专利名称：一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及用于生物样品的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器及其制备方法和检测方法。
背景技术：
微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，是在微电子、微机械、生物工程和纳米技术基础上发展起来的一门全新交叉学科。微流体技术采用生物学技术原理，利用半导体集成技术制作新型固体元件或“芯片实验室”，可对微量流体(包括液体和气体)进行复杂、精确的操作，如:混合和分离微量流体、化学反应、微量分析，等等。由于微流体器件体积小，可调控参数多，调控精确度高，自动化程度高，可以集成和大量生产，在分析化学、生物医学、诊断及药物学研究中有很大的应用前景。由于微流体技术使传统检测技术实现微量集成，具有操作便捷、检测快速等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。伴随相关应用领域对即时、快速定量检测需求的逐步提闻，相关的微流 体检测技术也应运而生。磁分离技术是将物质进行磁场处理的一种技术，该技术的应用已经渗透到各个领域，该技术是利用元素或组分磁敏感性的差异，借助外磁场将物质进行磁场处理，从而达到强化分离过程的一种新兴技术。随着强磁场、高梯度磁分离技术的问世，磁分离技术的应用已经从分离强磁性大颗粒到去除弱磁性及反磁性的细小颗粒，从最初的矿物分选、煤脱硫发展到工业水处理，从磁性与非磁性元素的分离发展到抗磁性流体均相混合物组分间的分离。作为洁净、节能的新兴技术，磁分离将显示出诱人的开发前景。发明名称为“一种兴奋剂快速检测生物芯片及其检测方法”(申请号为03137051.9)的专利文献中记载道:在固体载体表面固定有被检测兴奋剂分子的受体蛋白质，在同一芯片板上具有一系列微反应点，而这些微反应点通过微沟槽通道连结成一封闭的具有微流体流入和流出端口的分析板或普通板芯片。将样品中的兴奋剂分子与受体芯片作用，再将标记后的兴奋剂与受体芯片作用，并最终通过检测芯片上受体点阵上的标记物强度，或者样品中兴奋剂的量。但是上述专利文献中的技术存在以下缺点:(1)采用固体载体表面固定蛋白包被，造成试剂检测范围局限于某一较小的范围(一般为1(Γ25倍浓度范围)，同时反应体系采取固相包被物与待测物被动接触反应模式，由于处于非均相条件下，其反应效率低于均相条件下亲和反应效率；(2)为实现反应物质与杂质的分离，反应步骤采取多步操作形式，操作复杂，操作时间较长。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器及其制备方法和检测方法，可以在均相(液相)条件下对生物样品进行快速、准确的检测。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现:
一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，包括磁性蛋白和探针蛋白，所述磁性蛋白为以磁性微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，所述探针蛋白为以探针微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，且所述磁性蛋白和探针蛋白根据所述待测物的性质配对组合使用。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其中:所述磁性微球的材料包括顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料，且其比饱和磁化强度大于等于0.1 emu/g。所选材料受施加磁场的影响被吸引/被排斥，或具有可检测的磁易感性或诱导。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其中:所述磁性微球的粒径为50纳米飞00纳米，所述探针微球的粒径为50纳米飞00纳米。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其中:所述磁性蛋白和探针蛋 白之间的配对组合使用方式包括捕获法、双抗原夹心法、双抗体夹心法、间接法和竞争法。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其中:还包括至少一个的加样孔、反应及检测通道和废液收集池，所述磁性蛋白和探针蛋白经干燥固定在所述加样孔的底部。上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，包括如下步骤:
(1)采用在磁性纳米粒子的内核表面覆盖有官能团的高分子材料的方法或向表面覆盖有官能团的高分子材料聚合微球中包埋磁性纳米粒子的方法制备得到所述磁性微球；
(2)采用向表面覆盖有官能团的高分子材料聚合微球中包埋探针物质的方法制备得到所述探针微球，探针物质的光学特性包括浊度分析、光吸收分析、荧光激发等，探针微球的检测方式是采用一定波长入射光进行照射，并利用探针微球对入射光的散射/透射率分析、吸收率分析及入射光激发所产生的发射光分析等方式实现信号检测；
(3)将步骤(I)制备得到的磁性微球和与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白通过采用偶联或疏水作用方式实现固定，制备得到所述磁性蛋白；
(4)将步骤(2)制备得到的探针微球和与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白通过采用偶联或吸附方式实现固定，制备得到所述探针蛋白；
(5)将步骤(3)制备得到的磁性蛋白和步骤(4)制备得到的探针蛋白加入到加样孔中，并真空烘干；
(6)将加样孔通过反应及检测通道与废液收集池连通，加样孔和废液收集池的端部进行密封。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其中:所述探针物质具有荧光激发特性，利用低波长入射光照射，激发后产生高波长发射荧光信号，包括罗丹明及其衍生物、香豆素极其衍生物、荧光素及其衍生物和镧系稀土元素及其螯合物中的一种或多种。
优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其中:所述探针物质的激发光波长与发射光波长之间的斯托克位移大于20纳米，其荧光寿命半衰期大于I纳秒。优选的，上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其中:所述官能团为-COOH、-NH2、-OH或-CHO。上述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的检测方法，包括如下操作步骤:
(1)将待测液体样品加入至加样孔中，使加样孔内的所述磁性蛋白和所述探针蛋白得以释放，并与待测液体样品混合均匀；
(2)通过毛细管虹吸力或空气压力驱动使加样孔中的混合液体在反应及检测通道中向前推进；
(3)在反应及检测通道的中段设置电磁富集模块，在混合液体通过时，利用电磁吸引原理通过对磁性微球进行截留，使磁性蛋白以及反应形成的磁性蛋白-探针蛋白复合物或磁性蛋白-待测物-探针蛋白复合物得以截留，而混合液体中的惰性杂质和剩余的探针蛋白跟随混合液体向前继续流动， 并最终流至废液收集池；
(4)在全部混合液体流过反应及检测通道后，用光电检测模块检测反应及检测通道的中段的荧光信号强度，并根据荧光信号-浓度的比例关系计算得到待测液体样品中的待测物的浓度值。本发明的突出效果为:本发明实现了磁分离技术和微流体技术的组合使用，在待测液体样品中含有待测物时，待测物与磁性蛋白及探针蛋白作用后反应形成磁性蛋白-探针蛋白复合物或磁性蛋白-待测物-探针蛋白复合物，利用微流体推动作用前进，然后利用磁场作用将含有磁性微球的磁性蛋白-探针蛋白复合物或磁性蛋白-待测物-探针蛋白复合物截留，最终通过检测截留区域上探针蛋白中探针物质的信号强度，计算得到待测液体样品中待测物的含量。磁性蛋白一方面作为与待测物及探针蛋白的反应载体，另一方面在微流体推进过程中，利用磁极性吸引作用实现磁性蛋白-探针蛋白复合物或磁性蛋白-待测物-探针蛋白复合物与待测液体样品中其他物质的分离，以达到降低干扰，提高检测结果的精确度，准确性和灵敏度的作用，避免了应用膜层析快速检测方法时层析反应过程中因膜孔径差异导致的反应差异；采用磁性微球作为反应载体，提高了蛋白的包被量，从而提高了反应效率；反应与分离同时进行，操作简单、快速，可适用于多种领域的生物样品的定性定量检测。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图1是本发明实施例1的微流体反应器的结构示意 图2是本发明实施例1的反应示意 图3是本发明实施例1中肌钙蛋白I的荧光信号-浓度标准曲线 图4是本发明实施例2中氯霉素的荧光信号-浓度标准曲线图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1:
本实施例采用肌钙蛋白I抗体为常规单克隆抗体技术制备的单抗，利用双抗体夹心法检测肌钙蛋白I抗原的原理检测待测液体样品中的肌钙蛋白I的含量。如图1 图2所示，本实施例中检测肌钙蛋白I的微流体反应器由加样孔、反应及检测通道和废液收集池组成。加样孔底部干燥固定有探针蛋白和磁性蛋白，在加入样品后，探针蛋白及磁性蛋白复溶至样品溶液中。加样孔侧壁开孔并与反应及检测通道连接；反应及检测通道采用玻璃毛细管材料，在加样孔加样及混合操作完成后，提供正压压力，促使加样孔内溶液向反应及检测通道迁移。本实施例中，使用特定的激发光(580nm) /发射光(615nm)波长的突光胶乳(直径约300nm)标记I株肌I丐蛋白I的单克隆抗体(0.5mg/ml 7mg/ml);同时采用肌I丐蛋白I的另一株单克隆抗体(0.5mg/ml 7mg/ml)与磁性微球(直径约300nm)进行偶联。本实施例中，全程定量检测肌钙蛋白I的微流体反应器的制备方法包括以下步骤:
I)荧光乳胶微球/磁性乳胶微球的共价活化
超声波处理荧光乳胶微球/磁性乳胶微球30秒后，调节荧光乳胶微球/磁性乳胶微球浓度为1% (w/v), IOOOOrpm 16000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用IOOmM, pH6.0的Hepes缓冲液溶解，并超声波200W处理30秒，完成缓冲液的置换并得到清洗待用的荧光乳胶微球/磁性乳胶微球；然后加入100 μ I的100mg/ml EDC,使用漩涡混匀器涡漩振荡混匀，再加入50 μ I的50mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulf0-NHS)，使用漩涡混匀器涡漩振荡混匀；室温孵育30分钟后IOOOOrpm 15000rpm离心5分钟 15分钟，沉淀用IOOmM,pH5.0 6.0的MES缓冲液溶解，放置在2V 8°C条件下备用，得到羧基(-C00H)官能团活化后的探针微球/磁性微球。2)探针蛋白/磁性蛋白的制备
将活化后的探针微球/磁性微球超声波200W处理30秒后，按照50 μ g标记抗体/100 μI微球的比例加入对应的肌钙蛋白I单克隆抗体，混匀后室温搅拌反应2小时；向偶联后的探针微球/磁性微球超声波200W处理30秒后，按照50 μ g乙醇胺/100 μ I微球的比例加入乙醇胺进行位点封闭，混匀后室温搅拌反应I小时。离心洗涤3次，每次IOOOOrpm 15000rpm转速离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波200W处理30秒，用PBS-TBN缓冲液恢复离心前体积，得到探针蛋白/磁性蛋白(即荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体及磁性微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体)。3)肌钙蛋白I的微流体反应器的制备
将偶联及封闭完成的荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体及磁性微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体按1: 20 1: 500的稀释度，5μ I/管的用量，加入到加样孔中，并真空烘干。使用热熔封口膜将微流体反应器加样孔及废液收集池杯口顶部进行密封。本实施例采用的肌钙 蛋白I抗体为常规单克隆抗体技术制备的单抗，利用双抗体夹心法检测肌钙蛋白I抗原的原理检测待测液体样品中肌钙蛋白I的含量，其检测方法包括如下步骤:
1)撕开微流体反应器加样孔杯口顶部热熔封口膜，使用移液器吸取100微升血清标本加入到加样孔中，使用移液器反复吹吸加样孔中的液体，使加样孔内预先加入并干燥的荧光胶乳微粒标记的肌钙蛋白I单克隆抗体及磁性微球标记的肌钙蛋白I单克隆抗体得以释放，并在液体中混匀；
2)将微流体反应器放入到微流体检测仪中，仪器启动气动推进阀将反应液体推进至反应及检测通道；
3)在反应及检测通道的中段，设置电磁富集模块及光电检测模块，在混合液体通过时，利用电磁吸引原理通过对磁性微球进行截留，使磁性蛋白以及反应形成的磁性蛋白-肌钙蛋白1-探针蛋白复合物得以截留，而混合液体中的惰性杂质和剩余的探针蛋白跟随混合液体向前继续流动，并最终流至废液收集池；
4)在全部混合液体流过反应及检测通道后，用光电检测模块检测反应及检测通道的中段的荧光信号强度，并根据荧光信号-浓度的比例关系(如图3所示)计算得到血清标本中的待测物的浓度值。对本实施例的肌钙蛋白I检测微流体反应器进行了性能测定，利用本实施例所述的微流体反应器对肌钙蛋白I进行检测，测定线性范围为0.01 ng/ml 2.4 ng/ml，线性范围内相关系数R2达到0.999，线性范围内试剂检测精密度CV % < 5% ;结果如下表I所示。表1:肌钙蛋白I精密度实验数据
权利要求
1.一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其特征在于:包括磁性蛋白和探针蛋白，所述磁性蛋白为以磁性微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，所述探针蛋白为以探针微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，且所述磁性蛋白和探针蛋白根据所述待测物的性质配对组合使用。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其特征在于:所述磁性微球的材料包括顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料，且其比饱和磁化强度大于等于0.1 emu/g。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其特征在于:所述磁性微球的粒径为50纳米飞00纳米，所述探针微球的粒径为50纳米 500纳米。
4.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其特征在于:所述磁性蛋白和探针蛋白之间的配对组合使用方式包括捕获法、双抗原夹心法、双抗体夹心法、间接法和竞争法。
5.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，其特征在于:还包括至少一个的加样孔、反应及检测通道和废液收集池，所述磁性蛋白和探针蛋白经干燥固定在所述加样孔的底部。
6.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)采用在磁性纳米粒子的内核表面覆盖有官能团的高分子材料的方法或向表面覆盖有官能团的高分子材料聚合微球中包埋磁性纳米粒子的方法制备得到所述磁性微球； (2)采用向表面覆盖有官能团的高分子材料聚合微球中包埋探针物质的方法制备得到所述探针微球； (3)将步骤(I)制备得到的磁性微球和与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白通过采用偶联或疏水作用方式实现固定，制备得到所述磁性蛋白； (4)将步骤(2)制备得到的探针微球和与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白通过采用偶联或吸附方式实现固定，制备得到所述探针蛋白； (5)将步骤(3)制备得到的磁性蛋白和步骤(4)制备得到的探针蛋白加入到加样孔中，并真空烘干； (6)将加样孔通过反应及检测通道与废液收集池连通，加样孔和废液收集池的端部进行密封。
7.根据权利要求6所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其特征在于:所述探针物质具有荧光激发特性，包括罗丹明及其衍生物、香豆素极其衍生物、荧光素及其衍生物和镧系稀土元素及其螯合物中的一种或多种。
8.根据权利要求 7所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其特征在于:所述探针物质的激发光波长与发射光波长之间的斯托克位移大于20纳米，其荧光寿命半衰期大于I纳秒。
9.根据权利要求6所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的制备方法，其特征在于:所述官能团为-COOH、-NH2, -OH或-CH0。
10.根据权利要求1所述的一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器的检测方法，其特征在于包括如下操作步骤: (1)将待测液体样品加入至加样孔中，使加样孔内的所述磁性蛋白和所述探针蛋白得以释放，并与待测液体样品混合均匀； (2)通过毛细管虹吸力或空气压力驱动使加样孔中的混合液体在反应及检测通道中向前推进； (3)在反应及检测通道的中段设置电磁富集模块，在混合液体通过时，利用电磁吸引原理通过对磁性微球进行截留，使磁性蛋白以及反应形成的磁性蛋白-探针蛋白复合物或磁性蛋白-待测物-探针蛋白复合物得以截留，而混合液体中的惰性杂质和剩余的探针蛋白跟随混合液体向前继续流动，并最终流至废液收集池； (4)在全部混合 液体流过反应及检测通道后，用光电检测模块检测反应及检测通道的中段的荧光信号强度，并根据荧光信号-浓度的比例关系计算得到待测液体样品中的待测物的浓度值。
全文摘要
本发明揭示了一种基于磁分离技术和微流体技术的快速检测微流体反应器，包括磁性蛋白和探针蛋白，所述磁性蛋白为以磁性微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，所述探针蛋白为以探针微球为载体固定有与待测物相应位点发生特异性结合或者与待测物结构相同的特异性蛋白，且所述磁性蛋白和探针蛋白根据所述待测物的性质配对组合使用。本发明实现了磁分离技术和微流体技术的组合使用，达到降低干扰，提高检测结果的精确度，准确性和灵敏度的作用，提高了反应效率，反应与分离同时进行，操作简单、快速，可适用于多种领域的生物样品的定性定量检测。
文档编号G01N21/64GK103223323SQ20131006530
公开日2013年7月31日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者张鹏 申请人:苏州市博纳泰科生物技术有限公司