中抗体的终浓度为IOii g/ml，20°C 25°C下反应3小时，反应结束后取出滤膜，用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L，pH=7.4)再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入Iml 1%BSA溶液于37°C孵育30分钟，之后将膜片用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH=7.4)冲洗三遍后待检测用。制备过程和检测过程如图2、3所示。实施例四:
以AFP单克隆抗体为例，制备AFP包被抗体固定的微孔滤膜:将表面羧基化处理的滤膜片放置于洁净的玻璃瓶中，加入Iml MES缓冲溶液(0.lmol/L, pH=4.7)，分别加入2mmolEDC和5mmol Sulfo-NHS在20°C下反应40min，之后将膜片取出，用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L，pH=7.4)冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于Iml PBS缓冲溶液中(0.0lmol/L，pH=7.4)，同时加入固定用的AFP包被抗体，使溶液中抗体的终浓度为10iig/ml，20°C 25°C下反应3小时，反应结束后取出滤膜，用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L，pH=7.4)再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入Iml 1% BSA溶液于37°C孵育30min，之后将膜片用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L,pH=7.4)冲洗三遍后待检测用。制备过程和检测过程如图2、3所示。实施例五:
以HCG和AFP单克隆抗体为例，制备HCG和AFP两种包被抗体固定的微孔滤膜:将表面羧基化处理的微孔滤膜片放置于洁净的玻璃瓶中，加入Iml MES缓冲溶液(0.lmol/L,pH=4.7)，分别加入2mmol EDC和5mmol Sulfo-NHS在20°C下反应40min，之后将膜片取出，用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L, pH=7.4)冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于ImlPBS缓冲溶液中(0.0lmol/L, pH=7.4)，同时加入固定用的HCG和AFP包被抗体，使溶液中两种抗体的终浓度均为10 u g/ml，20°C 25°C下反应3小时，反应结束后取出滤膜，用PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH=7.4)再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入Iml 1% BSA溶液于37°C孵育30min，之后将膜片用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH=7.4)冲洗三遍后待检测用，制备过程和检测过程如图2、3所示。实施例六:
以HCG为例，检测不同浓度的HCG抗原:分别取300 ill浓度为IIU/L、1x10_2IU/L、1x10-3IU/L、1x10-4IU/L、1x10-5IU/L、1x10-6IU/L、0IU/L 的 HCG 溶液，加入到实施例三制备的HCG包被抗体固定的滤膜片上，37°C孵育I小时后用PBS (0.01mol/L, pH=7.4 )冲洗三遍，之后加入300 u I按照1:1000倍稀释的实施例一制备的量子点标记HCG抗体充分混合均匀，于37°C下孵育20min或者室温下(20°C )孵育40min。之后取出滤膜用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH=7.4)将膜片表面冲洗三遍，放置于载玻片上用紫外光激发同时通过分光光度计测量荧光强度，其检测荧光强度如图5所示。实施例七:
以AFP为例，检测不同浓度的AFP抗原:分别取300 u I浓度为I ii g/ml、IxKT1 u g/ml、lxl0_2 u g/ml、Ix 10_3ii g/ml、0 u g/ml的AFP溶液，加入到实施例四制备的AFP包被抗体固定的滤膜片上，37°C孵育I小时后用I3BS (0.01mol/L，pH=7.4)冲洗三遍，之后加入300iil按照1:200倍稀释的实施例三制备的量子点标记AFP抗体充分混合均匀，于37°C下孵育20min或者室温下(20°C)孵育40min。之后取出滤膜用PBS缓冲溶液(0.0lmol/L，pH=7.4)将膜片表面冲洗三遍，放置于载玻片上用紫外光激发同时通过分光光度计测量荧光强度，其检测荧光强度如图6所示。实施例八:
以HCG和AFP的复合检测为例，在同一张免疫微孔滤膜上同时检测HCG抗原和AFP抗原:分别取200 u I浓度为1x10_2IU/L的HCG抗原溶液和200 U I浓度为lxlO-1 u g/ml的AFP抗原溶液，加入到实施例五制备的HCG和AFP两种包被抗体固定的微孔滤膜片上，37°C孵育
I小时后用PBS (0.0lmol/L, pH=7.4 )冲洗三遍，之后同时加入200 按照1:1000倍稀释的实施例一制备的量子点标记HCG抗体和200 u I按照1:200倍稀释的实施例二制备的量子点标记AFP抗体充分混合均匀，于37°C下孵育20min或者室温下(20°C )孵育40min。之后取出滤膜用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH=7.4)将膜片表面冲洗三遍，放置于载玻片上用紫外光激发同时通过分光光度计测量荧光强度，其检测结果如图7所示。实施例九:
以HCG为例，测定最短显色时间:分别取300 ill浓度为1IU/L的HCG溶液各加入到实施例三制备的8块HCG包被抗体固定的滤膜片上，37°C孵育I小时后用PBS (0.0lmol/L，pH=7.4)冲洗三遍，之后加入300 ill按照1:1000倍稀释的实施例一制备的量子点标记HCG抗体充分混合均勻，于室温下分别将8张微孔滤膜按时间梯度孵育lmin、5min、10min、15min、20min、40min、60min、lOOrnin。之后取出微孔滤膜并用 PBS 缓冲溶液(0.01mol/L,pH=7.4)将膜片表面冲洗三遍，放置于载玻片上，用365nm紫外光激发同时通过分光光度计测量荧光强度，其检测荧光强度如图8所示，检测荧光强度随反应时间的变化趋势如图9所
/Jn o实施例十:
以HCG抗体为例，测定表面固定了抗体的微孔滤膜在4°C所能保持活性的时间:取9块实施例二 HCG抗体固定的滤膜片，于恒定流速的高纯氮气缓慢吹干表面的水分，放于小玻璃瓶中4°C下按照时间分别密封保存5小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、192小时、360小时、720小时。分别加入300 U I浓度为1IU/L的HCG溶液于37°C孵育I小时，用PBS缓冲溶液(0.01mol/L, pH=7.4)将膜片表面冲洗三遍之后加入实施例一制备的按照1:000稀释的量子点标记HCG抗体300 u I充分混合均匀后于37°C下孵育20min或者室温下(20°C )孵育40min。之后取出滤膜并用PBS缓冲溶液(0.01mol/L, pH=7.4 )将膜片表面冲洗三遍，放置于载玻片上，用分光光度计测量荧光强度，其保存时间对荧光强度的变化如图10所示。
权利要求
1.一种利用经过化学修饰的功能化基底作为介质，结合荧光半导体纳米材料(量子点)和免疫学手段，用于各类激素、蛋白、核酸和病原体等的快速、高灵敏度的临床定性、定量检测新方法，该方法利用表面经过不同化学修饰的微孔纤维状或者网格状基底作为包被抗体的介质，用不同颜色的半导体荧光纳米材料作为抗体标记物，通过免疫学方法对临床样本检测后的结果以不同颜色和强度的荧光信号反应出来，从而用于临床样本中目标分子的检测。
2.本法具有简单、快捷、高灵敏度、低成本的优点，可用于单一或者复合式定性、定量检测，其特点在于包括以下步骤:(1)以表面羧基化、氨基化、巯基化等的微孔状、网格状等各型基底介质为包被抗体的固定材料，通过EDC和NHS或者各种蛋白质交联试剂将微孔状、网格状等各型基底介质表面呈现的羧基、氨基、巯基等与固定用的一种或者多种单克隆抗体所带的对应基团结合成键，固定在同一个基底上，再利用一定浓度的BSA封闭后从而制备出固定了不同包被抗体的单一或者复合检测用的基底介质；(2)以表面羧基、氨基、巯基等能与蛋白质分子交联的基团修饰的不同颜色水溶性量子点为荧光标记材料，通过EDC和NHS或者各种蛋白质交联试剂将水溶性量子点表面呈现的亲水基团与标记用各种抗体蛋白所带的对应残基结合成键，再利用一定浓度的BSA封闭后从而制备标记用的抗体；(3)将临床样本(血样、尿样等)滴加到(I)表面并在适当温度下孵育一定时间,用缓冲液冲洗掉样本后加入按比例稀释的(2)并孵育一定时间；(4)将(3)表面的反应残液用缓冲液冲洗干净后置于载玻片上用一定波长的激发光照射，通过荧光检测系统测定荧光强度。
3.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:包括对所有能用于本发明检测的激素、蛋白、核酸和病原体等的单一或者复合定性、定量检测以及对唐氏综合症的二联筛查。
4.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:利用经过羧基、氨基、巯基等各种功能化基团修饰的基底作为固定包被抗体的介质；该介质的特点还包括纤维、树脂、玻璃等各类材料以及微孔状、网格状等不同形貌特征将该检测 方法应用于对目标分子的单项定性、定量检测(如单独对HCC、AFP的单项检测);双项同时定性、定量复合检测(如对唐氏综合症的二联筛查)以及多项同时定性、定量复合检测(如对各型肝炎病毒的复合检测)。
5.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:所用抗体抗体的亲和常数为IO6 IO8M-1的各类单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:以水溶性CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、ZnSe/ZnS, ZnSe/CdSe/ZnS、CuInS2/ZnS、CuInZnxS2+x/ZnS、CdxZn1^SeZZnS, CdS/ZnSe、ZnSe/CdSe/ZnS.CdTe/CdSe等核壳结构半导体量子点以及Mn_ZnSe/ZnS等掺杂结构量子点作为荧光标记材料，所述量子点粒径小于20nm，其粒径偏差小于10%，量子产率大于30%，发射波长覆盖从470nm至近红外。
7.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:使用EDC和NHS (或者其他类型的交联剂)作为介导氨基和羧基(或其他官能基团)反应的耦联剂。
8.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:使用耦联剂或者EDC和NHS的分子比为适当比例。
9.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:以0.5% 5%的BSA溶液或脱脂奶粉溶液为封闭液。
10.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能突光免疫快速检测法，其特点在于:制备量子点标记抗体的反应温度为10°C 45°C。
11.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:制备捕获用抗体固定微孔滤膜的反应温度为10°C 45°C。
12.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:以pH为4 7的缓冲溶液作为活化羧基的缓冲液。
13.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:以PH为6 9的缓冲溶液作为羧基与氨基耦联的缓冲液。
14.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:检测临床样本的最短时间控制在I小时以内。
15.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:检测临床样本时的反应温度为10°C 45°C。
16.根据权利要求1所述的一种以功能化基底为介质，单色及多色量子点为标记的多功能荧光免疫快速检测法，其特点在于:以波长低于量子点发射波长的光源作为量子点的激发光源，利用荧光检测系统测量临床样本的荧光信号。
全文摘要
本发明涉及一种利用经过化学修饰的功能化多形貌基底作为介质，结合无机半导体荧光纳米材料(量子点)和免疫学手段的快速、高灵敏度的定性、定量临床检测新方法。本发明可用于各种激素、蛋白、核酸和病原体单一或者复合定性、定量检测。本发明较之传统的酶联免疫检测法和胶体金检测试纸有着简单、快速、高灵敏度和保存时间长等特点，可以满足不同的检测条件和样本的要求，并能够在同一个基底介质上同时对不同抗原进行单一或者复合定性、定量检测，在临床应用方面极具潜力。
文档编号G01N33/577GK103149360SQ20131004480
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者李林松, 刘丹 申请人:河南大学