专利名称：一种检测猪输血传播病毒2型抗体的间接elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测猪输血传播病毒2型(即猪TTV2)抗体的间接ELISA试剂盒，属于兽医生物技术领域。
背景技术：
TTV (Torque Teno virus)又名输血传播病毒，属指环病毒科(Anelloviridae),壬型细环病毒属(1tatorquevirus),是一种无囊膜的单股环状负链DNA病毒。最早是由日本学者Nishizawa等于1997年发现的，由于该病毒是从肝炎患者体内分离获得的，因此怀疑其与肝炎有关，从而引起了高度关注。随后各国对本国不同人群中TTV感染情况进行了流行病学调查，结果发现人群中TTV DNA阳性率一般在10%以上。目前已经证实，除了人类可以感染TTV以外，在灵长类动物(黑猩猩、类人猿和猴)、家畜(猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、树駒和骆驼)体内均相继检测到了 TTV的存在。研究表明TTV已经在世界猪群中广泛存在，并且可能与某些疾病的引起有关，因此已在全球引起重视。Segales J等对1985年-2005年间，采自西班牙99个猪场的162份血清样品进行TTV检测，结果在 所有年份中均检测出猪TTV，在母猪和肉猪中，TTVl的阳性率分别为34.2%和30.9%, TTV2的阳性率分别为46.6%和62.8%, TTVl和TTV2共感染率分别为19.8%和24.5%,该结果表明至少在1985年猪TTV就已经存在于西班牙猪场中。Martinez等对西班牙178头野猪中TTV的感染情况进行了调查，结果总阳性率为84%，TTVl和TTV2的阳性率分别为58%和66%，TTVl和TTV2共同感染的阳性率为18%，但该结果被认为与地理位置有关。王礞礞等首次对国内来自广东、福建和江西等7个省份的258份猪血液样品和组织样品进行了检测，结果表明猪群中TTVl和TTV2感染阳性率分别为37.6%和82.6%，TTV2阳性率明显高于TTVl，二者的混合感染率为34.5%，证实我国猪群中存在TTV感染，并且以TTV2较为流行。该病毒经常与其他病毒发生共同感染。McKeown N E等研究表明，该病毒与已知病原的混合感染能够增加疾病的严重性，而且该病毒具有潜在的跨种传播给人的危害，这也提示我们不能忽视对该病毒的研究。对于新发疫病的诊断和防制工作是科研工作者首要解决的关键，目前只有通过PCR技术扩增TTV的核酸来诊断，建立该病毒的抗体检测方法，对该病的流行病学调查、免疫效果的评价等极有意义，而ELISA因具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、易于基层推广等特点而倍受欢迎，成为目前应用最广泛的一种血清学检测方法。由于目前猪TTV尚不能在体外培养中得到很好的增殖，所以通过分子生物学方法大量表达TTV的抗原蛋白并以此作为包被抗原建立检测猪血清中抗TTV抗体的ELISA成为最佳选择。猪TTV分为两个亚型，即TTVl和TTV2，基因组之间变异的一个突出特点是，与TTV2相比，TTVl有大量的变异位点，即TTVl的变异性比TTV2的大。在TTVl中，总共有1349个变异位点，平均每个变异位点有1.27个替代物，在TTV2中变异位点比较少，共有670个。此外，ORFs之间的突变模式也是不同的:0RF1可能编码病毒衣壳蛋白(Cap)和复制相关蛋白(Rep)，比较保守，在密码子的第三个位置的变化率比较高，尽管已经报道了 0RF2和0RF3的一些保守区域，但相对来说，二者的保守性比较低。且我国TTV的流行情况表明，TTV2感染率明显高于TTVl，我国TTV2较为流行。因此，本发明以猪TTV流行亚型TTV2的相对保守基因ORFl基因为模板，进行原核表达、纯化，利用纯化的重组蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法，为该病毒的早期诊断以及大规模的检测提供了技术手段。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种能快速、简便地检测猪TTV2血清抗体的间接ELISA试剂盒，即利用pcoldl原核表达载体，构建了能表达猪TTV2 ORFl部分基因的载体，并将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA板，以检测猪血清中TTV2的抗体水平。技术方案
本发明通过以下步骤实现:
一种能快速、简便地检测 猪TTV2血清抗体的间接ELISA试剂盒，试剂盒内设有抗体检测板，封闭液，样品稀释液，洗涤液，酶结合物工作液，酶底物溶液，终止液，阳性对照和阴性对照；其中抗体检测板为包被猪TTV2重组ORFl蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪TTV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清，包被猪TTV2重组ORFl蛋白序列如下:
IDLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY 5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS 101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN 151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD 20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK 251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI 30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT 351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR 401 MKT。所述的猪TTV2重组ORFl蛋白是由原核表达质粒pcoldl-ORFl表达的，原核表达质粒pcoldl-ORFl是由以下方法构建而成的:
O利用基因工程重组技术构建猪TTV2 ORFl部分基因的原核表达质粒，命名为pcoldl-ORFl ;是由以下方法构建而成的，设计了一对含有酶切位点的引物:
SFORF1: CCGCTTG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG {Xho I)
SR0RF1: CCCA4 化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA {Hindi II)
利用上述特异性引物，从TTV2阳性病料中扩增基因片段，得到1227bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pcoldl载体进行酶切，用T4 DNA连接酶顺次将酶切的PCR扩增片段连接到pcoldl上。具体来说，首先将pcoldl载体和SF0RF1与SR0RF1引物扩增的片段分别经通ol和历/^III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pcoldl-ORFl载体，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态中，提取质粒，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序鉴定。
挑取经通ol和历/^III双酶切出1215bp条带的质粒进行测序，测序结果表明目的片段与pcoldl载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，结果表明重组原核表达载体质粒pcoldl-ORFl构建成功。2)将质粒pcoldl-ORFl转化宿主菌大肠杆菌BL21中成为基因工程菌(命名为BLpcold1-ORFUdf BLpcold1-ORFl 在 LB 培养基中于 15°C培养，经 0.2mmol/L 诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中；从而获得猪TTV2重组蛋白的原核表达质粒pcoldl-ORFl。3)以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测猪血清中猪TTV2的抗体水平；
(O包被:将权利要求1或2所述的一种猪TTV2 ORFl截短蛋白的原核表达质粒pcoldl-ORFl表达的重组蛋白纯化后用抗原包被液稀释为1.65 μ g/mL的终浓度，每个ELISA孔加入100 μ I，4°C条件下包被过夜。弃去板中的包被液体，PBST缓冲液洗涤5minX 3次。抗原包被液为0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液；PBST缓冲液为含质量比0.01%Tween-20的PBS缓冲液；
(2)封闭:每孔加封闭液200μ 1，37°C条件下作用lh，PBST缓冲液洗涤5minX3次；封闭液为含质量比2%脱脂奶粉的PBS缓冲液；
(3)加待检血清:每孔加入100μ I用含有质量比0.5%BSA的PBS稀释后的血清，37°C条件下作用1.0h, PBST缓冲液洗涤5minX3次；
(4)加二抗:每孔加入100μ I稀释的HRP标记的羊抗猪IgG, 37°C条件下作用30 min,PBST缓冲液洗涤5minX 3次；稀释的HRP标记的羊抗猪IgG为用pH7.0的PBS按1:5000比例稀释；
(5)加显色液:每孔加含lm·g/mlTMB四甲基联苯二胺的显色液100 μ 1，37°C避光作用5 min ；
(6)加终止液:每孔加入100μ I终止液，酶标仪测定450 nm吸光值0D450 ;终止液为2M H2SO4 ；
(7)结果判定:待检血清0D450值>0.248时判定为猪TTV2抗体阳性，0D450值Z 0.248判定为阴性。有益效果
本发明方法首次利用分子生物学基因克隆表达技术，获得猪TTV2 ORFl重组蛋白，以重组蛋白为抗原建立间接ELISA，可对目前我国流行的猪TTV2进行有效的诊断，判断猪群中TTV2抗体水平和自然感染的状况，为猪TTV2病毒的防制提供了一种快速、简便的检测方法。试验证明，本发明首次利用表达和纯化后的重组蛋白(TTV2 0RF1)作为抗原包被ELISA板建立的间接ELISA方法，确实可以检测到猪体内抗猪TTV2抗体，且具有良好的特异性和重复性。对临床样品进行检测，结果表明本方法可以作为猪TTV2血清学检测的一种方法而运用到生产实际中。
图1重组蛋白表达和纯化后的SDS-PAGE分析1:超声波裂解沉淀；2:超声波裂解上清；3:诱导后产物；4:未诱导产物；5:蛋白Marker
图2免疫印迹试验显示猪TTV2 ORFl重组表达蛋白 1:蛋白Marker ； 2:pcold1-0RFl表达蛋白的纯化产物 图3纯化蛋白的Western blotting检测 1:空载体诱导蛋白；2:pcold1-0RFl纯化蛋白；3:蛋白Marker
具体实施例方式本发明的要点是:利用pcoldl构建部分猪TTV2 ORFl基因的原核表达载体，并将表达后的重组蛋白进行纯化，建立间接ELISA检测试剂盒和检测方法，并运用于临床检测。包被抗原的制备:
1.1特异性引物设计与合成:根据GenBank收录的猪TTV2基因序列(GenBank登录号为:EF514716)，选取编码猪TTV2开放阅读框ORFl基因，利用Primer Premier 5.0软件设计了含有酶切位点的弓I物并提交上海英骏公司进行合成。SFORFl-:CCGC7TG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG {Xhol)
SRORFl: CCCA4化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA {HindiII)
1.2原核表达载体的构建:利用上述特异性引物，从TTV2阳性病料中扩增基因片段，得到1227bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pcoldl原核表达载体(购自Takara)进行酶切,用T4 DNA连接酶(购自Takara)顺次将酶切的PCR扩增片段连接到pcoldl上。具体来说，首先将pcoldl载体和SF0RF1与SR0RF1引物扩增的片段分别经通ol和历/^III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pcoldl-ORFl载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a (北京全式金生物技术有限公司)感受态中，提取质粒，酶切鉴定阳`性克隆，鉴定为阳性克隆的送南京金思瑞公司进行序列测定。挑取经通ol和历/^III双酶切出1215bp条带的质粒进行测序，测序结果表明目的片段与pcoldl载体正确相连，表达蛋白的阅读框正确，结果表明重组原核表达载体质粒pcoldl-ORFl构建成功。将质粒pcoldl-ORFl转化宿主菌大肠杆菌BL21中成为基因工程菌，命名为基因工程菌BLpcold1-ORFl。所述重组原核表达载体质粒pcoldl-ORFl表达的重组蛋白序列如下:
I DLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY
5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR401 MKT
1.3重组蛋白的诱导表达和分析将基因工程菌BLpcold1-ORFl按2%比例接种于含Amp的LB液体培养基(在950mL去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L)中，15°C振荡培养至0D600 ^ 0.4 0.6，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，进行诱导表达，收集诱导后不同时间表达的菌体，于冰浴上进行超声破碎，裂解后的菌液经IOOOOrpm离心30min，分离上清和沉淀同时进行SDS-PAGE电泳(采用LaemimLi不连续SDS-PAGE系统，分离胶12%、浓缩胶4%)，鉴定目的蛋白的表达及表达形式。1.4重组蛋白纯化:
取100ml LB液体培养基，按照1.3中蛋白诱导表达条件进行大量诱导培养，取包涵体按照Macherey-Nagel公司Protino N1-TED Resin试剂盒说明书进行蛋白纯化,取回收蛋白样品加2xSDS凝胶加样缓冲液煮沸5 min后，进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。回收蛋白样品采用分光光度计测定蛋白质浓度。SDS-PAGE分析显示，重组蛋白在大肠杆菌BL21 (北京全式金生物技术有限公司)细胞中成功表达，以 不溶性包涵体形式存在于菌体中，蛋白分子量大小为52kDa (图1)，与预测的重组蛋白大小基本一致，镍柱回收后蛋白质样品进行SDS-PAGE，可见单一的目的条带(图2)，表明用镍柱纯化该表达蛋白效果较好。Western Blotting分析:按照1.4中方法纯化的蛋白进行SDS-PAGE,参照常规Western Blotting方法进行操作,最后采用DAB底物显示试剂(武汉博士德公司)进行显色。结果在52KDa处出现特异条带，表明表达纯化的蛋白与猪TTV2阳性血清具有很好的反应原性(图3)。2.以重组蛋白建立间接ELISA:
取纯化后的TTV2 ORFl重组蛋白做包被抗原建立间接ELISA方法，采用方阵法探索ELISA最佳蛋白包被浓度和血清稀释度，以及ELISA最佳反应条件。2.1抗原包被液的确定
分别以磷酸盐缓冲液(0.01M, ρΗ7.4，PBS)、Tris-HCl缓冲液(0.05 Μ，ρΗ8.5)、碳酸盐缓冲液(0.05 Μ，ρΗ9.6)、蒸馏水作为包被液，以最佳稀释度稀释抗原，4°C包被过夜，洗涤后以1%BSA进行封闭2h，洗涤后加入以最佳稀释度稀释的血清，作用lh，洗涤后加入1:5000稀释的酶标二抗作用lh，洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定最合适的包被液。结果显示，碳酸盐缓冲液的包被效果最好，因此用碳酸盐缓冲液作为抗原稀释液包被酶标板。2.2抗原抗体的最佳工作浓度
将纯化的pcold-ORFl重组蛋白用0.05mMpH9.6的碳酸盐缓冲液自上而下依次做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280 梯度稀释，100 μ I/ 孔，4 °C 过夜。次日取出用PBST洗涤3次，每次5min。用1%的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭，200μ1 /孔，37°C作用2h。将标准阴阳性血清作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320梯度稀释，从左至右依次加入各孔，100μ1/孔，37°C作用lh，洗涤(同上)；随后每孔加入100 μ I稀释至工作浓度(1:5000)的羊抗猪IgG-HRP (武汉博士德公司)；37°C作用Ih，洗涤(同上)；每孔加入100 μ I TMB显色液,避光室温显色10 min,最后加入100 μ I终止液终止反应,立即使用酶标仪测定其0D450值。根据0D450值和Ρ/Ν值确定抗原和抗体的最佳工作浓度。结果显示，当抗原的稀释度为1: 160，抗体的稀释度为1: 160时，阳性血清的0D450值接近于1.0，并且P/N值最大。因此，确定重组蛋白最佳包被浓度为1.65 μ g/mL,血清最佳稀释度为1:160。2.2最佳包被时间的选择
以最佳抗原浓度包被ELISA板，分成三组。第一组:37°C包被2h ;第二组:37°C孵育Ih后4°C过夜；第三组:4°C包被过夜。阴、阳性血清各做4个重复。三种不同包被条件下包被后，洗涤，以1%BSA进行封闭2h，洗涤后加入以最佳稀释度稀释的血清，作用lh，洗涤后加入
I: 5000稀释的酶标二抗作用lh，洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定最佳包被条件。结果确定最佳包被时间为4°C过夜。2.3 最佳封闭液的选择用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，分别以1%BSA、2%BSA、2%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、1%明胶、2%明胶、5%犊牛血清、10%犊牛血清作为封闭液，阴阳性血清各做2个重复。进行封闭2h，洗涤后加入以最佳稀释度稀释的血清，作用lh，洗涤后加入1:5000稀释的酶标二抗作用lh，洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定最佳封闭液。结果显示，当用2%脱脂奶粉进行封闭时，P/N值最大，封闭效果最好，因此选用2%脱脂奶粉作为最佳封闭液。 2.4封闭时间的选择用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，以2%脱脂奶粉分别封闭30min、60min、90min、120min，阴阳性血清各做4个重复。洗涤后加入以最佳稀释度稀释的血清，作用lh，洗涤后加入1:5000稀释的酶标二抗作用lh，洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定最佳封闭时间。当封闭时间为60min和90min时，P/N值较大并且相差不大，因此为了节省时间，本实验选用封闭时间60min做为最佳封闭时间。2.5最佳血清稀释液的选择
在血清稀释液中加入封闭成分，能达到减少非特异性吸附作用，为此在PBS中加入
0.5%BSA、2%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉和1%明胶，用己知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD值变化及P/N变化，并以PBS稀释血清作为对照筛选最佳一抗稀释液。结果选择含有
0.5%BSA的PBS作为最佳一抗稀释液。2.6血清最佳反应时间的确定
用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，以2%脱脂奶粉封闭60min，洗涤后，加入用1.5%BSA样品稀释液稀释至最佳浓度的血清，分别作用30min、60min、90min、120min,阴阳性血清各做4个重复。洗漆后加入1:5000稀释的酶标二抗作用lh，洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定血清最佳反应时间。当血清作用时间为60min时，P/N的值明显比较大，因此选择血清最佳作用时间为60min。2.7最适酶标二抗使用浓度的确定
用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，以2%脱脂奶粉封闭60min，洗涤后，加入用1.5%BSA样品稀释液稀释至最佳浓度的血清作用60min,洗涤后，分别加入浓度为1:2000、1:3000、1:4000、1:5000的酶标二抗，作用Ih,阴阳性血清各做2个重复。洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定酶标二抗的最佳浓度。当酶标二抗浓度为1:5000时，P/N值最大，因此本实验选用1:5000作为酶标二抗的最佳工作浓度。
2.8最适酶标二抗反应时间的确定用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，以2%脱脂奶粉封闭60min，洗涤后，加入用1.5%BSA样品稀释液稀释至最佳浓度的血清作用60min,洗漆后加入浓度为1:4000的酶标二抗,分别作用30min、60min、90min、120min,阴阳性血清各做4个重复。洗涤后加入TMB室温避光显色lOmin，通过0D450值和P/N值来确定酶标二抗最佳反应时间。当二抗作用时间为30min时，P/N值最大，因此选择30min作为酶标二抗最佳反应时间。 2.9最适底物反应时间的确定
用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至最佳浓度包被ELISA板，4°C包被过夜。次日取出洗涤后，以2%脱脂奶粉封闭60min，洗涤后，加入用1.5%BSA样品稀释液稀释至最佳浓度的血清作用60min，洗涤后加入浓度为1:4000的酶标二抗，作用30min，洗涤后加入TMB室温避光分别显色3min、5min、8min，阴阳性血清各做4个重复。通过0D450值和P/N值来确定底物最佳反应时间。当反应时间为5min时，P/N值最大，因此选择底物反应时间为5min。2.10间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
用已建立的间接ELISA方法检测阴性的猪血清，计算40份TTV阴性血清0D450的平均值(X)为0.191，标准差(SD)为0.019，按照公式:X+3SD确定间接ELISA检测方法的阴阳性临界值为0.248，即当样品的0D450值彡0.248时即为阳性，0D450值< 0.248时则为阴性。2.11间接ELISA的特异性和重复性试验
用建立的猪TTV2间接ELISA检测方法检测已知的SS2 (猪链球菌2型)(参见张雪寒、何孔旺、周俊明等.猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建[J].中国农业科学.2009.5(42): 1789-1796.)、HPS (副猪嗜血杆菌)(参见王海燕，刘茂军，冯志新等.副猪嗜血杆菌培养特性及致病性研究[J].金陵科技学院学报. 2009.4(25):80-83)、Mhp(猪肺炎支原体)(参见王占伟，刘茂军，冯志新等.渗透压对猪肺炎支原体168株的影响[J].Agricultural Science & Technology.2012.13 (10):2051-2054)、PCV2 (猪圆环病毒2型)(参见郭容利，何孔旺，钟书霖等.两株猪圆环病毒2型病毒的分离鉴定及其序列分析[J].江苏农业学报.2009.25(5): 1063-1067.)、PPV (猪细小病毒)(参见潘群兴，王永山，何孔旺等.重组表达口蹄疫病毒T细胞表位猪细小病毒病毒样颗粒的制备[J].中国预防兽医学报.2010.11(32):844-848)、PRV (猪伪狂犬病毒)(参见张雪寒，何孔旺，缪文凯等.Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒[J].江苏农业学报.2008.24(4):440-443.)、TGEV (传染性胃肠炎病毒)(参见何孔旺，林继煌，还红华等.猪传染性胃肠炎病毒致弱株STC3细胞培养特性及致病性研究[J].Chinese Journalof Veterinary Science and Technology.2001.31 (8): 8-9.)、CSFV (猪痕病毒)(参见张雪寒，何孔旺，郭容利等.检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立[J].中国预防兽医学报.2007.29(5):385-388.)、PRRSV (猪繁殖与呼吸综合征病毒)(参见李彬，毛力，何孔旺等.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC 0RF5基因的克隆及遗传变异分析[J].江苏农业学报.2011.27(4):775-781.)、FMDV (口蹄疫病毒)(参见刘耀方，何孔旺，张德坤等.利用多重RT-PCR对口蹄疫病毒分型[J].江苏农业科学.2007.5:136-139.)阳性血清，同时设立TTV2阳性、阴性对照，测定其0D450，确定是否有交叉反应。结果OD值均小于0.248，为阴性，表明该重组蛋白与上述病毒的阳性血清无交叉反应，说明该间接ELISA方法特异性强。批内重复:用同一批次制备的纯化重组抗原包被同一块ELISA板，对2份阳性血清和2份阴性血清样本进行检测，每份血清样本重复4个孔，测定0D450值，计算变异系数(CV=SD/X)，评价批内重复试验效果。结果表明，4份血清的0D450值变异系数均小于10%，表明同一样品在同一批次试验中变异程度较小，具有良好的重复性。批间重复:在不同批次制备的串联蛋白包被的酶标板中，每批随机抽取I个，检测6份TTV2抗体水平不同的血清，每份血清平行做4孔，计算检测结果的变异系数(CV=SD/X)。6份血清的0D450值变异系数均小于5%，表明同一样品在不同批次试验中变异程度较小，具有较好的重复性。结果表明批内和批间的变异系数均小于5%，表明该方法具有较好的重复性。3.间接ELISA方法的初步应用
通过建立的间接ELISA方法对2010年 2011年之间江苏和安徽两省送检的352份猪血清进行检测。江苏送检的血清共192份，其中82份检测结果为阳性，阳性率为42.7%，安徽送检的血清共160份，其中12份检测结果为阳性，阳性率为7.5%，两省送检血清的TTV2总阳 性率为26.7%。
权利要求
1.一种猪输血传播病毒2型(TTV2)抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于:试剂盒内设有抗体检测板，封闭液，样品稀释液，洗涤液，酶结合物工作液，酶底物溶液，终止液，阳性对照和阴性对照；其中抗体检测板为包被猪TTV2重组ORFl蛋白的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG多克隆抗体，阳性对照为猪TTV2标准阳性血清，阴性对照为猪标准阴性血清，包被猪TTV2重组ORFl蛋白序列如下: I DLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY 5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS 101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN 151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD 20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK 251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI 30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT 351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR 401 MKT。
2.根据权利要求1所述的一种猪TTV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于:所述的猪TTV2重组ORFl蛋白是由原核表达质粒pcoldl-ORFl表达的，原核表达质粒pcoldl-ORFl是由以下方法构建而成的: 设计一对含有酶切位点的引物:SFORF1: CCGCTTG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG Xho ISRORFl: CCCA4化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA Hindi 11利用上述特异性引物，从TTV2阳性病料中扩增ORFl基因片段，得到1227bp的扩增片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pcoldl原核表达载体进行酶切，用T4 DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pcoldl酶切产物上，构建pcoldl-ORFl载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体质粒pcoldl-ORFl构建成功。
3.根据权利要求1或2所述的ELISA试剂盒，其用于检测猪血清中猪TTV2的抗体水平的方法为: (1)包被:将权利要求1或2所述的一种猪TTV2重组ORFl蛋白纯化后用抗原包被液稀释为1.65 μ g/mL的终浓度，每个ELISA孔加入100 μ 1，4°C条件下包被过夜；弃去板中的包被液体，PBST缓冲液洗涤5minX3次，抗原包被液为0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液；PBST缓冲液为含质量比0.01%Tween-20的PBS缓冲液； (2)封闭:每孔加封闭液200μ 1，37°C条件下作用lh，PBST缓冲液洗涤5minX3次；封闭液为含质量比2%脱脂奶粉的PBS缓冲液； (3)加待检血清:每孔加入100μ I用含有质量比0.5%BSA的PBS稀释后的血清，37°C条件下作用1.0h, PBST缓冲液洗涤5minX3次； (4)加二抗:每孔加入100μ I稀释的HRP标记的羊抗猪IgG, 37°C条件下作用30 min,PBST缓冲液洗涤5minX 3次；稀释的HRP标 记的羊抗猪IgG为用pH7.0的PBS按1:5000比例稀释；(5)加显色液:每孔加含lmg/mlTMB四甲基联苯二胺的显色液100 μ 1，37°C避光作用.5 min ； (6)加终止液:每孔加入100μ I终止液，酶标仪测定450 nm吸光值0D450 ;终止液为.2M H2SO4 ； (7)结果判定:待检血清0D450值>0.248时判定为猪TTV2抗体阳性，0D450值Z 0.248判定 为阴性 。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测猪输血传播病毒2型(TTV2)抗体的间接ELISA试剂盒，属于生物技术领域。包括抗原重组蛋白的制备、间接ELISA的建立、判定标准及临床血清学检测的应用。所述的抗原重组蛋白是利用pcoldI原核表达载体，构建表达猪TTV2ORF1截短蛋白的基因工程菌pcoldI-ORF1，并将表达的重组蛋白纯化作为抗原建立了间接ELISA检测方法。该方法用于检测猪血清中TTV2的抗体水平具有重复性好、特异性高的特点，可用于猪TTV2的血清学调查，为该病的防治和流行情况的掌握提供一种快速、简便的血清学检测方法。目前该方法是国内首次利用猪TTV2ORF1重组蛋白建立检测猪群中TTV2抗体的ELISA检测方法。
文档编号G01N33/569GK103235121SQ20131008750
公开日2013年8月7日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者何孔旺, 王小敏, 张文文, 倪艳秀, 温立斌, 俞正玉, 张雪寒, 郭容利, 吕立新, 李彬, 周俊明, 茅爱华, 叶青, 汪伟, 周萍, 沈江萍 申请人:江苏省农业科学院