专利名称：一种快速测定脂肪酸含量的荧光方法
技术领域：
本发明涉及一种全新的无损检测方法，特别的，本发明涉及一种可以直接、快速地测定油脂中的脂肪酸含量的方法。
背景技术：
现有测定食品脂肪酸组成的方法比较繁琐且测试费用昂贵，这些限制使得这些方法不能应用于大批量样品的检测。例如目前最常应用的色谱法需要冗长的预处理步骤，通过皂化、酯化将脂肪酸转化成脂肪酸甲酯(FAMEs)之后才能进行测定。相反，波谱法能够将所有的信息整合在一张图谱上，并且通常不需要繁杂的前处理过程。最近，已有许多波谱应用于化学，药物，农产品，生命科学和环境分析领域的报道，但是这些技术在工业上应用的可行性及其研究更有效的方法却没有得到很多的关注。而一些复杂精密的电学，光学设备的和化学计量学技术的联用使得波谱技术在生物学领域，能够很好处理从样品中得来的波谱和化学信息。荧光光谱法作为一种快速的筛选方法被用于检测天然橄榄油中的荧光物质。它被用来表征和辨别食用油，测定它们的热氧化和光氧化；除此之外荧光法还被用于检测区分不同组分和产地的牛奶。而用荧光光谱法来测定食用油中脂肪酸组成的研究没有报道过。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种全新的无损检测方法，一种基于荧光光谱法和化学计量学结合的快捷简便地测定食用油中脂肪酸含量的方法。本发明通过以下方案实施:—种快速测定脂肪酸含量的荧光方法，包括以下步骤:(I)取样:将固体样品置于两个石英片间，或者将液体样品置于石英比色皿中；(2)样品的荧光测定:对样品进行荧光扫描，采集其二维荧光光谱；(3)建立模型:采用化学计量学方法构建荧光光谱数据和油脂脂肪酸含量的回归模型；(4)模型的验证:采用内部交叉验证的方法，作测定值和预测值间的相关性分析和显著性分析，验证模型；(5)脂肪酸含量测定:按照步骤(I)的方法取待测样品，按照步骤(2)的方法进行样品的荧光测定，将荧光数据代入回归模型，获得脂肪酸含量。所述的固体样品为黄油，取样方法是用空心铁管采样器取25_直径(IOmm厚)的黄油置于两个石英片之间测定荧光；液体样品为植物油，直接倒入于石英比色皿中测定。所述的油脂测定过程中不包含任何化学反应步骤，属无损检测。所述的步骤(2)中样品的荧光光谱测定的采集方式和采集条件为:激发波长设为295nm，发射波长范围为30(T500nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5nm和2.5nm。所述的突光测定米用前表面突光技术，米用发射光角度为56° ,以减小反射光,散射光和偏振光的干扰。所述的步骤(3)中油脂脂肪酸含量用气相色谱方法测定。所述的采用的化学计量学方法为偏最小二乘法(PLS)，偏最小二乘法(PLS)用于样品荧光光谱数据和脂肪酸含量的回归计算。所述的模型的验证采用SPSS软件内部交叉验证，图基检验(Tukey’ s test)用于样品脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的显著性分析，P〈0.05，t检验用来检验脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的相关性。本发明的有益效果:(1)荧光光谱数据与气相色谱测得的脂肪酸含量有很强的相关性，通过对未知样品测定其荧光光谱用所建立的回归模型可以用于快速测定未知样品脂肪酸含量的测定；(2)油脂测定过程中不包含任何化学反应步骤，属无损检测。
图1为黄油和植物油的二维荧光光谱的发射光谱。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本发明:1、样品的荧光光谱采集:在室温下，用荧光光谱仪(日立F-7000荧光光谱仪)对样品进行二维荧光光谱扫描。黄油样品用取空心铁管采样器取直径25mm、厚度IOmm的黄油置于两个石英片之间测定其荧光，而植物油样品则加入石英比色皿中进行测定。荧光测定采用前表面突光技术，发射光角度选为56°以减小反射光,散射光和偏振光的干扰。二维突光发射光谱(维生素E)采集的参数为:激发波长设为295nm，发射波长范围为30(T500nm。激发和发射的狭缝宽度分别为5nm和2.5nm。每个对样品做两个平行测定，每个进行三次扫描。2、数据处理分析:将荧光光谱数据和脂肪酸含量数据导入Unscrambler v9.7软件。首先，对收集到的二维突光发射光谱(维生素E)做归一化处理(Normalized)。然后,采用偏最小二乘法(PLS)对归一化后的二维荧光数据和气相色谱法测得的脂肪酸含量数据进行回归计算，得到回归模型。采用内部交叉验证对模型进行验证。将荧光光谱测得的脂肪酸含量的预测值和气相色谱法测得的测定值结果导入SPSS软件，做T检验用来检验预测值与测定值间的相关性，做图基检验(Tukey’ s test)，用于预测值与测定值间的显著性差异分析(p〈0.05)。3、气相色谱测定-样品的准备:在60° C下，将乳脂融化，11180x g下离心10分钟后过滤。加入氢氧化钠将乳脂和植物油甲酯化，将0.1Og的乳脂或植物油转入具塞试管。加入2mL的0.5mol/L NaOH甲醇溶液，将盖子旋紧，将试管置于60° C水浴下保温30min。加入2mL25%三氟化硼溶液，继续保温20min后将试管从水浴中取出，冷却至室温后加入2mL正己烧，游润振汤，加入2mL饱和NaCl溶液，1789x g下离心IOmin后取上层有机相至干净的试管。加入无水乙酸钠去除多余的水分，将上层有机相转移至干净的试管，用于气相色谱测定。准备样品时，一个样品准备四个平行样，测定前将样品两两混合即一个样品测定两个平行。4、应用岛津气相色谱仪测定脂肪酸组成。采用火焰离子化检测仪和CP-WAX柱(30m x0.32mm;0.25μπι膜厚)。注射器和检测器的温度均设为250° C。载气为氮气，流速为3ml/min,燃气为氢气,流速为47ml/min,助燃气为空气,流速为400ml/min。为了优化实验条件，采用程序化升温进样:在开始3min内温度升到120° C，然后以10° C/min的速度升至190° C，之后再以2° C/min升至220° C，并保持15min。进样量为0.8 μ L，分流比1:8。通过系统已有的数据库和文献报道的保留时间值来鉴别不同的脂肪酸。结果用脂肪酸的质量百分数表示(w/w% )。实施例1实验步骤:(I)取样:将固体样品置于两个石英片间，或者将液体样品置于石英比色皿中；(2)样品的荧光测定:对样品进行荧光扫描，采集其二维荧光光谱；(3)建立模型:采用化学计量学方法构建荧光光谱数据和油脂脂肪酸含量的回归模型；(4)模型的验证:采用内部交叉验证的方法，作测定值和预测值间的相关性分析和显著性分析，验证模型；(5)脂肪酸含量测定:按照步骤(I)的方法取待测样品，按照步骤(2)的方法进行样品的荧光测定，将荧光数据代入回归模型，获得脂肪酸含量。所述的固体样品为黄油，取样方法是用空心铁管采样器取25mm直径(IOmm厚)的黄油置于两个石英片之间测定荧光；液体样品为植物油，直接倒入于石英比色皿中测定。所述的油脂测定过程中不包含任何化学反应步骤，属无损检测。所述的步骤(2)中样品的荧光光谱测定的采集方式和采集条件为:激发波长设为295nm，发射波长范围为30(T500nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5nm和2.5nm。所述的荧光测定采用前表面荧光技术，采用发射光角度为56°，以减小反射光，散射光和偏振光的干扰。所述的步骤(3)中油脂脂肪酸含量用气相色谱方法测定。所述的采用的化学计量学方法为偏最小二乘法(PLS)，偏最小二乘法(PLS)用于样品荧光光谱数据和脂肪酸含量的回归计算。所述的模型的验证采用SPSS软件内部交叉验证，图基检验(Tukey’ s test)用于样品脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的显著性分析，P〈0.05，t检验用来检验脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的相关性。样品:黄油butter, 10种植物油(葵花籽油sunflower seed,玉米油maize,芥花油canola,稻谷油rice-bran,花生油peanut,大豆油soybean,撤揽油virgin olive,油茶杆油 camellia,芝麻油 sesame,调和油 blended oil)。实验结果:表I为气相色谱法对黄油与植物油的脂肪酸组成测定结果，检测的脂肪酸为:肉豆蘧酸 myristic (C14:0),棕榈酸 palmitic (C16:0),硬脂酸 stearic (C18:0),油酸 oleic (C18:1)，亚油酸 linoleic (C18:2)和亚麻酸 linolenic (C18:3)。图1 为样品的二维荧光发射光谱(维生素E)，可以看到不同的样品的维生素E光谱图谱存在较大差异。应用偏最小二乘法对归一化后的维生素E的光谱数据和脂肪酸数据做回归计算，建立回归模型，采用内部交叉验证验证模型。表2为不同的脂肪酸和荧光光谱数据的相关性分析结果。饱和脂肪酸肉豆蘧酸(C14:0)，棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)和荧光光谱的相关性系数R2分别为0.903，
0.905和0.936。不饱和脂肪酸和荧光光谱的相关性较弱，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)和荧光光谱的相关系数R2分别为为0.061，0.269和0.550。总的来说，饱和脂肪酸含量与荧光光谱数据的相关系数R2在0.903、.936，荧光光谱数据和饱和脂肪酸的含量有很强的相关性，而不饱和脂肪酸的相关系数R2为0.06Γ0.550，相关性较弱。因此，优选的，本发明所述的方法应用于快速测定饱和脂肪酸含量。将脂肪酸含量荧光光谱的预测值和气相色谱的测定值导入SPSS软件。T检验的结果表明，脂肪酸含量的气相色谱检测值和荧光光谱预测值之间有显著的相关性((P〈0.05，r>0.914，SEM〈1.00)。图基检验(Tukey’s test)表明脂肪酸含量的气相色谱检测值和荧光光谱预测值之间没有显著性差异(P>0.05)。为了检验所建立模型的预测能力，按照方法，用所建立的回归模型对未知样品进行分析得到脂肪酸的含量。结果如表3所示，四种黄油样品的饱和脂肪酸含量平均回收率在78.89Γ104.4%，四种植物油样品的饱和脂肪酸含量中，肉豆蘧酸(C14:0)含量均偏低，棕榈酸(C16:0)的平均回收率在85.39Γ276`.6%，硬脂酸(C18:0)的平均回收率在349Γ185.8%。
权利要求
1.一种快速测定脂肪酸含量的荧光方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取样:将固体样品置于两个石英片间，或者将液体样品置于石英比色皿中； (2)样品的荧光测定:对样品进行荧光扫描，采集其二维荧光光谱； (3)建立模型:采用化学计量学方法构建荧光光谱数据和油脂脂肪酸含量的回归模型； (4)模型的验证:采用内部交叉验证的方法，作测定值和预测值间的相关性分析和显著性分析，验证模型； (5)脂肪酸含量测定:按照步骤(I)的方法取待测样品，按照步骤(2)的方法进行样品的荧光测定，将荧光数据代入回归模型，获得脂肪酸含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固体样品为黄油，取样方法是用空心铁管米样器取25mm直径(IOmm厚)的黄油置于两个石英片之间测定突光；液体样品为植物油,直接倒入于石英比色皿中测定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，油脂测定过程中不包含任何化学反应步骤，属无损检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中样品的荧光光谱测定的采集方式和采集条件为:激发波长设为295nm，发射波长范围为30(T500nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5nm和2.5nm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光测定采用前表面荧光技术，采用发射光角度为56° ,以减小反射光,散射光和偏振光的干扰。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中油脂脂肪酸含量用气相色谱方法测定。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用的化学计量学方法为偏最小二乘法(PLS)，偏最小二乘法(PLS)用于样品荧光光谱数据和脂肪酸含量的回归计算。
8.根据权利要求1所述的方法，所述的模型的验证采用SPSS软件内部交叉验证，图基检验(Tukey’ s test)用于样品脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的显著性分析，p〈0.05，t检验用来检验脂肪酸含量和荧光光谱法测定值的相关性。
全文摘要
本发明涉及一种应用前表面荧光快速测定脂肪酸含量的无损检测方法。首先，对油脂样品进行荧光扫描，收集其得到的二维荧光光谱数据，将荧光数据其与气相色谱法得到测得的脂肪酸数据用偏最小二乘法(PLS)作回归计算，得到回归模型分析。经验证，本模型对于饱和脂肪酸预测的相关系数荧光光谱和饱和脂肪酸含量的相关系数R2为在0.903~0.936，有很强的相关性。所建立的模型可以用于预测未知样品的脂肪酸含量。相对于常规检测方法如气相色谱法等检测方法，本发明简单快速、属无损检测，利用荧光技术大大提高了检测效率，可在实际应用于脂肪酸含量的检测。
文档编号G01N21/64GK103149187SQ201310053970
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者周鹏, 刘小鸣, 彼得·恩塔卡萨内, 张燕萍, 梁丽 申请人:江南大学