专利名称：一种菜用大豆鲜籽粒品质<sup>1</sup>H NMR评价方法
技术领域：
本发明涉及一种菜用大豆鲜籽粒品质1HNMR评价方法。
背景技术：
菜用大豆(Glycine max L.)俗称毛豆，是指在鼓粒期至完熟初期收获鲜荚食用的专用型大豆品种，其营养丰富，富含蛋白质、维生素、矿物质等多种营养元素，作为蔬菜食用，味道鲜美，深受广大消费者的喜爱。研究表明，不同品种菜用大豆品质差异显著，因此深入研究不同菜用大豆品种品质特性，系统研究不同品种的化学成分(代谢物)差异，这对于阐释菜用大豆营养差异及其合理利用都具有十分重要的意义。目前，菜用大豆的质量控制及评价，主要是运用现代分析技术(如HPLC、UPLC、HPLC-ES1-MS,CE-ES1-T0F-MS等)或某个营养成分为指标进行含量测定或DNA指纹图谱研究。然而，这些分析方法主要强调与营养、食味品质密切相关的少数内含物成分的重要性，而忽略了菜用大豆中其他小分子物质的影响；DNA指纹图谱主要用于菜用大豆品种/系和纯度的鉴定，却不直接能反映物质代谢差异。基于1H-NMR的代谢组学从代谢物的组成上能够区分像引起甜、鲜、酸等口味的化合物成分，应用1H-NMR能同时检测分析初生和次生代谢组分，因此更能体现方法的整体性和系统性，在果蔬品质评价中逐渐发挥着重要的作用，但是利用代谢组学整体性的方法研究菜用大豆品质目前还没有相关报道。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种菜用大豆鲜籽粒品质1HNMR评价方法，通过高频核磁共振的代谢物组学技术，建立菜用大豆鲜籽粒的整体代谢指纹图谱，并结合化学计量学方法，系统评价不同品种品质差异，为菜用大豆质量控制与评价、品种鉴别等提供理论依据。技术方案本发明所提供的一种菜用大豆鲜籽粒品质1HNMR评价方法，包括如下步骤:I)原料收集:采摘R6-R7期菜用大豆鲜籽粒，快速置于_80°C深冷冰箱低温冷冻2h 4h，经真空冷冻干燥24h 48h、低温液氮粉碎后，过0.25mm孔径筛处理作为供试原料。2)样本制备:a.准确称取200mg 500mg粉碎样品加入体积比50%的甲醇溶液1000 μ L，进行冰水浴超声提取3s 5s，间歇4s，循环3次；b.浸提液经4°C、13000rpm高速离心IOmin 15min后,取上清液用氮气吹干,然后置于-80°C深冷冰箱冰冻12h ；c.将冰冻样品离心抽真空后，加入450 μ LpH7.29的0.lmol/L磷酸缓冲溶液，再加入50 μ L的5mmol/L DSS重水标准溶液，涡旋IOs ；d.所得混匀液经低温离心后，取上清液过0.22 μ m滤膜，滤液供核磁共振波谱分析。3) 1HNMR测定条件:观察频率:600.13MHz ;频率内锁:D20 ;测定温度T:279.93K ;谱宽sw:12019.23Hz ;采样时间at:4.0s ;脉冲延迟时间dl:1.0s ;采样次数nt:32 ;脉冲宽度pw:10 μ s ;脉冲序列=1H-NOESY ;混合时间mixT:0.1s。每次样本米集时间约为4min。4) 1HNMR信号归属及代谢物鉴定:将测得的1H-NMR自由感应衰减信号导入ChenomxNMR suit软件进行傅立叶转换，并输入DSS的浓度以及每个样本的pH值等信息。手动调整相位和基线，以DSS峰(0.0Oppm)为基准校正谱图的化学位移，并进行反转卷积调整谱图峰形，数据积分后利用Chenomx数据库比对分析，获得代谢物种类及相应浓度。5)基于化学计量学方法的代谢组分比较与分析:使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行菜用大豆物质组成区分。6)根据步骤4)图谱库检索的结果，挑选出70%以上样品共有峰，建立1HNMR指纹图谱共有峰数据库，对菜用大豆核磁共振图谱共有峰数据库进行聚类分析，判定菜用大豆品质类别。本发明方法涉及在菜用大豆品质分类、质量区别及品质评价中的应用。有益效果I)与现有技术比较，本发明采用高通量、高分辨率的1HNMR代谢组学技术，利用不同品种菜用大豆化学组成差异对菜用大豆品质进行评价。该方法表明，不同品种菜用大豆鲜籽粒初级与次级代谢产物组成与含量都有显著的差异。特别是采用本发明方法可进行育种、新品种筛选及品质评价，建立菜用大豆的核磁共振指纹图谱数据库。本发明方法具有系统、准确、可靠、高效的特点，结合代谢组学技术对于完善目前的菜用大豆品质评价技术体系具有重要意义。2)本发明方法从根本上解决了依靠人为感官评定与主要化学成分分析所带来的问题:人为感官评定工作量大，且结果受许多环境因紊、人的心理因素等制约，有很大的主观性和随机性，以及化学分析虽是菜用大豆品质评价的基本方法，但是化学分析的指标有限，菜用大豆作为特色蔬菜佳品，成分十分复杂，单纯的某些化学组分并不足以反映菜用大豆的内在品质，在应用中有严重的局限性。3)本发明提供的菜用大豆鲜籽粒品质1HNMR评价方法，是一种对成分复杂样品也能进行很好的分析的手段，它的整体性和模糊性，既能反映样本的整体信息，且工作量并不大。更为重要的是它能达到区分不同品种，甚至不同产地、不同采收期的菜用大豆。因此，如果采用科学的方法对菜用大豆指纹图谱进行表征，就可以实现对菜用大豆品质的科学分类。
图1为菜用大 豆鲜籽粒的核磁共振氢谱图。
图2为不同品种菜用大豆代谢体系差异分析。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不因此而限制本发明。
实施例I)原料采集:2012年7月于江苏省农科院六合动物科学基地试验田采摘鼓粒末期(R6-R7期)八个不同品种菜用大豆(表I)，取其鲜籽粒快速置于_80°C深冷冰箱低温冷冻2h，真空冷冻干燥24h，并进行低温粉碎、过0.25mm孔径筛处理，获得原料样本备用。表I参试材料
权利要求
1.一种菜用大豆鲜籽粒品质1H NMR评价方法，其特征在于包括如下步骤: 1)原料采集:采摘R6-R7期菜用大豆鲜籽粒，快速置于-80°C深冷冰箱低温冷冻2h 4h，经真空冷冻干燥24h 48h、低温液氮粉碎后，过0.25mm孔径筛处理作为供试原料。
2)样本制备: a.准确称取200mg 500mg粉碎样品加入体积比50%的甲醇溶液1000μ L，进行冰水浴超声提取3s 5s，间歇4s，循环3次； b.浸提液经4°C、13000rpm高速离心IOmin I5min后,取上清液用氮气吹干,然后置于-80°C深冷冰箱冰冻12h ； c.将冰冻样品离心抽真空后，加入450μ L ρΗ7.29的0.lmol/L磷酸缓冲溶液，再加入50 μ L的5mmol/L DSS重水标准溶液，涡旋IOs ； d.所得混匀液经低温离心后，取上清液过0.22 μ m滤膜，滤液供核磁共振波谱分析。
3) NMR测定条件:观察频率:600.13MHz ;频率内锁=D2O ;测定温度T:279.93K ;谱宽sw:12019.23Hz ;采样时间at:4.0s ;脉冲延迟时间dl:1.0s ;采样次数nt:32 ;脉冲宽度pw:10 μ s ;脉冲序列^H-NOESY ;混合时间mixT:0.1s。每次样本采集时间4mmin。
4) NMR信号归属及代谢物鉴定:将测得的1H-NMR自由感应衰减信号导入ChenomxNMR suit软件进行傅立叶转换，并输入DSS的浓度以及每个样本的pH值等信息。手动调整相位和基线，以DSS峰(0.0Oppm)为基准校正谱图的化学位移，并进行反转卷积调整谱图峰形，数据积分后利用Chenomx数据库比对分析，获得代谢物种类及相应浓度。
5)基于化学计量学方法的代谢组·分比较与分析:使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行菜用大豆物质组成区分。
6)根据步骤4)图谱库检索的结果，挑选出70%以上样品共有峰，建立1HNMR指纹图谱共有峰数据库，对菜用大豆核磁共振图谱共有峰数据库进行聚类分析，判定菜用大豆品质类别。
2.一种如权利要求1所述的方法在菜用大豆品质分类、质量区别及品质评价中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种菜用大豆鲜籽粒品质1H NMR评价方法，属于果蔬品质分析领域。它首先对不同品种、不同品质的菜用大豆样品进行低温液氮粉碎、50％甲醇超声快速浸提，然后在相同的参数条件下对样品提取液进行核磁共振信号采集，对采集得到的图谱进行反转卷积，通过Chenomx数据库匹配与DSS内标定量，确定可溶性糖、游离氨基酸、有机酸等系列代谢物的组成及含量，从而明确不同菜用大豆品种的特征，并根据相应的核磁共振氢谱指纹图谱数据库，进行模式识别多变量分析，以获取有效的品质区分与评价结果。本发明方法具有全面、准确、可靠、高效等优点。
文档编号G01N24/08GK103245685SQ20131010087
公开日2013年8月14日 申请日期2013年3月27日 优先权日2013年3月27日
发明者宋江峰, 吴海虹, 李大婧, 刘春泉, 姜晓青 申请人:江苏省农业科学院