一种双酚a单链抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及双酚A单链抗体的筛选方法及其应用，属于生物【技术领域】，该单链抗体是由核糖体展示鼠源天然抗体库中筛选出来的并进行了功能性表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选双酚A的方法。本发明筛选出的双酚A单链抗体可以应用于污染检测与研制快速检测己烯雌酚残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病中的用途。
【专利说明】一种双酚A单链抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种双酚A单链抗体的筛选方法，属于生物【技术领域】，用于制备特异识别双酚A的高效抗体与研制可以快速检测双酚A残留的免疫速测试剂盒及治疗相关疾病的用途中。
【背景技术】
[0002]双酚A (Bisphenol A，缩写为BPA)双酚A学名2，2_ 二(4_羟基苯基)丙烷，简称二酚基丙烷。在1891年，俄罗斯化学家A.P.Dianin首次合成双酚A，合成这种化合物时，是采用丙酮与两当量的苯酚在酸性介质中缩合而成。双酚A的应用十分广泛:不仅可以应用于化工领域生产，如:生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料和增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品；也可以用于日常生活用品的生产，例如:罐头食品和饮料的包装、奶瓶、水瓶、牙齿填充物所用的密封胶、眼镜片、收银小票和输水管道的内涂层等。19世纪30年代中期，人们发现双酚A可以发挥雌激素作用。有科学家认为，长时间吸进双酚A粉末有害于肝功能及肾功能；特别严重的是它会降低血液中血红素的含量。而动物研究表明，双酚A可能导致很多疾病，包括生殖系统发育异常、女性提早性成熟、精子数量减少以及前列腺癌和乳腺癌等与激素相关的癌症、双酚A进入人体子宫内，可能导致后代的疾病变异，包括肥胖症、癌症和糖尿病。
[0003]针对上述情况，发展检测双酚A残留的简便、快速、灵敏的方法是有效遏制滥用双酚A的重要技术手段和维护法规制度的必要保障。免疫学分析方法检测BPA具有快速简便的特点，而免疫分析方法检测需要有BPA的特异性抗体。但是BPA是小分子半抗原，免疫原性不强，通过传统的免疫动物的方法制备抗体较困难，制备的周期也较长。
[0004]基因工程抗体单链抗体(Singe chain variable fragment, scFv)具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。目前，主要应用核糖体展示技术和噬菌体展示技术来筛选和制备单链抗体。核糖体展示技术是一种完全不依赖于细胞的体外展示技术，是在体外筛选和显示功能蛋白的方法，不需经过转化，文库库容量远大于噬菌体单链抗体文库。此外核糖体展示技术还具有建库和筛选方法简便，便于引入突变和重组技术如寡核苷酸定点突变，倾向错误PCR,DNA shuffling等,提高了祀标蛋白的亲和力；基因突变与表型筛选都在体外进行，简化了操作步骤。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体的B细胞，从理论上讲，能够代表所有初级B细胞含有的抗体基因的多样性，使用任何抗原都可能从中筛选到相应的抗体，具有较强的通用性。利用核糖体展示技术筛选针对小分子半抗原抗体的研究较少，尤其是从天然抗体文库中筛选更为少见。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的是提供一种潜在的检测和医学用抗双酚A单链抗体。
[0006] 本发明的第二个目的提供一种抗双酚A单链抗体的制备方法。[0007]本发明的第三个目的提供抗双酚A单链抗体在制备检测试剂盒中的用途。
[0008]本发明的技术方案概述如下:
[0009]本发明提供的抗双酚A单链抗体是从核糖体展示鼠源天然单链抗体库中筛选获得的并进行了功能性表达。
[0010]本发明提供的抗双酚A单链抗体的制备方法为:
[0011]I核糖体鼠源天然单链抗体文库scFv的扩增
[0012]全文库由本实验室孙亚楠构建。所构建的抗体文库是从未免疫的6-8周龄的小鼠中获得总mRNA，然后经反转和扩增后获得VH和VL。(G4S) 31inker通过SOE法连接VH和VL,构建成单链抗体文库，大小约为750bp。经过测序及序列比对，所构建的文库多样性好，可用于单链抗体的筛选。
[0013]扩增出大小为102bp核糖体展示元件T (包括T7启动子，5’茎环，核糖体结合位点)和大小为298bp间隔序列P(噬菌体P蛋白部分序列)，含3’茎环，作为间隔序列，分别经序列测定，与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将T片段与scfV文库连接，再将P片段与其拼接，构建成核糖体展示单链抗体文库，大小为1200bp左右。
[0014]其中核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子(T7启动、tac启动子等)，本发明优选原核启动子特别是T7启动子。
[0015]2抗双酚A单链抗体的筛选
[0016]将扩增得到的全文库经转录和翻译后，用于BPA-OVA或BPA-BSA作为半抗原固相交替筛选特异于BPA的单链抗体，每轮筛选的过程中都采用了复筛选法。筛选完成以后，调节Mg2+浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。得到的DNA文库与核糖体展示元件T启动子和P蛋白连接，构成筛选的全文库，再经体外转录、体外翻译、亲和筛、RT-PCR扩增过程，反复筛选几轮后的到单链抗体的文库。经过五轮筛选后，得到的mRNA经紫外分光光度法测定，结果显示吸光度明显增加，且RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。
[0017]Mg2+浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。
[0018]3抗双酚A单链抗体的功能性表达
[0019]筛选得到的单链抗体进行序列鉴定，挑选出无致死突变的克隆子，将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，在27.8KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，破碎后确定表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中，需要对包涵体进行变复性获得有生物活性的单链抗体。
[0020]抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。
[0021]标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6X组氨酸标签等，优选6X组氨酸标签。 [0022]4抗双酚A单链抗体的鉴定
[0023]将阳性克隆子表达后的包涵体复性后使用间接ELISA和竞争间接ELISA法进行鉴定，结果筛选出两株克隆子对双酚A具有竞争结合活性，对其进行序列比对，结果表明CDR区有相似性。
[0024]本发明还可以提供一种测定环境和食品中双酚A残留的检测试剂盒中的最关键检测试剂一抗体，尽管双酚A对健康有害已经是一个不言自明的结论，政府立即禁止双酚A的使用似乎是理所当然的事情，但事实并非如此。目前含双酚A的塑料容器，在世界上包括中国在内的绝大多数国家都在正常使用。针对上述情况，发展检测双酚A残留的简便、快速、灵敏的方法是非常必要的，本发明制备的双酚A单链抗体可以部分取代测定食品和环境样品中双酚A残留测定所需试剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1核糖体展示抗体库全长DNA电泳图.[0026]M:分子量标准Markerl-2:核糖体展示抗体库库DNA
[0027]图2筛选后五轮的紫外下mRNA吸光度
[0028]1-5:筛选次数
[0029]图3五轮的RT-PCR产物图
[0030]M:分子量标准Marker I:阴性2:第5轮筛选后的DNA
[0031]3:第4轮筛选后的DNA 4:第3轮筛选后的DNA
[0032]5:第2轮筛选后的DNA 6:第I轮筛选后的DNA
[0033]图4PCR鉴定第五轮筛选后酶切图(A)及RT-PCR产物的阳性克隆子(B)
[0034]M:分子量的标准Marker 1_3:4轮筛选后的DNA酶切图4:空质粒阴性对照
[0035]5-9: 5轮筛选后的菌落PCR得到的DNA 10阴性对照
[0036]图5SDS-PAGE分析表达的单链抗体的上清㈧和沉淀(B)
[0037]M:分子量标准Marker 1:空质粒阴性对照2:上清3:包涵体沉淀
[0038]图6五轮筛选后经测序得到序列正确的克隆子表达的包涵体变复性后ELISA测定单链抗体活性
[0039]图7单链抗体竞争结合BPA的竞争ELISA分析.【具体实施方式】
[0040]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。
[0041]实施例1核糖体展示鼠源单链抗体文库的构建
[0042]一抗体文库的扩增
[0043]IPCR 的引物
[0044]VH/for扩增单链抗体scFv上游引物:
[0045]VH/for5> TATATCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAG3，
[0046]VL/back扩增单链抗体下游引物:
[0047]VL/back5’ CGCG GTTGCGGTCCG TTT BAK YTC CAR CTT KGT SCC3’
[0048]T7/for扩增全文库上游引物:
[0049]T7/for5> CGCATACGAAATTAATACGACTCAC3 ’
[0050]PDRS/back扩增全文库下游引物
[0051]PDRS/back5，CCGCACACCAGTAAGGTG3，[0052]2核糖体展示全文库的扩增
【权利要求】
1.一种抗双酚A单链抗体，其特征在于可以特异识别小分子物质双酚A。
2.权利要求1抗双酚A单链抗体制备方法，由如下步骤组成: (1)抗双酚A单链抗体的筛选 将扩增得到的全文库经转录和翻译后，用于BPA-OVA或BPA-BSA作为半抗原固相交替筛选特异于BPA的单链抗体，每轮筛选的过程中都采用了复筛选法。筛选完成以后，调节Mg2+浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。得到的DNA文库与核糖体展示元件T启动子和P蛋白连接，构成筛选的全文库，再经体外转录、体外翻译、亲和筛、RT-PCR扩增过程，反复筛选几轮后的到单链抗体的文库。经过五轮筛选后，得到的mRNA经紫外分光光度法测定，结果显示吸光度明显增加，且RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加，说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。 Mg2+浓度根据筛选条件的严谨性不同进行调整。 (2)抗双酚A单链抗体的功能性表达 筛选得到的单链抗体进行序列鉴定，挑选出无致死突变的克隆子，将单链抗体基因与PTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，在27.8KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，破碎后确定表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中，需要对包涵体进行变复性获得有生物活性的单链抗体。 抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，优选pTIG-TRX。 标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6X组氨酸标签等，优选6X组氨酸标签。 (3)抗双酚A单链抗体的鉴定 将阳性克隆子表达后的包涵体复性后使用间接ELISA和竞争间接ELISA法进行鉴定，结果筛选出两株克隆子对双酚A具有竞争结合活性，对其进行序列比对，结果表明CDR区有相似性。
3.权利要求2中所述核糖体展示元件中的启动子根据体外翻译系统的不同可以为原核启动子CT7启动、tac启动子等)，优选原核启动子特别是T7启动子。
4.权利要求2中所述筛选方法可以采用BPA-BSA、BPA-0VA进行固相筛选，并且在筛选的过程中采用了复筛选法，优选在不同筛选轮次中采用不同包被原交叉筛选。
5.权利要求2中所述抗体的表达可以采用原核表达载体如pBV220，pET系列载体，并根据载体不同选择不同表达宿主，优选pTIG-TRX载体。
6.权利要求2中所述标签蛋白可以为麦芽糖结合蛋白、6X组氨酸标签等，优选6X组氨酸标签。
【文档编号】G01N33/53GK103992407SQ201310051416
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年2月17日 优先权日:2013年2月17日
【发明者】宁保安, 彭媛, 白家磊, 高志贤, 赵丽, 孙思明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所