专利名称：傅立叶变换红外光谱技术对12种真菌的分类鉴定的制作方法
技术领域：
本发明属于对12种常见真菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-1R)技术对禾谷键抱霉(Fusariumgraminearum, F.graminearum)、栖土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)、黄暗青霉(Penicillium citreonigrum, P.citreonigrum)、黄曲霉(Aspergillusflavuus, A.flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)、拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii, T.pseudokoningii)、土生链抱霉(A lternari a humicola, A.humicola)、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)、烟曲霉(Aspergillus funigatus,A.funigatus)> 杂色曲霉(Aspergillus versicolor, A.uersicolor)、爺病键刀菌(Fusarium solani, F.solani)进行快速分类鉴定。
背景技术：
真菌特别是植物病原真菌，种类繁多且分布广泛，是引起小麦、水稻、大豆、蔬菜、花卉等大田作物和园艺作物病害的重要病原物，病害的发生经常造成作物大面积减产和粮食品质下降，有些属能引起人类和一些动物皮肤病等。另外，一些真菌常产生剧毒的代谢产物，掺入植物性食品中，对人类健康危害较大，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等，其会破坏人或动物的肝脏组织及免疫系统，具有较强的致癌性。如产黄曲霉毒素的黄曲霉菌、寄生曲霉，产赭曲霉毒素的曲霉菌属和青霉菌属等。因此快速准确地对这些真菌进行鉴定是防治植物病害和食品真菌毒素污染的重要技术手段。FT-1R技术以未损伤细胞的FT-1R光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞所有组成成分的化学键的振动情况，因此可以区分生化信息上的差别。FT-1R提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定量信息，反应微生物的信息相比更全面。其优点在于分辨率高、鉴定时间短、成本低。但光谱技术在微生物分类鉴定中的应用尚不够系统和成熟，尚不够规范，有待对其进行统一并形成标准方法。目前国内外还没有对上述12种真菌的规范、统一的FT-1R分类 鉴定方法公开，也没有关于13种真菌FT-1T光谱信息共享数据库的公开，该发明可弥补上述缺陷，建立12种真菌的规范、统一的FT-1R分类鉴定方法。
发明内容
本发明属于对12种真菌的分类鉴定，具体地说是应用FT-1R技术，结合化学计量学运算，实现对 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.f lavus>A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor>F.solani的分类鉴定。包括建立12种标准菌株光谱信息数据库,规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法等。本发明所采用的技术方案为:应用FT-1R技术，建立F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus>A.uersicolor、F.solani 等12种标准菌株的光谱信息数据库，同时规范并统一细菌培养条件、样品制备条件、光谱采集参数及数据分析方法。采用相同细菌培养、样品制备及光谱采集方法，获得可疑待测菌的光谱数据，与12种标准菌株的光谱信息数据库合并，并进行分级聚类分析(hierarchicalcluster analysis, HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据获得可疑待测菌的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。本发明涉及的12种真菌的FT-1R分类鉴定方法，依次包括下列步骤(1)-(2):(I)建立12种真菌的红外光谱信息数据库①细菌的培养:用无菌接种环挑取标准菌株F.graminearum CGMCC3.4733、A.terricola CGMCC3.3557、P.citreonigrum CGMCC3.5694、A.flavus CGMCC3.6434、A.parasiticus CGMCC3.6156、P.aurantiogriseum CGMCC3.5691、T.pseudokoningiiCGMCC3.3002、A.humicola CGMCC3.3907、P.viridicatum CGMCC3.5690、A.funigatusCGMCC3.6452、A.uersicolor CGMCC3.6410、F.solaniCPCC460008 一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上，28°C ±1°C静置培养5d;②硒化锌(ZnSe)窗片的制作:在无菌操作工作台中，用灭好菌的小铁勺将培养好的菌丝刮下,放入盛有ImL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，5000g离心5min,吸弃上清,力口入ImL无菌生理盐水悬浮洗漆,5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆,5000g离心5min，超纯水重复洗涤两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混匀。用微量移液器分别吸取各不同稀释度的菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑；③读取真菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱:光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为 波段范围4000 e OOcnT1，光谱分辨率4CHT1，64次光谱累计求平均。每种菌至少做6次试验，每次做3个重复并取平均，获得6个有效光谱数据；④光谱预处理:对12种真菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、矢量归一化、光谱-excel数据转换，即建立了 12种真菌的红外光谱信息数据库；⑤聚类方法的建立:对12种真菌的900-18000^1和2800-3700^^1波数范围光谱数据进行分级聚类分析(HCA)，获得实现12种真菌分类鉴定的方法参数:HCA:皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)。(2)对目标菌的分类鉴定采用上述真菌培养、硒化锌(ZnSe)窗片制作、光谱采集及光谱预处理方法，获得可疑待测目标菌的红外光谱数据。将其与12种标准菌株的光谱信息数据库合并，按照上述方法对合并后的数据重新进行分级聚类分析(HCA)，相同菌的图谱应归为一类，根据待测菌在数据库中的归类图谱情况，实现对待测菌的分类鉴定。F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor> F.solani 分别聚类到数据库中对应的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、Auersicolor> F.solani 聚类群中。
图1:应用HCA对12种真菌标准菌株的分类图；图2:实施例中应用HCA对供试样品中12种真菌的分类鉴定图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例供试样品制备:将无菌辣椒粉分为12份，每份500g ；菌悬液制备 :用灭好菌的小铁勺将培养好的菌丝刮下，放入盛有ImL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，反复吹吸数次；添加:向辣椒粉中其中分别添加F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 标准菌株溶液各 IOmL,揽拌混勻，冷冻备用。按下述方法检测供试样品:包括纯净水，0.9%生理盐水，无水乙醇，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)等；按照以下程序进行检测:(I)真菌培养称取12份辣椒粉供试样品各25g至盛有225mL灭菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，分别吸取ImL样品匀液于I个无菌平皿内，将15 20mL冷却至46°C的马铃薯葡萄糖琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板倒置，28 0C ±1°C 培养 5d。(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作在无菌操作工作台中，用灭好菌的小铁勺将培养好的菌丝刮下，放入盛有ImL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，加入ImL无菌生理盐水悬浮洗漆,5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆,5000g离心5min,超纯水重复洗漆两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混匀。用微量移液器分别吸取各不同稀释度的菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑:(3)读取细菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱将载有样品的ZnSe窗片置于傅立叶变换红外光谱仪上进行光谱采集，光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为:波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率4(311^,64次光谱累计求平均。每种菌做3个重复并取平均；(4)光谱预处理对待测菌4000 eOOcnT1波数范围的红外光谱依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、矢量归一化、导数谱-excel数据转换；(5)数据分析
将待测菌光谱数据与12种标准菌株的光谱信息数据库合并，对gOO-lSOOcm—1和2800-3700(^1波数范围光谱数据进行HCA(皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method,Pearsonr)):F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、Auersicolorλ F.solani 分别聚类到数据库中对应的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 聚类群中。分类鉴定情 况见图2。
权利要求
1.一种对禾谷键抱霉、栖土曲霉、黄暗青霉、黄曲霉、寄生曲霉、結灰青霉、拟康氏木霉、土生链孢霉、鲜绿青霉、烟曲霉、杂色曲霉、茄病镰刀菌等12种真菌的的分类鉴定方法，其特征在于数据库的建立: 对禾谷键抱霉(Fusarium graminearum, F.graminearum) CGMCC3.4733、栖土曲霉(Aspergillus terricola, A.terricola)CGMCC3.3557、黄暗青霉(Penicilliumcitreonigrum, P.citreonigrum) CGMCC3.5694、黄曲霉(Aspergillus f lavus, A.flavus)CGMCC3.6434、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus, A.parasiticus)CGMCC3.6156、桔灰青霉(Penicillium aurantiogriseum, P.aurantiogriseum)CGMCC3.5691> 拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii, T.pseudokoningii)CGMCC3.3002、士生链抱霉(Alternaria humicola,A.humicola)CGMCC3.3907、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum,P.viridicatum)CGMCC3.5690> 烟曲霉(Aspergillus funigatus, A.funigatus)CGMCC3.6452、杂色曲霉(Aspergillus versicolor,A.uersicolor)CGMCC3.6410、爺病键刀菌(Fusarium solani,F.solani) CPCC460008 等 12 种标准菌株 4000 ΘΟΟαιΓ1 波数范围的傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT IR)依次进行如下处理:透过率-吸光度转化、基线校正、矢量归一化、光谱-excel数据转换，即建立了 12种真菌的红外光谱信息数据库。
2.根据权利要求1所述的12种真菌的傅立叶变换红外光谱鉴别方法，其特征是依次包括以下步骤: (1)细菌的培养:用无菌接种环挑取可疑 F.graminearum、Aterricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor、F.solani 一环，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上，.28 °C ±1°〇静置培养5(1。
(2)硒化锌(ZnSe)窗片的制作: 在无菌操作工作台中，用灭好菌的小铁勺将培养好的菌丝刮下，放入盛有ImL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，5000g离心5min，吸弃上清，加入ImL无菌生理盐水悬浮洗涤，5000g离心5min,再加入ImL超纯水悬浮洗漆,5000g离心5min,超纯水重复洗漆两次。最后用50 μ L超纯水悬浮混匀。用微量移液器分别吸取各不同稀释度的菌悬液10 μ L于ZnSe窗片中心位置，水平置于45°C干燥箱中烘干至无水分的干燥菌斑。
(3)读取真菌4000 600CHT1波数范围的红外光谱: 将载有样品的ZnSe窗片置于傅立叶变换红外光谱仪上进行光谱采集，光谱参数为:模式为透过率模式(采用气氛补偿功能去除环境大气中的水蒸气和CO2的吸收光谱干扰)。实验参数为:波段范围4000 eOOcnT1，光谱分辨率4(311^,64次光谱累计求平均。
(4)光谱预处理: 根据权利要求1，对光谱进行处理，得到由光谱转换的excel数据。
(5)对数据进行分级聚类分析(hierarchicalcluster analysis, HCA): 对上述处理的菌900-18000^1和2800-37000^1波数范围光谱数据进行HCA ； HCA:皮尔森积矩相关系数(Ward’ s method, Pearsonr)； F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funigatus、A.uersicolor λ F.solani 分别聚类到数据库中对应的 F.graminearum、A.terricola、P.citreonigrum、A.flavus、A.parasiticus、P.aurantiogriseum、T.pseudokoningi1、A.humicola、P.viridicatum、A.funi gatus、A.uersicolor、F.solani 聚类群中。
全文摘要
本发明属于对12种常见真菌的快速分类鉴定方法，具体地说是用傅立叶变换红外光谱(FTIR)技术结合化学计量学运算(分级聚类分析)对禾谷镰孢霉(F.graminearum)、栖土曲霉(A.terricola)、黄暗青霉(P.citreonigrum)、黄曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、桔灰青霉(P.aurantiogriseum)、拟康氏木霉(T.pseudokoningii)、土生链孢霉(A.humicola)、鲜绿青霉(P.viridicatum)、烟曲霉(A.funigatus)、杂色曲霉(A.uersicolor)、茄病镰刀菌(F.solani)等12种常见真菌进行分类鉴定。方法包括12种真菌FTIR光谱信息数据库的建立、真菌的培养、硒化锌(ZnSe)窗片的制作、光谱采集及预处理，最后采用分级聚类分析进行结果判定。其优点在于分辨率高、快速、操作简单、成本低。
文档编号G01N21/35GK103217399SQ20131006397
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者杨丽君, 李兆杰, 王静, 徐成钢 申请人:威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心