专利名称：小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，属于小鼠β -actin的cDNA的定量检测领域。
背景技术：
β-actin即β肌动蛋白，是actin家族的一员，在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发 挥着重要的作用。β -actin基因是应用较为广泛的管家基因之一。管家基因(house-keeping genes)是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。在进行定量PCR时，可以通过计算目的基因和管家基因的比值，得到基因表达的相对浓度。迄今为止，用于检测小鼠β -actin的cDNA序列的荧光定量PCR试剂盒均不同程度的存在特异性差、灵敏度低、检测线性范围较窄等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种能够准确的定量小鼠β -actin的cDNA序列表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，该检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测线性范围广等优点。本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的:小鼠β -actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下各组分:突光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和灭菌水二所述的特异性引物对由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物组成；所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。其中，在探针的5’端标记有荧光报告基团，所述的荧光报告基团是FAM、HEX或ROX荧光报告基团，优选为FAM荧光报告基团；在探针的3’端标记有荧光淬灭基团；所述的荧光淬灭基团可以是TAMRA、BHQl或BHQ2等荧光淬灭基团，优选为TAMRA荧光淬灭基团。其中，所述的荧光聚合酶链式反应液包括:Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs ；为了达到绝对定量的结果,所述的试剂盒中还包含有小鼠β -actin的cDNA序列阳性质粒标准品；本领域技术人员可以按照常规方法自行构建得到小鼠β -actin的cDNA序列阳性质粒标准品，例如:在PUC57质粒的Sam I酶切位点插入SEQ ID N0.4所示的基因片段，即得到小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品；也可通过商业途径购买得到小鼠β -actin的cDNA序列阳性质粒标准品。本发明试剂盒中各组分的用量可根据待检测样品的数量以及每次荧光定量PCR反应所需的用量来确定或进行相应的调整，这些都是本领域所属技术人员视检测情况或实际需要很容易就能确定的参数。作为参考，采用本发明荧光定量PCR试剂盒检测小鼠β-actin的cDNA序列的PCR反应条件和PCR反应体系如下:PCR反应体系:总体积25μ 1，上/下游引物260nmol / L，探针IOOnmol / L，5父？0 缓冲液5111，(1见1320(^11101 / L,Mg2+3mmol / L，Ex TaqHS聚合酶 1.5U，模板 1.5μ I,灭菌水16 μ I。PCR 扩增条件:94°C 3min ；94°C 30s,60°C lmin,40 个循环。本发明试剂盒需采用各种市售的荧光定量PCR仪进行分析和检测，所述的荧光定量PCR仪可以是ABI 系列荧光定量PCR仪、BIORAD iCycler、Roche4800、Qiagen Rotor Gene
坐寸ο本发明试剂盒对检测样本的要求:检测样本来源:小鼠血液和组织脏器中基因组DNA.
样本制备:(I)小鼠血液中DNA的提取，或组织脏器中DNA的提取可以按照市售DNA提取试剂盒说明书操作，也可以按照以下提供的方法操作:(2)称取约25mg左右的组织脏器，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块。加10倍体积 DNA 提取缓冲液[50mM Tris Cl (pH8.0),0.1MEDTA (pH8.0) ,0.1MNaCl],用超声勻浆仪进行匀浆。取200 μ I匀浆液于2ml的Eppendorf管中，缓慢加入20% SDS溶液，至终浓度I %，摇匀直至溶液变粘稠。再加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2-3h或过夜。并间歇搅动。或取200 μ I EDTA抗凝的全血，加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2-3h或过夜。(3)取出匀浆液，放置室温，加入50 μ 15Μ的NaCl至终浓度为1Μ。再加等体积饱和酌.抽提，以12, OOOr pm离心5min。(4)取上清加I / 2体积饱和酚，I / 2体积氯仿/异戊醇抽提一次，以12，OOOrpm离心5min。(5)取上清,加等体积氯仿/异戍醇抽提一次，12，OOOrpm离心5min。(6)加I / 10体积3M NaAcJ^ 2倍体积无水乙醇充分混匀，出现絮状沉淀，把液体连同沉淀一快转移到吸附柱中，12，OOOrpm离心5min，弃废液。(7)加 1111170% 乙醇漂洗，以 12，OOOrpm 离心 5min。(8)室温放置干燥吸附柱后，加100 μ ITE溶解(60°C _70°C预热)，室温放置IOmin后 12，OOOrpm 离心 30sec。-20°C|C存备用。采用本发明试剂盒对检测样品进行定量分析的方法可参考以下步骤:1、质粒标准品浓度计算:当OD26tl=I时，相当于双链的DNA浓度为50ng / μ 1，然后根据计算公式:DNA浓度(ng / μ I) =50XOD260 X稀释倍数,计算质粒标准品浓度。2、待测样品定量:在每次测定中，用质粒标准品作标准曲线，待测样本中所得Ct值对应标准曲线中的拷贝数，即为所测拷贝数。本发明设计了针对小鼠β-actin的cDNA序列的特异性引物和探针，构建了实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强，灵敏度高，重复性好，检测线性范围广等特点，可以对小鼠β-actin基因进 行准确定量，由于β-actin基因在所有细胞中均相对稳定的表达，从而为定量目的基因提供参照。
图lpUC57质粒图谱及酶切位点。图2采用本发明特异性引物扩增质粒标准品扩增产物的熔解曲线图；图中横坐标为温度(Temperature°C ),纵坐标为校正后的突光值(Derivative)。图3其它引物扩增质粒标准品扩增产物的熔解曲线图。A、B分别是mixl、mix2的熔解曲线图，图中横坐标为温度(Temperature。C)，纵坐标为校正后的荧光值(Derivative)。图4本发明荧光定量PCR试剂盒的特异性实验结果。图5本发明荧光定量PCR试剂盒的定量限和灵敏度检测结果；a，b，c, d，e, f，g分别是XlO7, XlO6, XlO5, XlO4, XlO3, XlO2, XlO1的质粒标准品系列稀释浓度。图6引物浓度优化实验结果。图7探针浓度优化实验结 果。图8Ex Taq HS聚合酶浓度优化实验结果。图9Mg2+浓度优化实验结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1质粒标准品的构建及鉴定1.1质粒标准品构建在pUC57质粒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)的Sam I酶切位点插入了长126bp的包含有上下游引物片段的基因片段(5’CCGATGCCCTGAGGCTCTTTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTACATTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTMAGACCTCTATGCCAACAC3’，SEQ ID N0.4)。成功构建了质粒标准品，pUC57质粒的示意图见图1o1.2测序鉴定对质粒pUC57进行酶切，对酶切产物进行序列测定，成功构建质粒标准品。实施例2特异性引物和探针的设计及制备2.1特异性引物和探针的设计从NCBI基因库中以Blast方式查获β-actin的cDNA序列(GeneID: 218370)，依此为模板经过筛选获得了一对特异性引物和一条探针:上游引物(FP):5，CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3，(SEQ ID N0.1)，下游引物(RP):5，TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3’ (SEQ ID N0.2)，探针:5，TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC3’(SEQ ID N0.3)。探针5’端报告基团用FAM标记，3’端淬灭基团用TAMRA标记；扩增产物长度为109bp。引物和探针均配制成100 μ mol / L贮存液，使用前用灭菌注射用水10倍稀释。2.2特异引物对(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2)对质粒标准品的特异性鉴定SYBR Green I熔解曲线结果见图2。结果显示，引物对质粒标准品(plasmid)有单一的产物峰，没有出现双峰或峰的异常增宽，无模板对照(NTC)及无关病毒HSV(virustemplate)没有出现非特异性扩增峰，甚至在75°C左右也没有出现明显的引物二聚体峰，显示SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2组成的引物对的特异性很好。2.3其它引物和探针的特异性鉴定本发明针对β -actin的cDNA序列设计了另外2对上下游引物和探针序列，具体序列见表I。表I针对β -actin的cDNA序列设计的2对引物和探针序列
权利要求
1.小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分:荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针，灭菌水。
2.按照权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述特异性引物对由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。
3.按照权利要求2所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:在探针的5'端标记有荧光报告基团；在探针的3'端标记有荧光淬灭基团。
4.按照权利要求3所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团包括FAM、HEX或ROX荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或BHQ2荧光淬灭基团。
5.按照权利要求4所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团是FAM荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团是TAMRA荧光淬灭基团。
6.按照权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光聚合酶链式反应液包括:Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs。
7.按照权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:含有小鼠β-actin的cDNA序列阳性质粒标准品；所述小鼠β -actin的cDNA序列阳性质粒标准品通过下述方法制备得到:在PUC57质粒的Sam I酶切位点插入SEQ ID N0.4所示的基因片段，即得。
8.权利要求1.7任何一项所述的荧光定量PCR检测试剂盒在检测或定量小鼠β -actin的cDNA序列表达量的用途。
9.权利要求1-7任何一项所述的荧光定量PCR检测试剂盒在检测或定量目的基因表达量的用途。
10.按照权利要求8或9所述的用途，其特征在于，包括:⑴建立PCR反应体系；(2)进行PCR扩增；(3)进行定性或定量分析；其中步骤(I)中所述的PCR反应体系为:总体积25rtl，上/下游引物260nmol / L，探针IOOnmol / L，5XPCR缓冲液5 μ 1，dNTP200 μ mo I / L, Mg2+3mmol / L, Ex Taq HS 聚合酶 1.5U,模板 1.5 μ I,灭菌水 16 μ I ;所述上/下游引物的序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，探针序列为SEQ ID N0.3所示。
全文摘要
本发明公开了小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒。所述试剂盒包括以下各组分荧光聚合酶链式反应液，特异性引物对，荧光标记的探针和灭菌水。所述特异性引物对由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。本发明针对小鼠β-actin的cDNA序列筛选得到特异性引物对和荧光标记的探针，建立了小鼠β-actin的cDNA序列的荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测线性范围广等优点，能够对小鼠β-actin基因进行准确定量，可以为目的基因的表达量的定量提供参照。
文档编号G01N21/64GK103173553SQ20131009257
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者李波, 苗玉发, 霍艳, 周晓冰, 耿兴超, 王三龙 申请人:中国食品药品检定研究院